本發(fā)明涉及魚類的人工性別控制技術(shù)，屬于魚類遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種泥鰍偽雄魚的生產(chǎn)方法，應(yīng)用于規(guī)?；颇圉q苗種生產(chǎn)。

背景技術(shù)：

泥鰍肉味鮮美，營養(yǎng)價(jià)值高，市場前景廣闊，是淡水養(yǎng)殖的重要魚類。在相同的養(yǎng)殖條件下，雌性泥鰍比同胞雄魚的生長快、增重量大。養(yǎng)殖全雌泥鰍將顯著提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。

在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，可采用xx♀普通雌魚和xx♂偽雄魚（遺傳上雌性、生理上雄性）人工授精，規(guī)模化繁殖獲得單性雌魚。而獲得xx♂偽雄魚有幾種方法可供選擇：如溫度控制、雄性激素直接誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)、雌核發(fā)育和雄性激素誘導(dǎo)相結(jié)合等，每種魚類采用不同的方法導(dǎo)致的成活率和性逆轉(zhuǎn)率均不相同。目前關(guān)于泥鰍獲得偽雄魚的方法有雌核發(fā)育結(jié)合雄性激素性逆轉(zhuǎn)，但是成活率和性逆轉(zhuǎn)率無法同時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài)（劉同明等，2004）；也有學(xué)者通過溫度控制泥鰍的性腺分化，在30℃以上雄性率僅達(dá)到86%-90%（南平等，2007；陳玉紅等，2007），無法應(yīng)用于全雌魚規(guī)模化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有泥鰍偽雄魚生產(chǎn)的成活率和性逆轉(zhuǎn)率無法同時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài)的問題。

為此，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種泥鰍偽雄魚的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：

1)孵化：選擇正常人工授精的泥鰍受精卵，置于24～26℃水溫中孵化；

2)溫度調(diào)控性逆轉(zhuǎn)：泥鰍魚苗孵化出膜后，泥鰍魚苗生殖嵴形成前將水溫逐漸升高至27～32℃，并在此水溫條件下培育泥鰍魚苗至幼魚；

3)雄性激素調(diào)控性逆轉(zhuǎn)：泥鰍魚苗孵化出膜后先采用蛋黃或輪蟲作為開口餌料，再采用雄性激素溶液處理后的鹵蟲幼體和顆粒飼料混合逐漸過渡法連續(xù)投喂60～80天；

4)正常飼養(yǎng)：經(jīng)步驟2)和步驟3)雙重調(diào)控性逆轉(zhuǎn)處理后，將水溫調(diào)整至正常水溫，并投喂未經(jīng)雄性激素溶液處理的顆粒飼料，轉(zhuǎn)為正常飼養(yǎng)至可按胸鰭形狀區(qū)分雌雄時(shí)剔除xx♀雌魚，保存xx♂生理雄魚、xy♂雄魚備用；

5)測交：將xx♂生理雄魚、xy♂雄魚飼養(yǎng)至性成熟，然后分別與xx♀雌魚交配，親本和得到的魚苗均分開飼養(yǎng)，魚苗養(yǎng)至2～3個(gè)月，通過魚苗雄性率檢測方法篩選出子代為100%xx♀雌魚的群體，其父本即為xx♂偽雄魚。

進(jìn)一步的，所述步驟2)中水溫升高速度為每天水溫升高0.5～1.5℃，5天水溫升至27～32℃。

進(jìn)一步的，所述步驟3)中采用雄性激素溶液處理后的鹵蟲幼體和顆粒飼料混合逐漸過渡法連續(xù)投喂的具體過程如下：泥鰍魚苗出膜后第8～28天，用雄性激素溶液處理后的鹵蟲幼體投喂，每天投喂4次，每次相隔6小時(shí)；出膜后第29～30天，用雄性激素溶液處理后的鹵蟲幼體和雄性激素溶液處理后的飼料混合投喂，每天投喂4次，每次相隔6小時(shí)；之后用雄性激素溶液處理后的飼料投喂，每天投喂3次。

