本發(fā)明涉及干細胞低溫冷凍保存，尤其是涉及一種包含rhmg53的人臍帶間充質干細胞低溫保護劑。

背景技術：

人臍帶間充質干細胞（huc-mscs）具有獲取簡單和易于培養(yǎng)等優(yōu)點，作為候選的細胞治療產品要優(yōu)于胚胎干細胞或誘導多能干細胞。無論是基礎研究還是臨床應用（如廣泛的退行性疾病和自身免疫疾病等），都需要間充質干細胞具有穩(wěn)定的功能和充足的供應量。而細胞的低溫冷凍保存優(yōu)勢明顯且技術成熟，是目前最常用的細胞存儲方式。

在低溫冷凍過程中，細胞內外環(huán)境中冰晶的形成會導致細胞膜的破損，從而造成細胞死亡。這一過程是決定細胞凍存能否成功的關鍵，而添加合適的低溫保護劑是解決冷凍和解凍過程中造成細胞膜損傷的最有效的方式。

傳統(tǒng)的細胞凍存液配方主要成分為dmso，但dmso具有細胞毒性，特別是胚胎干細胞的凍存復蘇率受處理過程及凍存保護劑的影響較大，由于處理方式不同，其凍存復蘇率從0.4-5%不等，而干細胞多能性特異標志物oct4在細胞復蘇后則會出現(xiàn)不同程度的缺失。神經干細胞、胚胎干細胞、腫瘤干細胞等需懸浮培養(yǎng)的干細胞則易造成凍存后部分干細胞特異活性標志物的弱化甚至缺失。近期研究發(fā)現(xiàn)，將誘導多能干細胞（ipsc）凍存在10%的dmso中，會導致解凍后多能性的標志物oct4的表達幾乎完全喪失。胎牛血清（fbs）能為細胞凍存過程中提供蛋白質、脂肪和膽固醇等，且能提高凍存效果，作為補充或用于冷凍保存的基礎培養(yǎng)基已被廣泛使用，但由于其潛在的生物安全性和對受體傳播病原體等問題，使用量也不宜過高。此外，海藻糖（trehalose）是一種天然存在的非還原性二糖，作為非滲透性的低溫保護劑，其生物安全性較高，但由于是大分子物質，不能穿透細胞膜，不能有效防止細胞內冰晶的形成，凍存后細胞存活率一般較低?，F(xiàn)階段，國內間充質干細胞凍存保護劑還未有標準化的配方，復蘇后的效果也難以控制，國外進口干細胞相關凍存試劑價格昂貴，無法大規(guī)模推廣于科研應用。因此亟待研發(fā)一種具有我國自主產權的高效凍存試劑，亟待開發(fā)出標準化的干細胞凍存模式。

mg53蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的肌肉特異性表達的tripartitemotiffamily(trim)蛋白，該家族蛋白常含三個特定模序結構，分別被稱為ring指，b-box和卷曲結構域，它們共同作用結合在細胞特定蛋白上，進行泛素化降解，是一種重要的細胞膜修復機制。雖然天然的mg53蛋白主要局限于骨骼肌和心肌組織，但新近發(fā)現(xiàn)其在多種非肌肉細胞中過表達mg53也具有降低細胞損傷，減少凋亡發(fā)生的作用?；蛑亟M的人源mg53蛋白（rhmg53）能定位于損傷部位，對機械外力、化學物質或紫外線等造成的肌肉和非肌肉細胞的損傷，都表現(xiàn)出劑量依賴性的保護作用，生物安全性好。然而，有關mg53在干細胞凍存損傷中的修復作用尚未見研究報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對干細胞低溫冷凍保存過程中造成的膜損傷和低存活率等問題，提供一種包含rhmg53的人臍帶間充質干細胞低溫保護劑，該低溫保護劑中的rhmg53具有修復膜損傷的功效，可對凍存復蘇過程中的膜損傷發(fā)揮保護和修復的作用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術方案：

本發(fā)明所述的包含rhmg53的人臍帶間充質干細胞低溫保護劑，所述保護劑由dmem/f12培養(yǎng)基、fbs、dmso和rhmg53配制而成，首先將所述dmem/f12培養(yǎng)基、fbs和dmso按體積比5:4:1配制成混合液；然后在該混合液中按30μg/ml之比例添加rhmg53，混合均勻后即得到人臍帶間充質干細胞低溫保護劑成品，即huc-mscs低溫保護劑。

