本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種ips細(xì)胞保存液及其制備方法。
背景技術(shù)：
ips細(xì)胞(誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞)是將一些多能遺傳基因倒入皮膚等細(xì)胞中制造而成，即讓普通體細(xì)胞“初始化”，使其具備干細(xì)胞功能?！癷ps細(xì)胞”不僅在細(xì)胞形態(tài)、生長特性，干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)等方面與es細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)非常相似，而且在dna甲基化方式、基因表達(dá)譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合體動(dòng)物等方面也與es細(xì)胞幾乎完全相同。ips細(xì)胞除了不能生成胚胎以外，可以產(chǎn)生所有的細(xì)胞，如果用于醫(yī)療，那么理論上可以治愈所有疾病——凡是不好的組織都去除，替換為重新生長的正常組織。
中國專利cn102365933b公開了一種間充質(zhì)干細(xì)胞保存液及其制備方法與應(yīng)用，該間充質(zhì)干細(xì)胞保存液含有占保存液體積5-15％的人ab型臍帶血血漿和70-80axaiu/ml的低分子肝素鈣；所述的人ab型臍帶血血漿與間充質(zhì)干細(xì)胞來自同一提供者。該發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液能延長間充質(zhì)干細(xì)胞的活性維持時(shí)間，且保存72h后，不影響其表型特征，但該發(fā)明在細(xì)胞密度較高的情況下細(xì)胞結(jié)團(tuán)率較高。
中國專利申請(qǐng)cn105087472a公開了一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液、其應(yīng)用及凍存方法，所述凍存液以imdm/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基質(zhì)，每100ml誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液中包括以下體積濃度的組分：2～20v/v％dmso；0.5～5v/v％右旋糖酐40；0.5～5v/v％白蛋白；1ng～1000ngthiazovivin；余量為imdm/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。該發(fā)明雖然凍存效果較好，但dmso具有細(xì)胞毒性，與蛋白質(zhì)疏水集團(tuán)發(fā)生作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，具有血管毒性和肝腎毒性，如果低溫保存的細(xì)胞復(fù)蘇后直接醫(yī)用，過多的dmso對(duì)人體具有毒性，并且這種傳統(tǒng)的凍存液要求在超低溫下保存，移植前需要復(fù)蘇等過程，給應(yīng)用帶來很多不便。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種ips細(xì)胞保存液及其制備方法。本發(fā)明提供的ips細(xì)胞保存液對(duì)ips細(xì)胞的活力和形態(tài)具有優(yōu)良的維持作用，且長期保存中細(xì)胞結(jié)團(tuán)率較低，從而顯著提高了ips細(xì)胞的治療效果。同時(shí)，本發(fā)明保存液安全性高、便于臨床使用。
本發(fā)明提供了一種ips細(xì)胞保存液，每100mlips細(xì)胞保存液中包括水及以下組分：
白蛋白0.1-0.5g、低分子肝素鈉0.1-0.3g、黃芪甲苷0.05-0.15g、葡萄糖0.1-0.3g、氯化鈉0.5-1.5g、維生素c1.0-2.0g、甘氨酸0.2-0.6g、醋酸鈉0.4-0.6g、醋酸0.03-0.05g和甘油1.0-2.0g。低分子肝素鈉購于南京南大藥業(yè)有限責(zé)任公司。
