本發(fā)明屬于飼養(yǎng)業(yè)的工藝技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種低溫保存豬精液的抗氧化稀釋液制備方法。
背景技術(shù)：
精液保存是豬人工授精技術(shù)的關(guān)鍵，它既可以延長精子的貯存時間，又便于長途運(yùn)輸，同時擴(kuò)大了精液的使用范圍，提高公豬的配種效能，加快豬群品種改良。豬精液低溫保存技術(shù)在運(yùn)輸和操作上，相對冷凍保存而言簡便、經(jīng)濟(jì)，而保存時間比常溫保存長、成本低。目前低溫保存研究還停留在稀釋液的篩選階段。
冷凍保護(hù)是影響豬凍精質(zhì)量的重要因素，自從人們發(fā)現(xiàn)甘油的冷凍保護(hù)特性后，迅速促進(jìn)了家畜冷凍精液的發(fā)展，但是，甘油作為一種滲透性冷凍保護(hù)劑，能都滲入精子細(xì)胞的內(nèi)部，濃縮或結(jié)合細(xì)胞內(nèi)水分，降低溶液中鹽的濃度和稀釋液的滲透壓，一方面對精子有保護(hù)作用，另一方面又對精子有一定的毒害作用，部分精子經(jīng)脫水后冷凍效果較好，但結(jié)凍后卻無運(yùn)動力和受精能力。與牛精子不同的是，豬精子對低溫打擊極端敏感，而低溫打擊的主要危害是降低精子活力，增強(qiáng)精子膜的離子通透性，導(dǎo)致精子膜受到損傷和精細(xì)胞脂類物質(zhì)的流失，而鏡子膜的完整性對于精子的受精能力至關(guān)重要，近年來人們致力于研究非滲透性冷凍保護(hù)劑，并結(jié)合先稀釋液中添加其他成分以改善凍后精子質(zhì)量。
弱酸環(huán)境被認(rèn)為是精液保存的理想環(huán)境，但超出一定的酸性范圍，容易引起精子死亡。豬精子的等滲滲透壓為290～300mosm，可耐受的滲透壓為240～380mosm，等滲或稍微高滲的環(huán)境比低滲的環(huán)境更利于保護(hù)精子。可能與稀釋液中添加緩沖劑碳酸氫鈉和檸檬酸三鈉有關(guān)，它們可以維持精液ph的動態(tài)平衡，雖然成分只有葡萄糖和蔗糖，但二者即作為營養(yǎng)成分滿足了精子的能量需要，又維持了滲透壓，其中蔗糖在低溫條件下還能保護(hù)精子的活力和頂體完整率。對于豬精子而言，弱酸和略高的滲透壓更利于其4℃低溫保存，人工采取的精液易受微生物的污染，而青霉素和鏈霉素作為稀釋液中的抗菌劑，被廣泛應(yīng)用于常溫保存稀釋液中抑制微生物的生長繁殖，但二者對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌效果較差。有試驗(yàn)證明慶大霉素對多種革蘭氏陰性菌有殺滅作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
一種低溫保存豬精液的抗氧化稀釋液制備方法，
豬精子與牛精子低溫保存的效果不同，在豬精子的低溫儲存過程中，由于冷凍和解凍的過程發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)降低了精子的質(zhì)量，并導(dǎo)致40~50%的精子失去活力，最主要原因是由于這一過程中精子與外界相互接觸，致使精子中的活性氧增加，引起精子膜的流動性改變，線粒體和dna損傷，降低了精液的品質(zhì)。但是低溫保存精液，低溫可以減緩精子的運(yùn)動，從而降低自身能量的損耗和新陳代謝，有效延長了精子的保存時間。
發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)低溫儲存豬精液，同時解決以上出現(xiàn)的冷凍—解凍過程中過多活性氧出現(xiàn)導(dǎo)致的精子損傷率提高的問題，發(fā)明一種低溫保存豬精液的稀釋液，具體是通過以下的方法實(shí)現(xiàn)的：
（1）利用酵母的破碎提取液作為基礎(chǔ)稀釋液，后期添加其他活性成分，酵母提取液在提取的過程中從細(xì)胞溶出的物質(zhì)包括：蛋白質(zhì)、低分子肽、氨基酸、核酸降解物、微量元素和b族維生素等各種活性成分，都提供給精子相當(dāng)完美的模擬生物細(xì)胞生存環(huán)境，各項(xiàng)活性成分的配比恰到好處，且成分全面，相對于人工配比的精液稀釋液，添加的活性物質(zhì)太多，量的方面不好拿捏，稍有不平衡就有導(dǎo)致稀釋液滲透壓的不穩(wěn)定，導(dǎo)致精子因滲透壓及其它方面的問題而死亡。
不僅如此，酵母細(xì)胞還富含豐富的海藻糖，海藻糖不同于蔗糖或是乳糖，它可以在生物活性細(xì)胞脫水的情況下，在細(xì)胞膜外形成一層保護(hù)膜，這一點(diǎn)可以在冷凍的過程中發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，防止豬精子在降溫過程中受到的低溫打擊。
首先采用的是啤酒酵母泥作為酵母菌的來源，廢酵母泥是啤酒生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，每年都會造成大量的浪費(fèi)，這里經(jīng)過3~5次的水洗，然后離心得到含有酵母菌細(xì)胞的酵母菌液，其啤酒酵母的有效活菌數(shù)不少于1.0×106cfu/ml。