本發(fā)明配制的huc-mscs低溫保護液中主要成分的特征為：

1）rhmg53：由于mitsugumin53（mg53）蛋白是一種骨骼肌和心肌特異表達的tripartitemotif（trim）家族蛋白，該家族蛋白常含三個特定結構：ring指，b-box和卷曲結構域，它們共同作用結合在細胞特定蛋白上，進行泛素化降解，是一種重要的細胞膜修復機制。

2）dmso（dimethylsulfoxide，二甲基亞砜）：具有高極性、高沸點、熱穩(wěn)定性好、與水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇等大多數(shù)有機物，被譽為“萬能溶劑”。

3）dmem/f12培養(yǎng)基（dulbecco'smodifiedeaglemedium/f12）：是huc-mscs的基礎培養(yǎng)基，為干細胞的凍存提供等滲的電解質。

4）fbs（fatalbovineserum，胎牛血清）：能為細胞凍存過程中提供蛋白質、脂肪和膽固醇等，可提高細胞的凍存效果。

與現(xiàn)有的間充質干細胞凍存保護劑相比，本發(fā)明配制的保護劑成份明確，穩(wěn)定性好，安全性高。用于凍存huc-mscs時，不影響其核型和干性，且能促進干細胞的增殖、提高其存活率和成脂、成骨、成神經分化效率。采用本發(fā)明配制的保護劑在凍存過程中均采用程序化慢速冷凍法對細胞進行冷凍保存，操作簡單，保存方便且成本減低。試驗證明，采用本發(fā)明保存的細胞移植治療tbi小鼠，能發(fā)揮較好的治療效果，為huc-mscs的臨床應用提供了可靠的保證。

附圖說明

圖1是huc-mscs表面抗原鑒定的流式圖。

圖2是rhmg53作用于huc-mscs的最適濃度和最優(yōu)凍存方式。

圖3是本發(fā)明保護劑對復蘇后huc-mscs干性基因的表達情況。

圖4是不同凍存方案對復蘇后huc-mscs的核型變化的影響。

圖5是本發(fā)明保護劑對huc-mscs存活率的影響。

圖6是不同凍存方案對復蘇后huc-mscs的成脂分化的影響。

圖7是不同凍存方案對復蘇后huc-mscs的成骨分化的影響。

圖8是不同凍存方案對復蘇后huc-mscs的成神經分化的影響。

圖9是采用本發(fā)明凍存保護液低溫保存復蘇后的huc-mscs對tbi模型小鼠體重和mnss得分的影響。

圖10是采用本發(fā)明凍存保護液低溫保存復蘇后的huc-mscs對tbi模型小鼠抑郁情況和認知功能恢復情況的影響。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明做更加詳細的說明。

本實施例采用的凍存方法為程序化慢速冷凍法，實驗方法中，若無特別說明，均為常規(guī)方法。實驗所用器具、儀器、試劑均可通過商業(yè)途徑獲得。

一、配制本發(fā)明所述的包含rhmg53的人臍帶間充質干細胞低溫保護劑：該保護劑中包含dmem/f12培養(yǎng)基（hyclone,貨號：sh30023.01b）、fbs（gibco，貨號：10270106）、dmso（amresco，貨號0231）和rhmg53（novoprotein，貨號：mg53-a-5，由美國俄亥俄州立大學麻建杰教授提供）四種組分；

首先將dmem/f12培養(yǎng)基、fbs和dmso按體積比5:4:1配制成混合液（稱為凍存液a）；然后在該混合液中按30μg/ml之比例添加rhmg53，混合均勻后即得到huc-mscs低溫保護劑（稱為凍存液b）；也就是說，在1ml本發(fā)明配制的低溫保護劑成品（b液）中，含0.5mldmem/f12培養(yǎng)基、0.4mlfbs、0.1mldmso和30μgrhmg53。