本發(fā)明細(xì)胞保存液對(duì)維持ips細(xì)胞滲透壓及活力有較好的作用，同時(shí)還可以有效的防止細(xì)胞的結(jié)團(tuán)，利于臨床的應(yīng)用。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，ips細(xì)胞保存72h后，細(xì)胞存活率>94％，細(xì)胞結(jié)團(tuán)率<0.4％。
低分子肝素鈉與普通肝素鈉相比，具有半衰期長，生物活性高的優(yōu)點(diǎn)，出血副作用少，用低分子肝素時(shí)可以不用監(jiān)測凝血指標(biāo)，比較安全，且抗血栓作用時(shí)間可長達(dá)24h，可用于抑制ips細(xì)胞聚集成團(tuán)。
黃芪甲苷是黃芪皂苷的主要活性成分之一，具有清除自由基延緩衰老、增強(qiáng)細(xì)胞生理代謝、提高氧化作用、提高細(xì)胞活性等作用，本發(fā)明采用黃芪甲苷可以延緩細(xì)胞的衰老和緩慢增殖，從而提高ips細(xì)胞的活性。
進(jìn)一步地，所述ips細(xì)胞保存液每100ml中由水及以下組分組成：
白蛋白0.3g、低分子肝素鈉0.2g、黃芪甲苷0.1g、葡萄糖0.2g、氯化鈉1.0g、維生素c1.5g、甘氨酸0.4g、醋酸鈉0.5g、醋酸0.04g和甘油1.5g。
本發(fā)明采用甘油作為保護(hù)劑，代替了dmso，避免了蛋白質(zhì)的變性及臨床使用的危害。本發(fā)明細(xì)胞保存液不僅可以很好地維持細(xì)胞活性劑增殖活性，又不導(dǎo)致細(xì)胞的變異及細(xì)胞的結(jié)團(tuán)，可以滿足臨床使用。
進(jìn)一步地，所述ips細(xì)胞保存液的ph為7.2-7.4，滲透壓為311-330mmol/l。
進(jìn)一步地，所述ips細(xì)胞保存液中ips細(xì)胞的濃度為0.5×107-5×107cell/ml。
同時(shí)，本發(fā)明也提供了一種ips細(xì)胞保存液的制備方法，包括以下步驟：
s1將氯化鈉和醋酸鈉加入到40ml水中，攪拌溶解，得溶液a；
s2將甘氨酸加入到20ml水中，攪拌溶解，得溶液b；
s3將步驟s1所得溶液a與步驟s2所得溶液b混合均勻，邊攪拌邊加入白蛋白、葡萄糖、維生素c、低分子肝素鈉、黃芪甲苷和甘油，再加入醋酸，攪拌均勻，水定容至100ml，即得。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：
(1)在4-10℃，本發(fā)明的ips細(xì)胞保存液保存ips細(xì)胞72h后，細(xì)胞存活率>94％，細(xì)胞結(jié)團(tuán)率<0.4％，即72h后細(xì)胞活性較好，且細(xì)胞結(jié)團(tuán)率較低；
(2)本發(fā)明的ips細(xì)胞保存液成分明確，操作簡單，安全性高，無毒無副作用，不影響ips細(xì)胞的形態(tài)，便于細(xì)胞的運(yùn)輸及保存，便于臨床應(yīng)用。
附圖說明
圖1：不同保存液中ips細(xì)胞活力測定。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，這些實(shí)施例只用于例證的目的，并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1一種ips細(xì)胞保存液
所述ips細(xì)胞保存液，每100ml中包括水及以下組分：
白蛋白0.1g、低分子肝素鈉0.1g、黃芪甲苷0.05g、葡萄糖0.1g、氯化鈉0.5g、維生素c1.0g、甘氨酸0.2g、醋酸鈉0.4g、醋酸0.03g和甘油1.0g。
制備方法：
s1將氯化鈉和醋酸鈉加入到40ml水中，攪拌溶解，得溶液a；
s2將甘氨酸加入到20ml水中，攪拌溶解，得溶液b；
s3將步驟s1所得溶液a與步驟s2所得溶液b混合均勻，邊攪拌邊加入白蛋白、葡萄糖、維生素c、低分子肝素鈉、黃芪甲苷和甘油，再加入醋酸，攪拌均勻，水定容至100ml，即得。
實(shí)施例2一種ips細(xì)胞保存液
所述ips細(xì)胞保存液，每100ml中包括水及以下組分：
白蛋白0.3g、低分子肝素鈉0.2g、黃芪甲苷0.1g、葡萄糖0.2g、氯化鈉1.0g、維生素c1.5g、甘氨酸0.4g、醋酸鈉0.5g、醋酸0.04g和甘油1.5g。
制備方法與實(shí)施例1類似。
實(shí)施例3一種ips細(xì)胞保存液
所述ips細(xì)胞保存液，每100ml中包括水及以下組分：
白蛋白0.5g、低分子肝素鈉0.3g、黃芪甲苷0.15g、葡萄糖0.3g、氯化鈉1.5g、維生素c2.0g、甘氨酸0.6g、醋酸鈉0.6g、醋酸0.05g和甘油2.0g。
