本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及雙膜法離體培養(yǎng)楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⑼馍婢采w系的方法。

背景技術(shù)：

大多數(shù)植物的根系能與共生真菌建立共生，其對(duì)植物獲取養(yǎng)分和發(fā)育至關(guān)重要。在北方和溫帶的森林中，最常見(jiàn)的根際共生是外生菌根（ectomycorrhizae,ecm），例如雙色蠟?zāi)ⅲ╨accariabicolor），即寄主植物的根和某些擔(dān)子菌和子囊菌物種的菌絲之間的一種動(dòng)態(tài)關(guān)系。真菌菌絲侵染寄主樹(shù)的側(cè)根（lateralroot,lr）頂端并形成ecm，這一種新的復(fù)合器官，是兩個(gè)共生體之間互惠互作的場(chǎng)所。

一些ecm由以下部分組成：（1）廣泛的可探測(cè)土壤的基質(zhì)外菌絲網(wǎng)絡(luò)；（2）一層聚集的菌絲即菌絲鞘在細(xì)根周圍形成鞘狀的儲(chǔ)藏室；（3）哈氏網(wǎng)，生長(zhǎng)在表皮和皮層細(xì)胞之間的菌絲網(wǎng)絡(luò)，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和碳水化合物交換的場(chǎng)所。ecm菌根形成包括寄主植物中一系列復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程，包括新側(cè)根的形成，寄主植物中的表皮細(xì)胞徑向擴(kuò)展，根毛衰減，以及根冠減小?？傊?，這些形態(tài)變化導(dǎo)致ecm的短根表型的特征，而在形態(tài)上的準(zhǔn)確變化因寄主植物而異。

雙色蠟?zāi)ⅲ╨accariabicolor）菌褶淺紫色至暗色，干后色變淺，直生至稍延生，等長(zhǎng)，厚，寬，邊沿稍呈波狀。秋季生針闊混交林地上，群生或散生。而楊樹(shù)是闊業(yè)落葉喬木,有主干,少旁枝,可作木料和生物能源用,或觀賞,由于生命力強(qiáng)，還可以用作種植防護(hù)林帶。隨著世界上對(duì)將來(lái)可再生能源的需求會(huì)越來(lái)越大，對(duì)楊樹(shù)的繁殖擴(kuò)陪和大規(guī)模種植的研究越來(lái)越多，于是相應(yīng)地，楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⒌墓采鷻C(jī)制研究也越來(lái)越深入。這樣迫切需要建立一種培養(yǎng)系統(tǒng)，以方便觀察研究，如可以方便組織切片﹑用激光共聚焦等觀察哈氏網(wǎng)（hartignet）﹑容易提取兩者的交換物質(zhì)，以及有利于無(wú)污染地從生物組織提取rna﹑dna及蛋白質(zhì)，該共生系統(tǒng)的建立對(duì)深入研究其共生的分子機(jī)制具有重要應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種雙膜法離體培養(yǎng)楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⑼馍婢采w系的方法的技術(shù)方案。

所述的雙膜法離體培養(yǎng)楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⑼馍婢采w系的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）楊樹(shù)插枝培養(yǎng)：楊樹(shù)插枝在含有吲哚丁酸的ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，再轉(zhuǎn)移到不含任何激素的ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至楊樹(shù)插枝底部形成2-3cm的根；

2）雙色蠟?zāi)⑴囵B(yǎng)：將外生菌根真菌雙色蠟?zāi)⒔臃N至覆蓋在p5培養(yǎng)基上的賽璐玢薄膜上培養(yǎng)直至長(zhǎng)出菌絲；

3）共生培養(yǎng)：將步驟1）得到的楊樹(shù)插枝轉(zhuǎn)移至覆蓋在p20培養(yǎng)基上的賽璐玢薄膜上，再取步驟2）得到的帶有雙色蠟?zāi)⒌馁愯寸惚∧っ娉禄虺戏旁诟?，用透氣的膠帶密封培養(yǎng)皿，用不透光材料遮蓋根系部分，然后在24℃,16h光照，8h無(wú)光照的條件下培養(yǎng)1-3星期，即可得到共生體系。

所述的雙膜法離體培養(yǎng)楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⑼馍婢采w系的方法，其特征在于所述的步驟1）中含有吲哚丁酸的ms培養(yǎng)基中含有：宏量元素50ml/l，微量元素100ml/l，葡萄糖1.0g/l，維生素10ml/l，iba溶液2ml/l，瓊脂粉10g/l，所述的iba溶液濃度為1mg/ml，所述的宏量元素含有硫酸鎂3.6mg/ml，硝酸鉀38mg/ml，磷酸二氫鉀3.4mg/ml，所述的微量元素含有硼酸62ug/ml，氯化鈷0.25ug/ml，硫酸銅0.25ug/ml，edta鈉鹽373ug/ml，硫酸亞鐵278ug/ml，硫酸錳169ug/ml，硫酸鋅86ug/ml，所述的維生素含有肌醇10.0mg/ml，煙酸0.1mg/ml，吡哆醇0.1mg/ml，硫胺素1.0mg/ml。