進(jìn)一步的，所述雄性激素溶液處理后的鹵蟲幼體是采用將鹵蟲幼體先在150～300iu的甲基睪丸酮中浸泡1小時(shí)；雄性激素溶液處理后的飼料是將甲基睪丸酮用酒精溶解后噴灑在顆粒飼料上晾干。

進(jìn)一步的，所述顆粒飼料中甲基睪丸酮含量為1kg顆粒飼料含有20～40mg甲基睪丸酮。

進(jìn)一步的，所述雄性激素溶液處理后的鹵蟲幼體和飼料混合投喂時(shí)，兩者的質(zhì)量比依次按7:1、3:1、5:3、1:1、3:5、1:3、1:7逐漸投喂。

進(jìn)一步的，所述雄性激素溶液處理后的飼料投喂時(shí)每天上午、中午和下午各投喂一次，投喂量以30分鐘內(nèi)吃完為準(zhǔn)。

進(jìn)一步的，所述步驟5)中魚苗雄性率檢測方法具體過程如下：往泥鰍腹腔內(nèi)注射由甲醇和冰乙酸按質(zhì)量比3:1配制的固定液，解剖泥鰍之后在解剖鏡下或肉眼觀察區(qū)分雄魚或雌魚，呈細(xì)線狀，兩條性腺均勻的分布在體內(nèi)兩側(cè)為雄性泥鰍的精巢，比精巢粗大，呈塊狀，兩塊性腺連在一起為雌性泥鰍的卵巢。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明提供的這種泥鰍偽雄魚的生產(chǎn)方法通過溫度和雄性激素共同作用調(diào)控性逆轉(zhuǎn)，泥鰍魚苗的成活率達(dá)到70%以上，性逆轉(zhuǎn)率達(dá)到97%以上，同時(shí)，相較于現(xiàn)有的雌核發(fā)育結(jié)合雄性激素性逆轉(zhuǎn)，降低了人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育對(duì)受精卵遺傳物質(zhì)的損傷，提高了偽雄魚雌魚的獲得率。

(2)本發(fā)明提供的這種泥鰍偽雄魚的生產(chǎn)方法在雄性激素調(diào)控性逆轉(zhuǎn)時(shí)采用雄性激素溶液處理后的鹵蟲幼體和飼料混合逐漸過渡的方法進(jìn)行投喂，避免長期只服用雄性激素溶液處理的鹵蟲幼體可能會(huì)出現(xiàn)營養(yǎng)不良現(xiàn)象，提高了泥鰍魚苗的成活率。

(3)本發(fā)明提供的這種泥鰍偽雄魚的生產(chǎn)方法中魚苗雄性率檢測方法相較于現(xiàn)有的魚苗或性腺用波恩氏液固定，做石蠟切片，染色觀察而言，操作簡單、成本低，可在魚苗場現(xiàn)場完成，適用范圍廣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明泥鰍偽雄魚的生產(chǎn)方法的步驟流程方框圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本實(shí)發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

