本發(fā)明屬于植物保護(hù)領(lǐng)域，具體涉及瑞香狼毒莖葉提取物抗枸杞蚜蟲的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

枸杞蚜蟲（aphidgosypiiglover）是枸杞林的重大害蟲,難于控制,常在枸杞生長季節(jié)暴發(fā)成災(zāi),引起枸杞果產(chǎn)量降低30%～70%,產(chǎn)品質(zhì)量大幅度下降,商品價(jià)值受到嚴(yán)重影響。枸杞蚜蟲的危害主要引起枸杞產(chǎn)量下降、葉片和果實(shí)營養(yǎng)成分與微量元素含量發(fā)生變化。當(dāng)蟲口密度達(dá)到6.3頭/粒紅果時(shí),即出現(xiàn)產(chǎn)量損失。蟲口密度越高,產(chǎn)量損失越大,蟲口密度與產(chǎn)量之間呈對數(shù)顯著相關(guān)關(guān)系。防治枸杞蚜蟲對枸杞的產(chǎn)量和品質(zhì)提高具有重要意義。

化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用帶來了種種弊端，如有害生物抗藥性的產(chǎn)生、殘毒以及環(huán)境污染，良莠不分地殺死大量害蟲天敵，嚴(yán)重破壞了生態(tài)平衡。因此，符合環(huán)保、健康、持續(xù)發(fā)展理念的高效、低毒、低殘留、與環(huán)境相容的生物農(nóng)藥開發(fā)就成為當(dāng)今農(nóng)藥研究的主題。生物農(nóng)藥因其安全無毒、無殘留、不污染環(huán)境而為公眾所接受并迅速發(fā)展。20世紀(jì)90年代以來,全世界化學(xué)農(nóng)藥銷售量以1%～2%的速度不斷下降,而生物農(nóng)藥卻以20%的速度遞增，充分說明生物農(nóng)藥之于環(huán)境，之于社會效益的巨大潛力。

瑞香狼毒(stellerachamaejasmell.)隸屬于瑞香科狼毒屬多年生草本植物，又名斷腸草，有毒性，其根有逐水祛痰，散結(jié)殺蟲之功效。莖高根粗，質(zhì)韌不易折斷，樹皮有綿性纖維；地上部分呈淡褐色，不分枝，平滑無毛；葉披針形，頂生頭狀花序，花黃色或白色，果實(shí)為小堅(jiān)果卵形，產(chǎn)種量大，種子生命力強(qiáng)，花期6～8月，果期9～10月。瑞香狼毒多生長在海拔較高、年平均溫度在0℃左右的向陽山坡，廣泛分布于我國東北、西北、西南等地。瑞香狼毒根部抗旱力和競爭力極強(qiáng)，可對周圍其他植物種產(chǎn)生明顯的郁蔽作用。另外，瑞香狼毒除了其一些藥用價(jià)值外還具有一定的生態(tài)作用，還可以作為生物源農(nóng)藥，如殺蟲劑。

瑞香狼毒的殺蟲活性主要體現(xiàn)在其作為植物源農(nóng)藥方面的應(yīng)用。曹揮等對瑞香狼毒根提取物進(jìn)行活性測定發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒的殺蟲效果表現(xiàn)為觸殺和胃毒活性。李捷等用多種測定方法比較狼毒根的4種不同提取物的殺蟲效果，發(fā)現(xiàn)其均具有良好的殺蟲效果。高平等通過scee對棉蚜、桔蚜和煙蚜的觸殺毒性、拒食活性進(jìn)行了室內(nèi)研究和田間試驗(yàn)，結(jié)果表明：狼毒根提物對幾類蚜蟲的殺蟲作用很好，但由于蚜蟲來源的不同，殺蟲效果存在一定的差異。侯太平自狼毒中得到2種強(qiáng)效滅蚜組分：1,5-二苯基-1-戊酮和1,5-2-1-二苯基烯丙基環(huán)戊酮，并把它作為蚜蟲生物去除劑的主要成分，且田間實(shí)驗(yàn)效果很好。但目前對瑞香狼毒的利用存在一定的缺陷，整株利用導(dǎo)致要采集整株瑞香狼毒，需要不斷種植，使成本增加。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)上的不足，本發(fā)明提供了瑞香狼毒莖葉提取物抗枸杞蚜蟲的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是提供瑞香狼毒莖葉提取物抗枸杞蚜蟲的應(yīng)用，利用生物農(nóng)藥替代化學(xué)農(nóng)藥，利用莖葉，避免采挖根部對植被、土壤的破壞。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供一種用于抗枸杞蚜蟲的瑞香狼毒莖葉提取物，所述提取物含有瑞香狼毒黃酮，并按照以下工序獲得：

