本發(fā)明涉及組織細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干細胞(stemcell)是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據(jù)干細胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞(專能干細胞)。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細胞”。在腦、脊髓等所有神經(jīng)組織中，不同的神經(jīng)干細胞類型產(chǎn)生的子代細胞種類不同，分布也不同。雖然該細胞利用廣泛，但要廣泛地應(yīng)用于臨床治療領(lǐng)域，其來源和數(shù)量仍遠遠不能滿足需求。因此神經(jīng)干細胞的體外大規(guī)模擴增，以及將擴增后的細胞進行冷凍保存，是本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切的需求。
白血病是危害人類的重要的腫瘤之一，在白血病治療和研究中，對于白血病干細胞的瞬時需求量很大，而傳統(tǒng)的分離方法不可能馬上獲得，因此，批量貯存，一起取出應(yīng)用是必要的，但是常規(guī)的貯存方法效果不好，而冷凍的方法卻有很大的局限性。這是因為細胞凍存的過程會顯著改變細胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，同時伴隨生物性損傷的危險。影響凍存效率的因素主要有：細胞濃度、冷凍速率以及凍存液。目前，干細胞凍存使用的凍存液有含血清和無血清的兩類，由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價格昂貴等缺點，無血清凍存和復(fù)蘇技術(shù)成為發(fā)展趨勢。低溫保存干細胞主要依靠抗凍液二甲基亞砜(dmso)和血清的保護。常用到的細胞保護劑還有羥乙基淀粉0es)、聚乙二醇(peg)等。但是，dmso會對細胞產(chǎn)生毒性作用，對凍存的干細胞造成不可逆的損傷。為獲得來源方便的干細胞，開展有效的干細胞凍存方法是本領(lǐng)域迫切的需求，建立一種長期低溫保存干細胞的方法對于促進神經(jīng)干細胞的研宄和應(yīng)用具有重大意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種細胞冷凍保存液以及相應(yīng)的制備方法及使用方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種細胞冷凍保存液，其特征在于由如下各組分組成：其特征是冷凍存液中含有:二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1-16任一所示。所述多肽有申請人通過前期的大量的基因庫篩選得到，所述多肽具有保護細胞免受損傷的功能。其名稱及序列如下：bx-1、bx-3、bx-4、bx-6、bx-7、bx-9、bx-11、bx-12、bx-14、bx-15、bx-17、bx-19、bx-22、bx-23、bx-25；其依次對應(yīng)于seqidno：1-15。
在本發(fā)明的細胞的凍存液中，海藻糖以及維生素e和多肽具有明確的抵御外來傷害對細胞的損傷，特別是多肽，還具有保護細胞免受凍存時冰結(jié)晶對細胞的損傷。
本發(fā)明還提供了一種細胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖勻即成。
本發(fā)明還提供了一種神經(jīng)細胞凍存方法，包括以下步驟:
a.凍存液制備:制備所述的細胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法將各組分按照相應(yīng)的比例混合即可獲得；
b.細胞懸液制備:培養(yǎng)生長成單層的神經(jīng)細胞一瓶，0.20％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入步驟a凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內(nèi)；
c.冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；
d.細胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次。所述細胞懸浮濃度為108細胞/ml-1010細胞/ml。
本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明的細胞凍存液，復(fù)蘇細胞存活率可達99％以上，較使用常規(guī)細胞凍存液的復(fù)蘇存活率有了顯著提高，基本上沒有細胞的損耗。
本發(fā)明的干細胞凍存液可以長期保存干細胞，細胞活性不發(fā)生變化，保證了細胞生物學(xué)活性。
本發(fā)明神經(jīng)細胞凍存方法，操作簡單可行，價格適宜，具有較好的實用價值。
具體實施方式
實施例1細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：1所示。
實施例2細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：2所示。
實施例3細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：3所示。
實施例4細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：4所示。
實施例5細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：5所示。
實施例6細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：6所示。
實施例7細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：7所示。
實施例8細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：8所示。
實施例9細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：9所示。
實施例10細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：10所示。
實施例11細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：11所示。
實施例12細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：12所示。
實施例13細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：13所示。
實施例14細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：14所示。
實施例15細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：15所示。
比較例1
分別量取70ml的mem細胞培養(yǎng)液、20ml的小牛血清、i0ml的二甲基亞砜，混合制得常規(guī)細胞凍存液。
比較例2
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。
實施例16凍存液的效果驗證
以上實施例1-15及比較例1-2所制備的細胞凍存液，分別按照下述方法進行細胞凍存和復(fù)蘇實驗。
細胞凍存過程:
培養(yǎng)生長成單層的人白血病干細胞，其細胞密度約6*109個/ml，加入ph7.0的pbs洗細胞表面一次。
將細胞用0.20％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入實施例1-3和比較例1所制備的凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內(nèi)；
冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；分別凍存1周，4個月，8個月。每組3個重復(fù)。
細胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次，計算細胞存活率。結(jié)果如下：
取8個月的凍存細胞，進行細胞分化培養(yǎng)，其中所述的細胞能夠正常進行分化，分化效率達到91.3％，而比較例1取出的細胞其分化率只能達到59.2％,說明細胞活性受到到很大的影響。
序列表
〈110〉潘時輝
〈120〉一種用于白血病治療的細胞凍存液
〈160〉15
〈210〉1
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-1
wrfhsswrkmghylhddwk
〈210〉2
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-3
psewwqyfgrkpygllgg
〈210〉3
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-4
dkgqpkiekgwreksas
〈210〉4
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-6
mdmdkqewrwwseqcyysg
〈210〉5
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-7
wwqrhlvwspwhaltfcp
〈210〉6
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-9
gamqmasdmsqlqwdaa
〈210〉7
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-11
vfmtpakwcentwhppqrn
〈210〉8
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-12
lgmithpisldmipsgkg
〈210〉9
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-14
qgmwgsgshkfitktdq
〈210〉10
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-15
hddkhiiwtrmpmgwkaqt
〈210〉11
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-17
ksqarhnrhfnaygqfsp
〈210〉12
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-19
pvqpqqgwgnqecmaar
〈210〉13
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-22
hwdhefnrsrsfrqgvcsa
〈210〉14
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-23
rwlawfrrntqrqewhrw
〈210〉15
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-25
llvgelregmkgywtml