本發(fā)明屬生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種能實(shí)現(xiàn)在常溫條件下對(duì)流產(chǎn)組織進(jìn)行保存和運(yùn)輸且對(duì)后續(xù)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響的生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：從生物組織中提取到的dna在疾病檢測(cè)及治療、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。但由于生物組織樣品離體后，其dna很容易降解；質(zhì)量差的生物組織對(duì)于后續(xù)科研、檢測(cè)工作的重要性就會(huì)大大降低，或者毫無(wú)作用，甚至起誤導(dǎo)作用。近年來(lái)，對(duì)流產(chǎn)組織提取的dna進(jìn)行基因檢測(cè)，從而查找流產(chǎn)、死胎、b超異常、多發(fā)畸形胎兒的遺傳原因，對(duì)遺傳疾病的防治具有重要意義。但從新鮮流產(chǎn)組織中提取dna時(shí)，樣品若不能馬上處理，通常需要立即保存于液氮，而液氮和超低溫冰箱并不能普及到每個(gè)實(shí)驗(yàn)室或者醫(yī)院，并且液氮和超低溫冰箱的維護(hù)也需要較高的費(fèi)用。另外，液氮雖然可以解決保存問(wèn)題，但仍然無(wú)法有效解決樣品的運(yùn)輸問(wèn)題。目前多使用干冰對(duì)樣品進(jìn)行保存，再進(jìn)行異地運(yùn)輸，該方法運(yùn)輸條件要求高、成本高，存在采樣、運(yùn)輸過(guò)程復(fù)雜，不利于新鮮樣品的采樣等問(wèn)題。有鑒于此，確有必要提供一種安全的、能實(shí)現(xiàn)在常溫條件下對(duì)流產(chǎn)組織進(jìn)行保存和運(yùn)輸且對(duì)后續(xù)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響的生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有生物組織保存和運(yùn)輸時(shí)存在的缺陷，提供一種安全的、能實(shí)現(xiàn)在常溫條件下對(duì)流產(chǎn)組織進(jìn)行保存和運(yùn)輸且對(duì)后續(xù)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響的生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑，其ph值為6～8，包括：氯化鋰0.3～3mol/l，tris-hcl5～50mmol/l，尿素0.1～0.3mol/l，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.5～5％的sds，edta1～10mmol/l，體積分?jǐn)?shù)為10～90％的乙醇。作為本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑的一種改進(jìn)，所述生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑的ph值為8，包括：氯化鋰0.71mol/l，tris-hcl30mmol/l，尿素0.71mol/l，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.5％的sds，edta3.6mmol/l，體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇。本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑中，乙醇、尿素和sds為抑菌劑和蛋白質(zhì)變性劑，可有效抑制常溫下生物組織中的微生物滋生和繁殖；edta作為螯合劑，可以螯合鎂離子等核酸酶的激活劑，從而抑制核酸酶對(duì)dna的降解作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)dna的有效保護(hù)；氯化鋰作為還原劑，可以中和生物組織保存時(shí)的一些氧化劑的作用，避免產(chǎn)生微生物滋生繁殖的環(huán)境；tris-hcl作為緩沖溶液，可以維持生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑的ph值在8左右。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備方法，包括如下步驟：(1)按照用量稱量生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑的各組分后，將各組分混合攪拌定容；(2)調(diào)節(jié)溶液的ph值；(3)過(guò)濾除菌，得到生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑。作為本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備方法的一種改進(jìn)，步驟(1)中，所述定容是使用去離子水進(jìn)行定容。作為本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備方法的一種改進(jìn)，步驟(2)中，所述調(diào)節(jié)溶液的ph值是使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)。作為本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備方法的一種改進(jìn)，步驟(3)中，所述過(guò)濾除菌是使用40微米微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌。本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑可用于穩(wěn)定保護(hù)離體生物組織，特別是用于保護(hù)非冷凍狀態(tài)下的離體生物組織dna的完整性；其中，生物組織可以是人流產(chǎn)組織。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑是一種無(wú)毒液體，可迅速穩(wěn)定離體的生物組織，并能長(zhǎng)期保持生物組織中dna的完整性，有效避免生物組織中微生物的滋生。(2)本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑可以不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制，及時(shí)收集生物組織樣本，且無(wú)需將其置于液氮中冷凍或立即放冰箱冷凍，大大提高了生物組織樣品收集的可操作性。