分別稱取莖葉干粉1kg，固液比1：25-30，加乙醇浸泡，超聲50min，提取2次，過濾，濾渣重復(fù)提取，旋蒸濃縮得到初浸膏。初浸膏與硅膠拌樣，旋蒸后，裝入層析柱內(nèi)，按照極性大小依次用有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，得到了兩種不同的分離組分。

優(yōu)選的，層析系統(tǒng)溶劑為乙酸乙酯相或正丁醇相。

優(yōu)選的，所述提取物的濃度為0.1-0.0005mg/ml。

優(yōu)選的，所述提取物的濃度為0.01，0.005，0.0025mg/ml。

所述的提取物可制作為為乳油、水懸浮劑、油懸浮劑、可濕性粉劑、顆粒劑或水分散粒劑等農(nóng)藥上可接受的劑型。

所述的提取物制劑包括在農(nóng)藥上可接受的，一種或多種選自潤濕劑、分散劑、增稠劑、防凍劑、崩解劑、粘結(jié)劑、消泡劑、載體或填充劑的助劑。

一種用于抗枸杞蚜蟲的瑞香狼毒莖葉提取物的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

（1）瑞香狼毒殺蟲活性成分的提取

稱取干燥粉碎的瑞香狼毒粉末2kg，按照料液比1：25-30，加入95%的乙醇，冷浸3天后，超聲波提取2次，每次60min。重復(fù)浸提三次，過濾并合并3次濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至1/10量時(shí)，倒出放置，進(jìn)行沉淀脫糖，糖以結(jié)晶狀態(tài)析出。液體再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得初浸膏。

（2）瑞香狼毒殺蟲活性成分的分離

按照提取流程圖1，瑞香狼毒乙醇相浸膏以乙醇溶解拌入10倍量的硅膠，在旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀蒸干后，裝入層析柱內(nèi)依次用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行洗脫分離，通過薄板檢測和洗脫量為依據(jù)進(jìn)行更換洗脫溶劑，分別得到不同的分離部位，即乙酸乙酯相和正丁醇相。將各不同溶劑相烘干后，備用。

優(yōu)選的，所述步驟（1）中料液比1：25或1：30。

提取物在防治枸杞蚜蟲中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，提取物在防治枸杞3齡蚜蟲中的應(yīng)用

本發(fā)明的有益效果是：以地上部分代替根部作為原料，既避免了采挖根部對植被、表層土壤造成難以恢復(fù)的破壞，又可以有效地控制狼毒肆虐草原的危害。同時(shí),解決了變害為寶，有利于狼毒的防除以及開發(fā)利用。

附圖說明

圖1是瑞香狼毒提取工藝流程圖。

圖2是莖葉粗提物的抗蟲效果。

圖3是莖葉與根的粗提物對蚜蟲的抗蟲活性研究。

圖4莖葉的乙酸乙酯相與莖葉正丁醇相對枸杞蚜蟲的抗蟲活性比較。

圖5莖葉不同分離相組分對蚜蟲的抗蟲活性研究。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述：

實(shí)施例1瑞香狼毒莖葉、根提取物提取

1.1實(shí)驗(yàn)材料

材料：狼毒根、莖葉，菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，乙醇，正丁醇，乙酸乙酯，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等及其他分析純試劑和蒸餾水。

1.2瑞香狼毒殺蟲活性成分的提取

稱取干燥粉碎的瑞香狼毒粉末2kg，按照料液比1：30，加入95%的乙醇，冷浸3天后，超聲波提取2次，每次60min。重復(fù)浸提三次，過濾并合并3次濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至1/10量時(shí)，倒出放置，進(jìn)行沉淀脫糖，糖以結(jié)晶狀態(tài)析出。液體再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得初浸膏。

1.3瑞香狼毒殺蟲活性成分的分離

按照圖1，瑞香狼毒乙醇相浸膏以乙醇溶解拌入10倍量的硅膠，在旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀蒸干后，裝入層析柱內(nèi)依次用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行洗脫分離，通過薄板檢測和洗脫量為依據(jù)進(jìn)行更換洗脫溶劑，分別得到不同的分離部位，即乙酸乙酯相和正丁醇相。將各不同溶劑相烘干后，備用。