所述的雙膜法離體培養(yǎng)楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⑼馍婢采w系的方法，其特征在于所述的步驟2）中p5培養(yǎng)基含有：麥芽糖5g/l，酒石酸銨0.5g/l，kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，葡萄糖1.0g/l，營(yíng)養(yǎng)液1.0ml/l，維生素b11.0ml/l。

所述的雙膜法離體培養(yǎng)楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⑼馍婢采w系的方法，其特征在于所述的步驟1）中p20培養(yǎng)基中含有：酒石酸銨0.5g/l，kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，葡萄糖1.0g/l，營(yíng)養(yǎng)液1.0ml/ml，維生素b11.0ml/l，mes鈉鹽1g/l，瓊脂20g/l，用0.25mol/l的koh溶液調(diào)ph至5.8。

所述的雙膜法離體培養(yǎng)楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⑼馍婢采w系的方法，其特征在于所述的營(yíng)養(yǎng)液含有鐵離子6.0mg/ml，鋅離子2.0mg/ml，銅離子0.6mg/ml，錳離子5.0mg/ml，硼酸8.0mg/ml。

通過(guò)本發(fā)明建立的系統(tǒng)能夠方便觀察研究，如可以方便組織切片﹑用激光共聚焦等觀察哈氏網(wǎng)（hartignet）﹑容易無(wú)污染提取兩者的小分子交換物質(zhì)，以及有利于無(wú)污染地從生物組織提取rna﹑dna及蛋白質(zhì)，該共生系統(tǒng)的建立對(duì)深入研究其共生的分子機(jī)制具有重要應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1.通過(guò)本發(fā)明建立的共生體系易于觀察、追蹤、拍照和分析根系菌根的發(fā)育。

2.根能與之前單獨(dú)生長(zhǎng)在賽璐玢膜上的外生菌根真菌直接或間接接觸，并且在此培養(yǎng)期間可以觀察菌根的發(fā)育情況。

3.間接接觸允許信號(hào)分子互換，同時(shí)避免了兩個(gè)物種間的直接接觸，從而如果需要從一個(gè)生物提取rna/dna/蛋白質(zhì)，則提取物就不會(huì)被另一個(gè)生物組織污染。

4.將一種吸附介質(zhì)（雙層，3×4cm賽璐玢膜）被運(yùn)用到植物和真菌之間，能夠吸附，提取和分析兩種生物之間交換的分子。

附圖說(shuō)明

圖1為雙色蠟?zāi)⒔臃N于賽璐玢膜的示意圖；

圖2為楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⒕木采w系圖；

圖3為激光共聚焦觀察楊樹(shù)和雙色蠟?zāi)⒐采臒晒馊旧鋬銮衅?/p>

圖4菌根真菌rna提取的濃度和質(zhì)量（rqi）。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1：楊樹(shù)插枝的培養(yǎng)

（1）ms培養(yǎng)基的制備；每升培養(yǎng)基中宏量元素50毫升（宏量元素含有硫酸鎂3.6mg/ml，硝酸鉀38mg/ml，磷酸二氫鉀3.4mg/ml），微量元素100毫升（微量元素含有硼酸62ug/ml，氯化鈷0.25ug/ml，硫酸銅0.25ug/ml，edta鈉鹽373ug/ml，硫酸亞鐵278ug/ml，硫酸錳169ug/ml，硫酸鋅86ug/ml），葡萄糖1克，維生素10毫升（維生素含有肌醇10.0mg/ml,煙酸0.1mg/ml，吡哆醇0.1mg/ml，硫胺素1.0mg/ml），iba溶液2毫升?；旌线@些元素，調(diào)節(jié)ph至5.5，加瓊脂粉10克，滅菌121°c，20分鐘。冷卻后，倒入培養(yǎng)皿，備用。

其中iba溶液的制備：稱iba50mg于離心管中，滴加幾滴100%的乙醇溶液使其溶解，加超純水至50ml。在無(wú)菌工作臺(tái)上用22um的過(guò)濾器過(guò)濾，等分并置于暗處4℃下保存，使用前15min從冰箱拿出（iba在低溫下會(huì)結(jié)晶）。

（2）楊樹(shù)外植體的移植

用試管中培養(yǎng)好的大約10cm長(zhǎng)的楊樹(shù)，將其從試管中拿出并將其放在無(wú)菌的磚上（經(jīng)過(guò)高壓滅菌的，整個(gè)操作過(guò)程是在層流工作臺(tái)中進(jìn)行）。剪去所有葉子并在節(jié)間剪取大約1-2cm作外植體。

將大約25個(gè)楊樹(shù)插枝以45°插入含有iba的固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用封口膜封好后放在生化培養(yǎng)箱中（24℃，16小時(shí)光照）培養(yǎng)5-7天。拿出插枝，轉(zhuǎn)移到不含iba的ms培養(yǎng)基中（同在iba培養(yǎng)基中一樣，將插枝插入到培養(yǎng)基中）。在不含iba的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)星期后形成2-3cm的根。