二、采用上述配制的a液和b液凍存人臍帶間充質干細胞，步驟如下：

1、huc-msc的分離、培養(yǎng)和鑒定

臍帶的獲?。簩嶒炇业哪殠吮緩泥嵵荽髮W第一附屬醫(yī)院獲取，且臍帶均在無菌條件下取自于健康的剖宮產新生兒，家屬知情并同意。

沃頓膠組織的剝離與培養(yǎng)：在超凈工作臺中，取出新鮮的臍帶標本，放置于無菌的培養(yǎng)皿中，用預冷的pbs緩沖液將臍帶組織沖洗干凈，使用提前準備好的無菌皮鉗、剪刀和鑷子剝離組織塊外膜，剔除2根動脈和1根靜脈血管，獲取沃頓膠組織；將沃頓膠組織用pbs緩沖液清洗干凈后，用無菌剪刀將其剪碎并均勻涂布于25cm²培養(yǎng)瓶瓶底（密度約為0.2g/瓶），靜置5min，待組織塊完全粘附于瓶底時，向培養(yǎng)瓶中加入3ml干細胞完全培養(yǎng)基。然后，將細胞培養(yǎng)瓶轉移至co2細胞培養(yǎng)箱（37℃、5％co2濃度）中培養(yǎng)。

huc-mscs的原代和傳代培養(yǎng)：組織塊培養(yǎng)4d后，觀察組織塊貼壁情況，如果貼壁較牢，則更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，否則等1周后再更換新鮮培養(yǎng)基。經過10d左右的組織塊培養(yǎng)，通過顯微鏡觀察到呈長梭狀的貼壁細胞從組織塊中“爬”出，此時的細胞為原代細胞，隨后每2~3d更換一次培養(yǎng)基。組織塊培養(yǎng)2周左右時，在顯微鏡下可觀察到干細胞在瓶底的密度已經較高（80~90％），此時，用一次性無菌吸管將培養(yǎng)瓶中的組織塊移除，pbs緩慢清洗培養(yǎng)瓶底部；然后，加入1ml胰蛋白酶，在37℃條件下消化2~3min，顯微鏡下觀察細胞回縮變圓后加入等體積的fbs終止消化；隨后，用移液槍將細胞懸液在瓶底緩慢吹打幾次，待貼壁細胞完全散落在懸浮液中，將懸浮液移入15ml離心管，1000g離心5min后去上清；將沉淀的細胞用2ml完全培養(yǎng)基重懸，分裝到2個培養(yǎng)瓶中，補充完全培養(yǎng)基至5ml于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時的細胞標記為p1代。

huc-mscs的凍存：將p1代的細胞，傳代培養(yǎng)為p2代細胞后，待細胞融合度達到90％左右時，胰蛋白酶消化離心并收集細胞，將細胞均分成2組，分別加入凍存液a和b，重浮并調整細胞密度為1×10⁶個/ml，分裝到2ml凍存管中，每管加1ml細胞懸液，做好標記并貼上封口膜，放入提前置于4℃的細胞凍存盒中，將凍存盒轉移到-80℃冰箱，過夜儲存后將凍存管移入液氮罐中長期儲存。

huc-mscs的復蘇：將凍存于液氮中的p2代干細胞取出后迅速置于37℃水浴鍋中，1min左右便可融化；在超凈工作臺中，將融化后的干細胞懸液轉移至15ml離心管中，1000g離心5min；收集沉淀，用1ml干細胞完全培養(yǎng)基重懸并加入25cm²細胞培養(yǎng)瓶中，補加培養(yǎng)基至5ml，并將細胞懸液混合均勻后移入co2細胞培養(yǎng)箱（37℃、5％co2濃度）中培養(yǎng)。復蘇后，第二天給細胞更換新鮮培養(yǎng)基并定期觀察細胞狀態(tài)。

huc-mscs的表面抗原鑒定：將上述復蘇后的p2代細胞，經傳代培養(yǎng)后，取生長狀態(tài)良好的p3代huc-mscs（后續(xù)所有試驗細胞均使用p3代huc-mscs），加入不含edta的胰蛋白酶消化、離心并收集細胞，然后用預冷的pbs沖洗細胞2~3次，pbs重懸細胞并調整其密度為1×10⁶個/ml。取100μl細胞懸液，分別加2μlcd34-fitc、cd45-fitc、cd44-fitc、cd133-fitc和hla-abc-fitc抗體及相應的對照抗體，混勻后4℃孵育30min，然后離心棄上清，并加入0.5ml的pbs重懸細胞，流式細胞儀檢測上述細胞表面抗原的表達。