實(shí)施例2瑞香狼毒莖葉及根提取物抗蟲活性比較

2.1瑞香狼毒生物活性測定方法

2.1.1瑞香狼毒莖葉及根粗提物的抗蟲活性測定方法

取瑞香狼毒莖葉及根的粗提物各0.1g，用10ml丙酮溶解作為樣品，對照組用10ml丙酮作同樣處理。

2.1.1.1拒食活性測定方法

采用浸漬葉碟飼喂法進(jìn)行拒食活性的測定。將新鮮的白菜葉片剪成1cm×1cm的葉碟，放入供試樣品的丙酮稀釋液內(nèi)浸2~3s，自然晾干。在直徑為9cm的培養(yǎng)皿底部鋪一層濾紙，并加蒸餾水保濕，各皿中放入對應(yīng)藥品處理的葉碟一片，用丙酮處理過的葉碟作對照。挑取大小一致、饑餓4h的3齡菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲，每個培養(yǎng)皿中放入3齡幼蟲1頭，以20頭為一組，設(shè)3個重復(fù)。室溫下飼養(yǎng)，若供試蟲吃完1片葉碟后再加用相同方法處理過的葉碟一片，記錄取食葉碟的數(shù)量。每隔24h用坐標(biāo)紙記錄取食葉面積，并更換新鮮浸毒葉片，連續(xù)記錄72h，按照下列公式計(jì)算拒食率。

拒食率=（對照組平均取食葉面積—處理組平均取食葉面積）/對照組平均取食葉面積×100%

2.1.1.2觸殺毒力測定方法

采用浸蟲法進(jìn)行觸殺毒力的測定。各培養(yǎng)皿中放入潔凈的白菜葉片。選用饑餓4h的大小一致的3齡菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲幼蟲，將幼蟲入供試樣品的丙酮稀釋液及對照液中，浸2~3s后取出，待藥液自然晾干，將幼蟲放于培養(yǎng)皿中。每組20頭蟲，重復(fù)3次。分別于處理后24h、48h和72h觀察，根據(jù)下列公式記算死亡率。

校正死亡率=（處理組死亡率—對照組死亡率）/(1—對照組死亡率)×100%

2.1.2瑞香狼毒莖葉及根提取物不同分離相的抗蟲活性測定方法

取實(shí)施例1乙酸乙酯相、正丁醇相各0.1g，用10ml丙酮溶解作為樣品，對照組用10ml丙酮作同樣處理。

2.1.2.1拒食活性測定方法

實(shí)驗(yàn)方法同“2.1.1.1”拒食活性測定方法。

2.1.2.2觸殺毒力測定方法

實(shí)驗(yàn)方法同“2.1.1.2”觸殺毒力測定方法。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1瑞香狼毒莖葉及根粗提物的抗蟲活性

2.2.1.1瑞香狼毒莖葉及根粗提物對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲的拒食作用

由表1可以看出24h時(shí)，莖葉及根的粗提物對菜青蟲的平均拒食率達(dá)到最高，根粗提物對菜青蟲的平均拒食率為82.61%，莖葉粗提物對菜青蟲的平均拒食率為84.06%；4個處理組取食面積均與對照差異顯著。

由表2可以看出24h時(shí)，莖葉及根的粗提物對甜菜夜蛾幼蟲的平均拒食率達(dá)到最高，根粗提物對甜菜夜蛾幼蟲的平均拒食率為81.69%，莖葉粗提物對甜菜夜蛾幼蟲的平均拒食率為82.39%；4個處理組取食面積均與對照差異顯著。

由表1和表2可以得出，莖葉及根的粗提物對對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲都有很好的拒食作用，莖葉粗提物要好于根粗提物。

表1瑞香狼毒莖葉粗提物與根粗提物對菜青蟲的拒食作用

表2瑞香狼毒莖葉粗提物與根粗提物對甜菜夜蛾幼蟲的拒食作用

2.2.1.2瑞香狼毒莖葉及根粗提物對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲的觸殺作用

由表3可以看出，莖葉及根粗提物對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲的觸殺作用隨著時(shí)間的延長生物活性增強(qiáng)。72h后，莖葉及根粗提物對菜青蟲和甜菜夜蛾幼的校正死亡率都達(dá)到最高，根粗提物對菜青蟲和甜菜夜蛾幼的校正死亡率分別為100%和99.86%，莖葉粗提物分別為99.96%和100%。莖葉粗提物對菜青蟲、甜菜夜蛾幼的校正死亡率一直比及根粗提物的高。