(3)本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑可對(duì)浸入其中的生物組織實(shí)現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的常溫保存，因此可在常溫條件下對(duì)流產(chǎn)組織進(jìn)行運(yùn)輸，降低了成本且對(duì)后續(xù)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療等多個(gè)領(lǐng)域的生物檢測(cè)中，具有很好的推廣應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用以及有益效果進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。圖1為實(shí)施例對(duì)比實(shí)驗(yàn)的dna提取電泳圖，其中，m泳道為dl2000marker，1號(hào)泳道為樣本1實(shí)驗(yàn)組，2號(hào)泳道為樣本1對(duì)照組，3號(hào)泳道為樣本2實(shí)驗(yàn)組，4號(hào)泳道為樣本2對(duì)照組。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益技術(shù)效果更加清晰，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，本說(shuō)明書中描述的實(shí)施例僅僅是為了解釋本發(fā)明，并非為了限定本發(fā)明，實(shí)施例的參數(shù)、比例等可因地制宜做出選擇而對(duì)結(jié)果并無(wú)實(shí)質(zhì)性影響。實(shí)施例生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑包括如下組分和含量：氯化鋰0.71mol/l，tris-hcl30mmol/l，尿素0.71mol/l，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.5％的sds，edta3.6mmol/l，體積分?jǐn)?shù)為30％的乙醇，溶液ph值8。生物組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備：(1)分別稱去氯化鋰1.42g和尿素2.01g，依次置于燒杯內(nèi)，稱量過(guò)程要迅速避免樣品受潮。(2)分別稱取edta(0.5m)330μl，sds(10％)3ml，tris-hcl1.65ml，依次倒入燒杯中，攪拌均勻，用去離子水定容至50ml。(3)用一次性40微米微孔濾膜裝置對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾，然后保存在儲(chǔ)液瓶?jī)?nèi)。(4)用naoh對(duì)溶液進(jìn)行ph調(diào)整，將ph調(diào)至8，室溫保存?zhèn)溆?。?duì)比例獲取流產(chǎn)組織作為樣本，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。取兩份流產(chǎn)組織(樣本1和樣本2)，后續(xù)需進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)其是否存有染色體異常。切取樣本1，將其分成兩份，每份為0.5cm3大小的組織塊，其中一份作為樣本1的實(shí)驗(yàn)組，放入實(shí)施例1制得的生物組織穩(wěn)定保存液中，在常溫條件下運(yùn)輸；另一份作為樣本1的對(duì)照組，采用干冰保存并在干冰條件下運(yùn)輸；切取樣本2，將其分成兩份，每份為0.5cm3大小的組織塊，其中一份作為樣本2的實(shí)驗(yàn)組，放入實(shí)施例1制得的生物組織穩(wěn)定保存液中，在常溫條件下運(yùn)輸；另一份作為樣本2的對(duì)照組，采用干冰保存并在干冰條件下運(yùn)輸。運(yùn)輸10天后，分別對(duì)各組進(jìn)行核酸提取。(1)按照常規(guī)方法對(duì)dna進(jìn)行提取，如可利用magen公司的tissuednakfkit進(jìn)行dna提取。(2)用瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行dna檢測(cè)。(3)從dna提取結(jié)果上看(請(qǐng)參見(jiàn)圖1)，干冰保存運(yùn)輸?shù)臉颖?和樣本2的實(shí)驗(yàn)組2、4泳道與本發(fā)明常溫生物組織穩(wěn)定保存液保存的樣本1、3的實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果無(wú)差異，dna條帶清晰。說(shuō)明使用本實(shí)施例制備的生物組織1號(hào)、2號(hào)樣本穩(wěn)定保存液可以穩(wěn)定保存流產(chǎn)組織等生物組織，并實(shí)現(xiàn)生物組織的常溫異地運(yùn)輸，且dna完整性較好。(4)取300ng基因組dna構(gòu)建插入片段300bp的文庫(kù)，進(jìn)行平臺(tái)測(cè)序。(5)取300ng基因組dna進(jìn)行打斷，打斷體系及反應(yīng)條件如表1。表1試劑名稱用量10×fragmentasereactionbufferv22.5μl10×fragmentase2.5μldna300ng酶反應(yīng)37℃20min，65℃15min(6)采用如下體系對(duì)上述片段進(jìn)行末端修復(fù)(表2)。表2試劑名稱用量dna40ng末端修復(fù)緩沖液5μl末端修復(fù)酶5μlte補(bǔ)齊至50μl酶反應(yīng)37℃10min，65℃15min(7)采用如下反應(yīng)體系對(duì)上述片段進(jìn)行pcr接頭連接(表3)。表3(8)采用如下反應(yīng)體系對(duì)上述片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增(表4)。表4(9)上機(jī)測(cè)序，測(cè)序讀段對(duì)(reads)經(jīng)過(guò)過(guò)濾處理后，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到相應(yīng)的染色體異常結(jié)果，分析結(jié)果如表5所示。表5根據(jù)上述說(shuō)明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏托薷?。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。此外，盡管本說(shuō)明書中使用了一些特定的術(shù)語(yǔ)，但這些術(shù)語(yǔ)只是為了方便說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。當(dāng)前第1頁(yè)12