圖1為使用流式細胞儀檢測huc-mscs的表面標志物，結果顯示，huc-mscs不表達造血系細胞表面標志cd34、cd45，高表達間質細胞標志cd44、干細胞標志cd133，同時表達人白細胞抗原h(huán)la-abc，符合間充質干細胞特性。

2、cck-8確立最佳低溫保護劑組分和最優(yōu)的凍存方式

最佳保護劑組分的確立：本實驗以huc-mscs為研究對象，設置的濃度梯度為：0μg/ml（nc）、15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml。取生長狀態(tài)良好的p3代huc-mscs細胞，調整細胞密度為：3×10⁴個/ml，均勻接種于96孔板中，每孔加入100μl細胞懸液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察細胞貼壁生長狀況，待細胞融合度達到50%時，吸去孔板里的培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度rhmg53的新鮮培養(yǎng)基，且每組設置三個復孔，在37℃、5%co2濃度下培養(yǎng)，分別在12h、24h、36h、48h、60h、72h時間點，去除舊培養(yǎng)基，每孔加入90μl新鮮培養(yǎng)基和10μlcck-8，在37℃條件下孵育2h，使用酶標儀檢測各處理細胞組的od450值。重復3次，并繪制細胞生長曲線。

圖2（a）為采用cck-8法檢測rhmg53作用于huc-mscs的最適濃度，結果發(fā)現(xiàn)，隨著rhmg53濃度的提高，細胞增殖能力均得到提升，與正常培養(yǎng)組細胞相比，rhmg53濃度大于30μg/ml時對細胞增殖的促進效果明顯。綜合考慮rhmg53作用于細胞的量效關系，結合文獻報道，可以確定rhmg53作用于細胞凍存過程中的最適濃度為：30μg/ml（細胞密度為1×10⁶個/ml）。

最優(yōu)凍存方式的確立：實驗分組情況為正常培養(yǎng)組（fresh）、常規(guī)凍存組(nc)、凍存復蘇均添加rhmg53(whole+rhmg53)、復蘇時添加rhmg53(post+rhmg53)、凍存時添加rhmg53(pro+rhmg53)。將上述處理過的細胞均勻接種于96孔板（每孔3000個細胞），細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在12h、24h、36h、48h、60h、72h時間點去除舊培養(yǎng)基，操作和檢測方法同上，繪制細胞生長曲線。

圖2（b）為采用cck-8法檢測的rhmg53作用于huc-mscs的最優(yōu)凍存方式，根據(jù)結果顯示，綜合考慮保護劑的成本和簡化操作流程，凍存時添加30μg/mlrhmg53（即pro+rhmg53）可為最優(yōu)的添加方式。即采用細胞凍存方式時按本發(fā)明配制的低溫保護劑（b液）為凍前需要添加的保護劑。