綜上所述，莖葉及根的粗提物對對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲都有很好抗蟲作用，總體來說，莖葉粗提物要好于根粗提物。

表3瑞香狼毒莖葉粗提物與根粗提物對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲的觸殺作用

2.2.2瑞香狼毒莖葉及根粗提物不同分離相的抗蟲活性

2.2.2.1瑞香狼毒莖葉及根粗提物不同分離相對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲的拒食作用

由表4可以看出，24h后，各相對菜青蟲的拒食率達(dá)到最高。根乙酸乙酯相拒食率達(dá)到90.85%，莖葉乙酸乙酯相拒食率達(dá)到92.25%，根正丁醇相拒食率達(dá)到65.49%，莖葉正丁醇相拒食率達(dá)到69.72%。4個處理組取食面積均與對照差異顯著。

由表5可以看出，24h后，各相對甜菜夜蛾幼蟲的拒食率達(dá)到最高。根乙酸乙酯相拒食率達(dá)到90.41%，莖葉乙酸乙酯相拒食率達(dá)到92.47%，根正丁醇相拒食率達(dá)到65.07%莖葉正丁醇相拒食率達(dá)到68.49%。4個處理組取食面積均與對照差異顯著。

表4瑞香狼毒莖葉及根粗提物不同溶劑相對菜青蟲的拒食作用

表5瑞香狼毒莖葉及根粗提物不同溶劑相對甜菜夜蛾幼蟲的拒食作用

由表4和表5可以看出，相同濃度相同時(shí)間內(nèi)，瑞香狼毒莖葉及根粗提物的乙酸乙酯相的生物活性比正丁醇相高。

2.2.2.2瑞香狼毒莖葉及根粗提物不同分離相對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲的觸殺作用

由表6可以看出，乙酸乙酯相校正死亡率比正丁醇相高，生物活性強(qiáng)。

24h后，根乙酸乙酯相對菜青蟲和甜菜夜蛾幼的校正死亡率分別為71.86%和70.41%，莖葉乙酸乙酯相緊隨其后分別為73.58%和71.96%；根正丁醇相對菜青蟲和甜菜夜蛾幼的校正死亡率分別為50.51%和49.07%，莖葉正丁醇相的分別為52.46%，50.09%；48h后，各相生物活性進(jìn)一步增強(qiáng)，校正死亡率都有所增加；72h后，根，莖葉乙酸乙酯相對菜青蟲和甜菜夜蛾幼的校正死亡率都達(dá)到百分之百，根，莖葉正丁醇相也都達(dá)到了百分之九十以上。通過以上數(shù)據(jù)證明，相同濃度相同時(shí)間內(nèi)，乙酸乙酯萃取物對菜青蟲和甜菜夜蛾幼的觸殺活性最強(qiáng)，正丁醇萃取物活性較弱。

表6瑞香狼毒莖葉及根粗提物不同溶劑相對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲的觸殺作用

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莖葉與根提取物及其不同分離相對菜青蟲、甜菜夜蛾幼蟲均具有一定的抗蟲活性?？傮w來說，莖葉粗提物的抗蟲活性要好于根粗提物；相同濃度相同時(shí)間內(nèi)，瑞香狼毒莖葉及根粗提物的乙酸乙酯相的生物活性比正丁醇相高。

實(shí)施例3瑞香狼毒莖葉提取物抗枸杞蚜蟲作用

3.1.瑞香狼毒莖葉提取物對枸杞蚜蟲的抗蟲活性測定方法

3.1.1瑞香狼毒莖葉粗提物對枸杞蚜蟲的抗蟲活性測定方法

將所提取的瑞香狼毒莖葉的粗提物以及不同的分離相取一定量，用一定濃度的丙酮稀釋液稀釋，配置樣品溶液濃度分別為0.01，0.005，0.0025mg/ml。以丙酮作為對照組。

（1）觸殺毒力測定

根據(jù)張宗炳的方法，對所試蚜蟲進(jìn)行直接浸漬查看各組分的抗蟲效果。取一定大小的平皿，分別在底部鋪一層濾紙和一個大小一致的新鮮枸杞葉片，并用移液器加入1ml蒸餾水保持濕度。選取室內(nèi)飼養(yǎng)的3齡蚜蟲30頭，每一處理濃度為90頭。按照濃度由低到高的順序，分別將三齡蚜蟲放在紗布內(nèi)在預(yù)先配好的各供試樣品及對照液中中浸泡10s，取出瀝干，吸去藥液，置于準(zhǔn)備好的平皿中，蓋上蓋以防止蚜蟲爬失。