實(shí)施例2：在含p5培養(yǎng)基的賽璐玢膜上培養(yǎng)雙色蠟?zāi)⒄婢?/p>

在楊樹(shù)與外生菌根真菌建立聯(lián)系前10天，將外生菌根真菌雙色蠟?zāi)⒔臃N至覆蓋在p5培養(yǎng)基上的賽璐玢薄膜上培養(yǎng)直至長(zhǎng)出菌絲。在p5培養(yǎng)基上接種雙色蠟?zāi)ⅲ?i>laccariabicolor），約12個(gè)接種點(diǎn)。p5培養(yǎng)基成分：其中每升含有麥芽糖5克，酒石酸銨0.5克，kh2po41.0克，mgso4·7h2o0.5克，葡萄糖1.0克，營(yíng)養(yǎng)液1.0毫升（營(yíng)養(yǎng)液含有鐵離子6.0mg/ml,鋅離子2.0mg/ml,銅離子0.6mg/ml，錳離子5.0mg/ml，硼酸8.0mg/ml），維生素b11.0毫升。培養(yǎng)皿用膠帶密封，水平放置到真菌培養(yǎng)室。10天內(nèi)培養(yǎng)皿被蠟?zāi)⒕z完全覆蓋。如圖1所示在干燥培養(yǎng)基上蓋上一層賽璐玢膜，接種雙色蠟?zāi)?。?星期后長(zhǎng)出菌絲，備用。

實(shí)施例3：楊樹(shù)根與蠟?zāi)⒕z建立聯(lián)系

準(zhǔn)備新鮮的p20培養(yǎng)基，其中每升培養(yǎng)基中含有酒石酸銨0.5克，kh2po41.0克，mgso4·7h2o0.5克，葡萄糖1.0克，營(yíng)養(yǎng)液1.0毫升（營(yíng)養(yǎng)液含有鐵離子6.0mg/ml,鋅離子2.0mg/ml,銅離子0.6mg/ml，錳離子5.0mg/ml，硼酸8.0mg/ml），維生素b11.0毫升。培養(yǎng)基中含有1g/lmes鈉鹽并在滅菌前調(diào)ph至5.8（蠟?zāi)⒎置诙喾N有機(jī)酸會(huì)酸化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入mes緩沖液有利于穩(wěn)定ph以避免植物產(chǎn)生脅迫反應(yīng)）。p20培養(yǎng)基的準(zhǔn)備方法如下：用0.25mol/l的koh溶液調(diào)ph至5.8，向溶液中加入20g/l的瓊脂并滅菌。滅菌干燥后在p20培養(yǎng)基上覆蓋賽璐玢膜。

將實(shí)施例1得到的生根的楊樹(shù)插枝轉(zhuǎn)移到p20培養(yǎng)基的賽璐玢膜上，從ms瓊脂培養(yǎng)基中將它們?nèi)〕鰰r(shí)要小心以避免帶有瓊脂。

取實(shí)施例2制得的雙色蠟?zāi)ⅲ╨accaria）覆蓋的賽璐玢膜，將帶有雙色蠟?zāi)ⅲ╨accaria）的一面朝下放在植物根上（建立直接聯(lián)系）或?qū)⑵鋷в邢災(zāi)⒌囊幻娉戏旁诟希绱酥参锊恢苯咏佑|真菌（間接聯(lián)系）。當(dāng)建立直接聯(lián)系，建議用銳刀片取下接種塞，因?yàn)槠涓蓴_一個(gè)有效，全面的直接接觸，在間接聯(lián)系中，接種塞沒(méi)有影響。

在培養(yǎng)基頂部和底部用封口膜密封，側(cè)面用更具滲透力的醫(yī)用雙面膠帶（繃帶）封住。用一個(gè)剪過(guò)的，小的黑色塑料袋蓋住培養(yǎng)皿（根生長(zhǎng)的地方）底部的一半并粘合（菌根生長(zhǎng)在缺少光照的條件下）。將培養(yǎng)皿垂直放在培養(yǎng)室中（在植物生長(zhǎng)室24℃，16小時(shí)光照）。1-2個(gè)星期后可觀察到哈氏網(wǎng)的形成，說(shuō)明了菌根共生體系的建立（圖2）。如圖3所示，對(duì)共生菌根進(jìn)行冷凍切片，用wga-alexa488熒光染色真菌菌絲（灰色），發(fā)現(xiàn)菌絲用菌絲鞘包裹植物根（如21,35天圖示），并且侵入根細(xì)胞之間；用碘化丙啶（propidiumiodide）熒光染色菌根組織發(fā)現(xiàn)了經(jīng)過(guò)3-7天共培養(yǎng)建立了哈氏網(wǎng)。如圖4所示，利用該系統(tǒng)培養(yǎng)的菌根組織rna質(zhì)量經(jīng)過(guò)bio-radexperion分析其rqi（rnaqualityindex）達(dá)到9.4，完全符合分子實(shí)驗(yàn)分析的高標(biāo)準(zhǔn)要求。