3、熒光定量pcr檢測凍存復蘇后huc-mscs干性基因的表達

3.1細胞總rna的提?。?/p>

（1）離心收集細胞，加入500μlrlsolution，用槍頭反復吹打細胞直至全部細胞溶解，吸取全部裂解液于1.5ml離心管中；

（2）加入40μl氯仿，充分混勻，12000rpm離心3min；

（3）吸取上清200~300μl于新的1.5ml離心管中，加入等體積無水乙醇，混勻；

（4）將混勻液吸入spincolumn管中，12000rpm離心1min，棄上清；

（5）加入600μlwashbuffer，12000rpm離心1min，棄濾液；

（6）重復步驟（5）；

（7）spincolumn管，12000rpm空轉1min，徹底去除廢液；然后將其放入新的無rna酶的1.5ml離心管中；

（8）無酶槍頭吸入50μlrnasfreewater，室溫放置1~2min后，12000rpm離心1min，收集濾液，獲得總rna，并測量其濃度。

3.2總rna逆轉錄成cdna

按takara反轉錄試劑盒說明書，每組均取500ngrna進行逆轉錄，操作如下：

（1）去除組dna

將此反應體系置于42℃保持2min或（室溫下5min），以去除組dna。

（2）rna逆轉錄合成cdna

將此反應體系放入普通pcr儀中，設置反應條件為：“37℃15min，85℃5s”。反應結束后，收集cdna。

3.3qrt-pcr檢測相關基因的表達

定量pcr反應體系如下：

每個樣品設置3個復孔，使用appliedbiosystems7500real-timepcr儀，按“95℃30s,（95℃5s，60℃34s）40個循環(huán)”進行檢測。pcr結束后，導出ct值，采用比較ct法(δδct)，根據(jù)公式：相對表達量(rq)=2-δδct，計算出各個基因的相對表達量，重復3次并進行數(shù)據(jù)分析，制作柱狀圖。

干性相關基因的引物如下表：

圖3是凍存對huc-mscs干性基因表達的影響，結果顯示，常規(guī)凍存和添加rhmg53凍存干細胞，對干細胞的干性基因的表達均無顯著影響。

4、染色體核型分析檢測rhmg53對凍存復蘇huc-mscs核型的影響

將實驗細胞分為三組：正常培養(yǎng)組、加本申請配制的凍存液a組和凍存液b組。核型檢測實驗步驟如下：

（1）取狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的p3代huc-mscs細胞，消化涂片，制成細胞標本，放入染色缸，用geimsa染色液染色10-15分鐘；染色結束后，將細胞標本在盛水塑料杯中洗涮幾次，吹風機風干玻片，鏡檢。

（2）顯微攝影：將制好的片子放在數(shù)碼攝影顯微鏡下進行拍攝，以供分析。

（3）核型分析

核型：將一個細胞內所有染色體按一定順序排列起來，代表著某一個體所有細胞的染色體組成，包括形態(tài)、大小、數(shù)目等，分為a、b、c、d、e、f、g等七組和一組性染色體。

組型：把核型按模式圖的形式表現(xiàn)出來，代表一個個體的染色體組成。

（4）完成染色體組型分析。

圖4是對凍存后huc-mscs核型的檢測，三組細胞的染色體條數(shù)、形態(tài)和結構均正常且無畸變，凍存過程對常規(guī)凍存保護劑和rhmg53對huc-msc的核型無影響，說明rhmg53對干細胞安全、無毒。

5、臺盼藍染色檢測本發(fā)明配制的凍存液a和凍存液b對huc-mscs存活率的影響

實驗細胞分為三組：正常培養(yǎng)組、加本申請配制的凍存液a組和凍存液b組，對不同凍存時間（1個月、6個月和1年）進行檢測。

正常的活細胞，胞膜結構完整，能夠排斥臺盼藍，使之不能夠進入胞內；而喪失活性或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色。通常認為細胞膜完整性喪失，即可認為細胞已經死亡，因此，借助臺盼藍染色可以非常簡便、快速地區(qū)分活細胞和死細胞。實驗步驟如下：

（1）不同組的細胞、不同凍存時間，從液氮中取出后復蘇，培養(yǎng)6個小時，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，胰蛋白酶消化細胞，搜集所有細胞制備單細胞懸液，并作適當稀釋。

（2）染色：將細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9:1混合混勻，輕輕吹打混勻，3~5min后滴板計數(shù)進行細胞染色。

（3）鏡下觀察并計數(shù)：吸取適量加有臺盼藍染色液的細胞懸液，滴加細胞計數(shù)板計數(shù)，死細胞被染成明砧的藍色，而活細胞呈無色透明狀。

（4）統(tǒng)計細胞存活率：活細胞率(%)=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）×l00%

臺盼藍檢測兩種凍存液（本發(fā)明配制的保護劑為b組，不含rhmg53的混合液為a組）對huc-mscs存活率的影響如圖5所示，結果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明配制的凍存液b組的細胞存活率較高，說明rhmg53作為huc-mscs的低溫保護劑特殊組分，能提高干細胞的存活率。