上述每個處理組均重復(fù)3次，置于(25±1)℃、相對濕度80%左右、光周期為l/d=16/8h的培養(yǎng)箱內(nèi)。每隔12h，檢查死亡與成活個數(shù)，計(jì)算死亡率，連續(xù)記錄72h。按照下列公式計(jì)算校正死亡率。

校正死亡率=（實(shí)驗(yàn)組蚜蟲死亡率-對照組蚜蟲死亡率）/（1-對照組蚜蟲死亡率）×100%

（2）內(nèi)吸毒力測定

采用先浸葉后接蟲的方法。將不經(jīng)藥物處理的且不含蚜蟲蟲卵的枸杞葉片，取大小一致，于配置好的藥液里浸泡15秒，取出晾干，放入處理好的含濾紙并濕潤的平皿中，每個皿中分別用毛筆移入室內(nèi)飼養(yǎng)的3齡蚜蟲30頭，每一處理濃度為90頭。重復(fù)三次試驗(yàn)。

3.1.2莖葉的乙酸乙酯相與莖葉正丁醇相對枸杞蚜蟲的抗蟲活性比較

將瑞香狼毒莖葉乙酸乙酯相與正丁醇相用丙酮稀釋，分別配置成濃度為0.01、0.005mg/ml的樣品溶液，以丙酮作為對照組。分別測定其觸殺毒力與內(nèi)吸毒力，方法同“3.1.1”。

3.2.結(jié)果與分析

3.2.1瑞香狼毒莖葉粗提物的抗蟲活性分析

3.2.1.1觸殺活性分析

通過浸蟲法研究莖葉粗提物對蚜蟲的防治效果發(fā)現(xiàn)，莖葉粗提物對蚜蟲具有明顯防治的效果，粗提物濃度與校正死亡率成正比，濃度越高，抗蟲活性越明顯；抗蟲活性具有明顯的時(shí)間依賴性（圖2）。

3.2.1.2內(nèi)吸活性分析

采用浸葉法對莖葉粗提物進(jìn)行枸杞蚜蟲的抗蟲活性研究顯示，不同粗提物濃度時(shí)，莖葉粗提物的抗蟲活性差異顯著，濃度越高，抗蟲活性越強(qiáng)；且其抗蟲活性具有一定的時(shí)間依賴性（圖3）。

3.2.2瑞香狼毒莖葉提取物不同分離相的抗蟲活性比較

3.2.2.1觸殺活性分析

通過上述兩個實(shí)驗(yàn)，選取濃度分別為0.01與0.005mg/ml的莖葉乙酸乙酯相與正丁醇相作為2個劑量進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示：莖葉乙酸乙酯相與正丁醇相濃度均達(dá)到0.01mg/ml時(shí)，莖葉乙酸乙酯相的抗蟲活性顯著；在莖葉乙酸乙酯相與正丁醇相濃度均為0.005mg/ml時(shí)，莖葉乙酸乙酯相的抗蟲活性略好于莖葉正丁醇相。結(jié)果表明，莖葉乙酸乙酯相與正丁醇相在相同濃度時(shí)，莖葉提取物的乙酸乙酯相抗蟲效果比正丁醇相顯著。

3.2.2.2內(nèi)吸活性

使用浸葉法對莖葉乙酸乙酯相與莖葉正丁醇相進(jìn)行枸杞蚜蟲的抗蟲活性研究，選用莖葉乙酸乙酯相與正丁醇相的濃度分別為0.01與0.005mg/ml兩個劑量進(jìn)行抗蟲活性比較，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)莖葉乙酸乙酯相與正丁醇相在相同濃度時(shí)，莖葉乙酸乙酯相處理組的抗蟲效果顯著高于莖葉正丁醇相，且抗蟲活性具有一定的時(shí)間依賴性。

本實(shí)驗(yàn)選用了瑞香狼毒莖葉粗提取物及其不同分離相分別進(jìn)行抗蟲實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行活性比較，研究表明，莖葉提取物及其不同分離相對枸杞蚜蟲均具有一定的抗蟲活性，莖葉乙酸乙酯相效果比正丁醇相要好，都具有一定的劑量時(shí)間依賴性。

以上所述僅是本專利的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本專利技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和替換，這些改進(jìn)和替換也應(yīng)視為本專利的保護(hù)范圍。