通過微波輻射的作用破碎酵母細(xì)胞，微波功率為600~800w的電磁作用環(huán)境下2~5min，微波是通過波場中介質(zhì)的擺動摩擦作用產(chǎn)生能量，具有很好的選擇性、瞬時性和高效性，細(xì)胞內(nèi)不同位置的物質(zhì)，對于微波的吸收能力存在差異，從而導(dǎo)致為波場中的細(xì)胞局部受熱，細(xì)胞在一定的強(qiáng)度下出現(xiàn)缺口而破碎，起到充分裂解酵母細(xì)胞的功能。
不僅如此，發(fā)明既然選擇微波的破碎細(xì)胞方式，同時加入一定量的葡萄籽粉，利用微波的輻射作用和添加的一定量乙醇溶劑，可以在一定程度上提取葡萄籽中含有的原花青素，原花青素是一種新型高效抗氧化劑，屬于一類有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，溶于水和大多數(shù)的有機(jī)溶劑，已有文獻(xiàn)證明在豬精液的冷凍保護(hù)方面，其抗氧化性能使維生素e的50倍，維生素c的20倍，是一種高效清除自由基的細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)，同時參與磷酸、花生四烯酸的代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，保護(hù)脂質(zhì)不發(fā)生過氧化損傷。
將葡萄籽研磨過80~120目篩的微粉，待前述酵母細(xì)胞破碎稀釋液冷卻后添加至混合其中，然后加入有機(jī)溶劑乙醇，控制乙醇濃度50~70%，將微波輻射的功率調(diào)整為250~400w，作用30~50min，屬于提取過程，在微波輻射的環(huán)境下，有機(jī)溶劑可以同時實(shí)現(xiàn)對酵母細(xì)胞中活性成分的提取，其中包括海藻糖，同時可以提取葡萄籽粉中的原花青素。
這里很好的控制了微波的輻射功率，即利用高功率的輻射先殺死并破碎酵母細(xì)胞，同時高輻射帶來高溫，不利于后期長時間的萃取過程，在萃取的過程中合理的控制微波功率使稀釋液的溫度始終在60~80℃，比較符合提取的溫度，同時葡萄籽粉與酵母破碎稀釋液的料液比控制在1:15~20的時候，原花青素的的提取量達(dá)到最高。
完成后的稀釋液含有提取后的酵母細(xì)胞和葡萄籽粉殘余物，這類不規(guī)則大顆粒物質(zhì)，會對精子細(xì)胞膜造成機(jī)械性損傷；同時，大顆粒物質(zhì)使得精液稀釋后變得渾濁，加上精子會游向大顆粒物質(zhì)并附著在其邊緣，嚴(yán)重影響后期受精，所以發(fā)明選擇加入一定量的生物絮凝劑羧甲基纖維素鈉，濃度為15~20g/l，于恒溫水浴中保溫20min后再進(jìn)行離心處理，取上清液，通過減壓蒸餾回收乙醇，真空度0.08mpa的條件下，升溫至60~70℃沸騰回流回收乙醇并濃縮提取液。
適量的加入羧甲基纖維素鈉還有一個好處，在于可以增加溶液一定的粘稠度，提高稀釋液的發(fā)散程度，使精子均勻的懸浮在稀釋液中，可以提高稀釋液對精子的保護(hù)作用，有利于精子活率、活力的維持，同時明顯提高精子脂膜完成率和頂體完整率，原理是粘稠的稀釋液可以降低精子的運(yùn)動能力，減少不必要的能量消耗。
最后添加輔料，攪均勻即可，輔料占上述提取稀釋液的10~20%，由以下重量百分比的原料制成：青霉素5~10%、乙二胺四乙酸鈉10~15%、卵黃4~12%、葡萄糖30~60%、檸檬酸10~25%、谷氨酸5~15%、半胱氨酸6~18%。
本發(fā)明的有益效果：通過從廢棄的啤酒酵母泥中提取酵母，破碎酵母，利用酵母提取液作為底液，添加其他活性成分，制成的一種豬精液低溫儲存的稀釋液，同時控釋微波的功率和添加乙醇的濃度，不僅提取到了一定的酵母海藻糖，還成功的從加入的葡萄籽粉中提取到了一定量的原花青素，證明都是很好的冷凍精液稀釋液中非常好的抗氧化物質(zhì)，有效冷凍稀釋液的豬精液保存效果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：
（1）首先采用的是啤酒酵母泥作為酵母菌的來源，經(jīng)過3~5次的水洗，然后離心得到含有酵母菌細(xì)胞的酵母菌液，其啤酒酵母的有效活菌數(shù)不少于1.0×106cfu/ml。
（2）通過微波輻射的作用破碎酵母細(xì)胞，微波功率為700w的電磁作用環(huán)境下4min，將葡萄籽研磨過100目篩的微粉，待前述酵母細(xì)胞破碎稀釋液冷卻后添加至混合其中，然后加入有機(jī)溶劑乙醇，控制乙醇濃度55%，將微波輻射的功率調(diào)整為300w，作用45min，屬于提取過程。
（3）將（2）所述的提取液加入一定量的生物絮凝劑羧甲基纖維素鈉，控制稀釋液濃度為15~20g/l，于恒溫水浴中保溫20min后再進(jìn)行離心處理，取上清液，通過減壓蒸餾回收乙醇，真空度0.08mpa的條件下，升溫至60~70℃沸騰回流回收乙醇并濃縮提取液。
（4）最后添加輔料，攪均勻即可，輔料占上述提取稀釋液的10~20%，由以下重量百分比的原料制成：青霉素10%、乙二胺四乙酸鈉10%、卵黃8%、葡萄糖40%、檸檬酸15%、谷氨酸5%、半胱氨酸12%。