6、油紅o染色及qrt-pcr檢測凍存復蘇后huc-mscs成脂分化情況

成脂誘導分化：將凍存的兩組細胞復蘇和一組正常培養(yǎng)的細胞（3組細胞來源相同、代數(shù)相同）經傳代培養(yǎng)后，更換成脂誘導培養(yǎng)基，每隔3d更換一次新鮮培養(yǎng)基，誘導分化14d左右觀察細胞形態(tài)并進行油紅o染色和rna的提取。

oilredo染色：油紅o是一種很強的脂溶劑和脂染劑，較易與甘油三酯結合呈小脂滴狀，與磷脂結合力稍差，其染色原理一般認為是物理上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂肪染色。染料在細胞內脂質的溶解度較原溶劑中的溶解度更大，所以在染色時染料就從有機溶劑轉移入脂質而使脂肪染色。因脂質濃度不同，脂肪陽性染色結果為橙黃至紅色。實驗步驟如下：

取誘導分化14d的干細胞消化離心并用pbs清洗后，調整細胞密度，各組取相同的細胞制備細胞涂片，其余的細胞提取rna并進行后續(xù)實驗。將制備好的細胞涂片在4％的多聚甲醛溶液中固定30min；然后，用pbs清洗兩次，加入0.5％的油紅o染色液，染色20min；放入60％異丙醇溶液中漂洗20~30s，流水沖洗，晾干封片并顯微鏡觀察。

成脂分化相關基因的表達：（實驗方法及步驟同3：熒光定量pcr檢測凍存復蘇后huc-mscs干性基因的表達）。成脂分化相關基因的引物序列如下表：

油紅o染色和qrt-pcr結果如圖6所示，成脂誘導分化14天后，進行油紅o染色，可見各組細胞均含有被染為紅色較標準的脂滴，成脂分化成功。且由凍存液b凍存的細胞陽性率染色較高，且成脂分化相關基因（fabp4、lpl、ppar-γ）的表達有顯著提升。

7、茜素紅s染色及qrt-pcr檢測凍存復蘇后huc-mscs成骨分化情況

成骨誘導分化：將凍存的兩組細胞復蘇和一組正常培養(yǎng)的細胞（3組細胞來源相同、代數(shù)相同）經傳代培養(yǎng)后，更換成骨誘導培養(yǎng)基，每隔3d更換一次新鮮培養(yǎng)基，誘導分化21d左右觀察細胞形態(tài)并進行茜素紅s染色和rna的提取。

茜素紅s染色：茜素紅s是一種蒽醌類化合物，茜素磺酸鈉鹽，它能與碳酸鈣或磷酸鈣中的鈣鹽鰲合形成橙紅色復合物，適用于少量鈣鹽組織的染色。染色步驟如下：

干細胞成骨誘導分化21天后，消化離心并用pbs清洗，適當稀釋并調整細胞密度，取相同數(shù)量的細胞制備細胞涂片，其余細胞提取總rna。將制備好的細胞涂片在4％的多聚甲醛溶液中固定30min；然后，用pbs清洗兩次，加入1％茜素紅s染色液（ph=8.3），染色10min后；用pbs沖洗3次，晾干后封片，顯微鏡觀察并拍照。

成骨分化相關基因的表達：（實驗方法及步驟同3：熒光定量pcr檢測凍存復蘇后huc-mscs干性基因的表達）。成骨分化相關基因的引物序列如下表：

茜素紅s染色和qrt-pcr結果如圖7所示，成骨誘導分化21天經茜素紅s染色后，均可見大量鈣質結節(jié)被著色，說明成骨分化成功。且由凍存液b凍存的細胞陽性率染色較高，且成骨分化相關基因（alpl、osx、runx2）的表達顯著提升。

8、免疫熒光檢測凍存復蘇后huc-mscs成神經分化情況

成神經分化：將凍存的兩組細胞復蘇和一組正常培養(yǎng)的細胞（3組細胞來源相同、代數(shù)相同）經傳代培養(yǎng)后，待細胞融合度達60％左右時，更換含20％fbs的dmem低糖培養(yǎng)基處理24h；更換含10ng/mlbfgf的dmem低糖培養(yǎng)基處理24h；隨后，更換神經分化誘導培養(yǎng)基（dmem低糖培養(yǎng)基，2％dmso，100μmbha，25mmkcl，10μmforskolin，5μg/ml胰島素，1μm氫化可的松），誘導分化24h；更換神經分化維持誘導培養(yǎng)基(dmem/f12完全培養(yǎng)基，10％fbs，10ng/mlegf，10ng/mlbfgf，1×n2，1×b27），維持3-4d。分化完成的細胞一部分做免疫熒光，另一部分提取全rna做熒光定量pcr。