制備方法與實(shí)施例1類似。
對(duì)比例1一種ips細(xì)胞保存液
所述ips細(xì)胞保存液，每100ml中包括水及以下組分：
白蛋白0.3g、低分子肝素鈉0.2g、葡萄糖0.2g、氯化鈉1.0g、維生素c1.6g、甘氨酸0.4g、醋酸鈉0.5g、醋酸0.04g和甘油1.5g。
制備方法與實(shí)施例1類似。
與實(shí)施例2的區(qū)別在于，未添加黃芪甲苷，增加了維生素c的用量。
對(duì)比例2一種ips細(xì)胞保存液
所述ips細(xì)胞保存液，每100ml中包括水及以下組分：
白蛋白0.3g、肝素鈉0.2g、黃芪甲苷0.1g、葡萄糖0.2g、氯化鈉1.0g、維生素1.5g、氨基酸0.4g、醋酸鈉0.5g、醋酸0.04g和甘油1.5g。
制備方法與實(shí)施例1類似。
與實(shí)施例2的區(qū)別在于，將低分子肝素鈉替換為肝素鈉。
試驗(yàn)例一、細(xì)胞活力檢測
1.試驗(yàn)材料：實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2制備的保存液保存的ips細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106cell//ml。
2.試驗(yàn)方法：
(1)采用水浴復(fù)溫法，將保存液于40℃水浴中融化，取出；
(2)mtt法測定細(xì)胞活性：用96孔培養(yǎng)板，分別取50μl加入不同保存液的細(xì)胞懸浮液及相應(yīng)不含細(xì)胞的保存液加入培養(yǎng)孔中，再加入mtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)10μl，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中孵育4h后，加入20％sds-50％dfm溶液150μl繼續(xù)孵育3h，然后以相應(yīng)無細(xì)胞孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定od值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，公式如下：
細(xì)胞存活率＝(odt-od空白)/(od0-od空白)。
其中，od0：保存液保存ips細(xì)胞0h的od值；odt：保存液保存ips細(xì)胞th的od值。
3.試驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞活力檢測結(jié)果見表1所示。
表1細(xì)胞活力檢測結(jié)果
由表1與圖1可知，本發(fā)明制備的ips細(xì)胞保存液對(duì)ips細(xì)胞的活力具有優(yōu)良的維持作用。與對(duì)比例1-2組相比，本發(fā)明實(shí)施例1-3制備的ips細(xì)胞保存液對(duì)ips細(xì)胞的活力維持作用較好，說明本發(fā)明ips細(xì)胞保存液的配方組成合理，且ips細(xì)胞保存液的ph及滲透壓影響著ips細(xì)胞的活力。
試驗(yàn)例二、細(xì)胞結(jié)團(tuán)率檢測
分別取在細(xì)胞保存液保存12h、24h、48h、72h后的ips細(xì)胞懸液1ml。按細(xì)胞懸液：0.4％臺(tái)盼藍(lán)(v:v)＝3:1輕輕混勻，取20μl細(xì)胞混勻液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，用countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞結(jié)團(tuán)率的檢測，檢測結(jié)果見表2。
表2細(xì)胞結(jié)團(tuán)率檢測結(jié)果
由表2可知，本發(fā)明制備的ips細(xì)胞保存液在保存ips細(xì)胞過程中結(jié)團(tuán)率較低。與對(duì)比例1-2組相比，本發(fā)明實(shí)施例1-3制備的ips細(xì)胞保存液對(duì)ips細(xì)胞的結(jié)團(tuán)率較低，說明本發(fā)明ips細(xì)胞保存液在運(yùn)輸及保存后，在外力作用下可自動(dòng)散開，重新形成新的細(xì)胞懸液。
上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。