如圖1所示，本實(shí)施例提供了一種泥鰍偽雄魚的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：

1)孵化：選擇正常人工授精的泥鰍受精卵，置于24～26℃水溫中孵化。

2)溫度調(diào)控性逆轉(zhuǎn)：泥鰍魚苗孵化出膜后，泥鰍魚苗生殖嵴形成前將水溫逐漸升高至27～32℃，并在此水溫條件下培育泥鰍魚苗至幼魚。

由于23～25℃水溫條件下，泥鰍魚苗在出膜后第25天左右卵巢開始分化，出膜后33天左右精巢開始分化。而溫度的高低也影響性腺分化的時(shí)間，水溫越高，pgcs(生殖細(xì)胞)遷移進(jìn)入生殖嵴的時(shí)間越早，27～32℃水溫條件下，出膜后10天的魚苗生殖嵴已經(jīng)形成，并有少量pgcs遷移進(jìn)入生殖嵴，pgcs進(jìn)入生殖嵴后，原始性腺逐漸開始分化，隨后發(fā)育成為精巢或卵巢。因此，在上述培育水溫條件下，誘導(dǎo)泥鰍性逆轉(zhuǎn)的有效起始時(shí)間應(yīng)該為孵化后10天之前(即魚苗生殖嵴形成前)，本實(shí)施例中優(yōu)選水溫升高速度為每天水溫升高0.5～1.5℃，5天水溫升至27～32℃。而水溫的升高可使泥鰍魚苗的芳香化酶的活性受到抑制，不能催化睪酮轉(zhuǎn)化成雌二醇（雌激素），從而阻止了泥鰍幼魚向雌性分化，提高泥鰍魚苗的雄性率。

3)雄性激素調(diào)控性逆轉(zhuǎn)：泥鰍魚苗孵化出膜后先采用蛋黃或輪蟲作為開口餌料，再采用雄性激素溶液處理后的鹵蟲幼體和顆粒飼料混合逐漸過渡法連續(xù)投喂60～80天。

在溫度調(diào)控性逆轉(zhuǎn)的同時(shí)，首先泥鰍魚苗孵化出膜后3天采用蛋黃或輪蟲作為開口餌料進(jìn)行開口，之后泥鰍魚苗出膜后第8～28天，采用甲基睪丸酮浸泡后的鹵蟲幼體投喂，每天投喂4次，每次相隔6小時(shí)；出膜后第29～30天，用甲基睪丸酮浸泡后鹵蟲幼體和噴灑甲基睪丸酮的飼料依次按兩者質(zhì)量比7:1、3:1、5:3、1:1、1:1、3:5、1:3、1:7進(jìn)行投喂，每天投喂4次，每次相隔6小時(shí)；之后用噴灑甲基睪丸酮的飼料進(jìn)行投喂，每天7:00、12:00、18:00投喂3次，投喂量以30分鐘內(nèi)吃完為準(zhǔn)。其中，甲基睪丸酮浸泡鹵蟲幼體具體是將鹵蟲幼體先在150～300iu的甲基睪丸酮（mt）中浸泡1小時(shí)，再抽濾取出富集雄性激素的鹵蟲幼體投喂泥鰍魚苗；而噴灑了甲基睪丸酮的飼料是將甲基睪丸酮用酒精溶解后噴灑在顆粒飼料上晾干后再投喂泥鰍魚苗，含量為1kg顆粒飼料含有20～40mgmt。

本實(shí)施例中先用雄性激素浸泡鹵蟲幼體投喂，是因?yàn)槟圉q開口后口徑較小，沒有適合的顆粒飼料，而由于浸泡了雄性激素的鹵蟲幼體可能存在部分死亡現(xiàn)象，后期泥鰍的營養(yǎng)需求也不一樣，長期只服用浸泡了雄性激素的鹵蟲幼體的泥鰍可能會(huì)出現(xiàn)營養(yǎng)不良現(xiàn)象，影響泥鰍成活率，因此，本實(shí)施例用浸泡了雄性激素的鹵蟲幼體先投喂一段時(shí)間，再慢慢過渡到噴灑雄性激素的顆粒飼料，同時(shí)，在泥鰍魚苗轉(zhuǎn)食過程中，采用雄性激素的鹵蟲幼體和噴灑雄性激素的飼料混合進(jìn)行逐漸過渡的方法，使泥鰍魚苗逐漸適應(yīng)飼料的轉(zhuǎn)換，可有效提高泥鰍魚種的成活率，且通過實(shí)驗(yàn)表明，一直使用浸泡了雄性激素的鹵蟲幼體投喂的泥鰍魚苗的成活率不超過60%，中間直接將浸泡了雄性激素的鹵蟲幼體轉(zhuǎn)換為噴灑雄性激素的飼料進(jìn)行投喂，不經(jīng)過鹵蟲幼體和飼料混合過渡，泥鰍魚苗轉(zhuǎn)食的成功率很低，泥鰍魚苗的成活率不超過20%。