免疫熒光檢測成神經分化相關dcx、nse、neun和β-ⅲtubulin的表達：將分化完成的各組干細胞，消化離心并收集細胞，計數(shù)并用神經分化維持誘導培養(yǎng)基調整細胞密度為：5×105個/ml，按每孔0.5ml細胞懸液均勻鋪到24孔板底部，混勻并做好標記后，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。免疫熒光檢測，其步驟如下：

（1）吸去24孔板中的培養(yǎng)基，用pbst清洗細胞3次，加4％的多聚甲醛固定30min；

（2）吸除固定液，pbst清洗3，加入含0.05％triton100的枸櫞酸緩沖液(ph6.0)中，水浴鍋中煮沸20min；

（3）自然冷卻至室溫后，使用pbs清洗3次，每孔滴加0.2ml的封閉液（含3％脫脂奶粉、5％山羊血清的tbst溶液）封閉1h；

（4）吸去封閉液，每孔加入0.2ml適當比例稀釋的一抗(dcx、nse、neun和β-ⅲtubulin均按1：50稀釋)，4℃孵育過夜；

（5）吸去一抗，用pbst清洗4次，每次5min。避光條件下，每孔滴加0.2ml相應的熒光二抗（稀釋比例為：1:1000），孵育1h；

（6）吸去二抗，pbst清洗4次，每次5min。避光，每孔滴加0.2ml的dapi溶液（稀釋比例為1:2000）復染細胞核15min；

（7）吸去dapi溶液，pbst清洗4次，每次5min，熒光顯微鏡觀察并拍照。

兩種凍存液凍存的干細胞成神經分化情況如圖8，huc-mscs經過一周左右的成神經分化誘導后，細胞形態(tài)改變明顯，由原來的長梭型變成多突觸的神經樣細胞形態(tài)，免疫熒染色和陽性細胞數(shù)統(tǒng)計結果（圖8）顯示：由凍存液b凍存的細胞神經分化相關dcx、neun和β-ⅲtubulin的表達和陽性細胞數(shù)增加明顯，成神經分化效率更高。

9、低溫保存后的huc-mscs對tbi小鼠體重變化和mnss得分情況的影響

9.1腦損傷模型的建立

本實驗采用自由落體打擊法建立c57bl/6小鼠創(chuàng)傷新腦損傷模型。用10％水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射小鼠，待其麻醉后，于顱頂部備皮，碘伏消毒后，將小鼠固定于腦立體定位儀，從失狀縫正中切開頭皮3~5cm，暴露顱骨外筋膜，用棉棒尾端分離筋膜，顯露出右側顱骨，于前囟后約1.5mm、中線旁側1.5mm，用環(huán)形鉆小心鉆開3mm骨窗，保證硬腦膜完整。然后，調整顱腦打擊器，使撞針（直徑2.5mm）正對骨窗中心，控制打擊深度為2mm，將20g的砝碼從20cm處垂直打擊撞針，隨后迅速提起撞針，造模完成。造模成功標準為：打擊后，小鼠一過性四肢抽搐，呼吸暫停，但數(shù)秒后可自行緩解。術后止血，并用骨蠟閉合骨窗，縫合頭皮。手術過程和術后應給予小鼠保溫處理，保持肛溫37±0.5℃，直至小鼠清醒。

9.2動物動物及分組

清潔級雄性c57bl/6小鼠，10~12周，體重23g~25g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，適應環(huán)境1周后，按[0059]的方法開始造模。將造模成功的12只c57bl/6小鼠隨機分為tbi組（6只，術后6小時，尾靜脈注射0.9％的生理鹽水0.1ml）；tbi+huc-mscs組（6只，術后6小時后，尾靜脈注射凍存液b凍存的細胞0.1ml，細胞密度為：1×10⁷個/ml）。每天1次，連續(xù)注射3天。術中、術后如果發(fā)現(xiàn)動物死亡，立即給予補充，確保每組實驗小鼠6只。