另外通過實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)步驟2)和步驟3)的溫度和雄性激素雙重調(diào)控性逆轉(zhuǎn)處理后，泥鰍魚苗的成活率達(dá)到70%以上，性逆轉(zhuǎn)率達(dá)到97%以上；而采用單一溫度調(diào)控性逆轉(zhuǎn)培育泥鰍魚苗的性逆轉(zhuǎn)率小于90%，單一采用雄性激素調(diào)控性逆轉(zhuǎn)培育泥鰍魚苗的成活率小于60%。

4)正常飼養(yǎng)：經(jīng)步驟2)和步驟3)雙重調(diào)控性逆轉(zhuǎn)處理后，將水溫調(diào)整至正常水溫（22～25℃），并投喂未經(jīng)雄性激素溶液處理的顆粒飼料，轉(zhuǎn)為正常飼養(yǎng)至可按胸鰭形狀區(qū)分雌雄時(shí)剔除xx♀雌魚，保存xx♂生理雄魚、xy♂雄魚備用。

5)測交：將xx♂生理雄魚、xy♂雄魚飼養(yǎng)至性成熟，然后分別與xx♀雌魚交配，親本和得到的魚苗均分開飼養(yǎng)，魚苗養(yǎng)至2～3個(gè)月，通過魚苗雄性率檢測方法篩選出子代為100%xx♀雌魚的群體，其父本即為泥鰍xx♂偽雄魚。

本實(shí)施例中魚苗雄性率檢測方法：往泥鰍腹腔內(nèi)注射由甲醇和冰乙酸按質(zhì)量比3:1配制的固定液后，其精巢或卵巢會(huì)逐漸變白，解剖之后在解剖鏡下或肉眼觀察，區(qū)分雄魚或雌魚：一般雄性泥鰍的精巢呈細(xì)線狀，兩條性腺均勻的分布在體內(nèi)兩側(cè)，而雌性泥鰍的卵巢相對(duì)來說要比精巢粗大，呈塊狀，左右兩塊卵巢連在一起。該魚苗雄性率檢測方法相較于現(xiàn)有的常規(guī)方法將魚苗或性腺用波恩氏液固定，做石蠟切片，染色觀察而言，操作簡單、成本低，在魚苗場即可完成。

另外，將本實(shí)施例生產(chǎn)確認(rèn)的泥鰍偽雄魚通過擴(kuò)群和建立全雌泥鰍繁育種群即可規(guī)模化生產(chǎn)全雌泥鰍，具體過程如下：

擴(kuò)群：取上述篩選出的xx♂偽雄魚與xx♀雌魚1:1人工授精產(chǎn)生100%xx♀雌魚苗，取二分之一的xx♀雌魚苗按上述步驟2)和步驟3)結(jié)合溫度和雄性激素共同調(diào)控性逆轉(zhuǎn)成為xx♂偽雄魚，剩下的xx♀雌魚苗繼續(xù)養(yǎng)殖。其中優(yōu)選的，將不同家系全雌泥鰍在相同的養(yǎng)殖條件下養(yǎng)殖，進(jìn)行生長對(duì)比，選擇生長速度快的家系用于全雌泥鰍繁育種群的建立。

全雌泥鰍繁育種群的建立：取經(jīng)擴(kuò)群得到的同一家系的xx♀雌魚和xx♂偽雄魚交配，其繁殖的子代為100％xx♀雌魚，通過普通養(yǎng)殖方式即可規(guī)?；@得全雌泥鰍。

綜上所述，本發(fā)明提供的這種泥鰍偽雄魚的生產(chǎn)方法通過溫度和雄性激素共同作用調(diào)控性逆轉(zhuǎn)，使得泥鰍魚苗的成活率和性逆轉(zhuǎn)率可同時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài)，進(jìn)而可用于規(guī)?；a(chǎn)全雌泥鰍。

以上例舉僅僅是對(duì)本發(fā)明的舉例說明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍的限制，凡是與本發(fā)明相同或相似的設(shè)計(jì)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。