在術后0、1、3、7、14、21和28天的固定時間稱量小鼠體重變化并隨后進行神經功能缺損評分（modifiedneurologicalseverityscore，mnss評分），期間按時補充食物和水、定期更換墊料。根據(jù)mnss評分量表，采用雙盲法評判并記錄分值。mnss評分標準是從小鼠運動、感覺、平衡能力以及反射情況等方面進行評估：從0分（正常）-18分（最嚴重）。

兩組小鼠術后體重變化情況如（圖9a）所示。tbi造模后，小鼠體重在術后1天，3天略有減輕，從7天開始體重增加。比較不同時間點體重可發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠在術后1天，3天，7天，體重無明顯變化。14天后，huc-mscs治療組小鼠體重明顯高于tbi組。

圖9b是兩組小鼠mnss得分情況。術后1天，tbi組和tbi+huc-mscs組小鼠評分分別為（11.3±0.8）和（11.5±0.9）分，說明建模均一性較好，術后3天，tbi組小鼠評分略有上升。14天后，huc-mscs治療組小鼠mnss得分明顯低于tbi組。說明凍存液b凍存的tbi+huc-mscs能增加tbi小鼠的體重，降低tbi小鼠的神經受損程度。

10、低溫保存后的huc-mscs對tbi小鼠抑郁情況、認知功能恢復情況的影響

強迫游泳實驗：tbi后28天，兩組各選6只小鼠，做如下實驗：在一個圓柱形的水容器中，放入清水（高度：25cm，直徑：22cm，水溫：23±1℃）。將小鼠放入水中，因小鼠怕水，將會不停游動，用攝像機記錄6分鐘。在電腦上分析后4分鐘視頻，記錄小鼠游泳時間，漂浮或僅有一肢體微動不計入游泳時間。應用公式得到懸浮時間：懸浮時間（秒）=240秒-游泳時間。

糖水偏好實驗：tbi后21天進行實驗，持續(xù)一周。操作步驟見zhu等報道[48]。術后21天，配制濃度為1%的蔗糖溶液，并倒入飲水瓶中。每只待測小鼠單獨放入一個鼠籠，每個鼠籠放置2個飲水瓶，讓小鼠適應糖水3天。腦外傷第24天，用含蒸餾水的飲水瓶更換掉其中一個糖水瓶，并做好標記。用天平稱量2瓶重量重，并貼上標簽標明重量。腦外傷第28天，再次稱量2水瓶重量，并計算糖水和純水的消耗量，利用公式計算兩組小鼠蔗糖偏嗜度：蔗糖偏嗜度=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%。

新事物識別（novelobjectrecognition，nor）實驗：tbi后27天，將要進行實驗的小鼠放置在一個50cm×50cm×25cm不透明箱子中，進行環(huán)境適應10分鐘。24小時后，將2個相同體積、相同顏色的物體放入箱子中（4cm×4cm×4cm紅色立方體），讓小鼠探索10分鐘后，放入原來的籠子。1小時后，將其中1個紅色立方體用綠色的球形物體（直徑4cm）代替，再次將小鼠放置到此箱子中，讓其探索5分鐘，期間應用錄像機記錄小鼠探索情況。此時紅色立方體為舊物體，而綠色球形物體為新物體，在電腦上分析小鼠探索新、舊物體所用時間。計算出小鼠的辨別指數(shù)，辨別指數(shù)=新物體所用時間/（新物體所用時間+舊物體所用時間）×100%。

圖10是比較兩組小鼠抑郁情況和認知功能。強迫游泳實驗結果顯示：干細胞治療組小鼠懸浮時間（125.25±4.55s）明顯低于tbi組（147.45±3.85s）；糖水偏好實驗顯示：與tbi組小鼠（49.15±2.32％）相比，干細胞移植治療組小鼠糖水偏好度（56.07±2.98％）有所提高；在新事物識別實驗中，干細胞治療組小鼠的新事物辨別指數(shù)（65.16±1.89％）高于tbi（53.86±2.12％）。說明凍存液b凍存的huc-mscs能提高腦損傷小鼠的認知功能，減輕腦損傷小鼠的抑郁情況。