本發(fā)明涉及植物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種多倍體牛大力品種的培育方法。

背景技術(shù)：

牛大力為豆科植物美麗崖豆藤(millettiaspeciosachamp.)的塊根。又名山蓮藕、大力薯。主產(chǎn)于廣西，分布于廣東、海南以及越南北部，素有南方高麗參之稱，為《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》所收載。歸肺、腎經(jīng)，具有平肝、潤(rùn)肺，養(yǎng)腎補(bǔ)虛，強(qiáng)筋活絡(luò)之功效，中醫(yī)臨床用于清肺止咳、滋陰壯陽(yáng)，風(fēng)濕骨痛、急慢性肝炎等，飲片年需求量折合鮮品達(dá)1200多噸。全國(guó)有二十多個(gè)制藥企業(yè)用于生產(chǎn)治療風(fēng)濕骨痛、腰肌勞損、婦科炎癥、心腦血管疾病等中成藥在全國(guó)廣泛應(yīng)用，原料年需求量折合鮮品達(dá)8000多噸。牛大力味甘、性平，補(bǔ)而不燥。長(zhǎng)期以來(lái)，桂、粵、港、澳、臺(tái)地區(qū)民間普遍用牛大力煲湯。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)：牛大力多糖具有增強(qiáng)免疫的作用，且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒副作用；生物堿和香豆素具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙、鎮(zhèn)咳的作用。在開(kāi)發(fā)抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒等健康食品、天然藥物方面有特殊優(yōu)勢(shì)。吸引了多家企業(yè)開(kāi)發(fā)飲料、口服液、保健茶、超微粉等產(chǎn)品。

多倍體植株一般具有根、莖、葉、花、果的巨型性，抗逆性強(qiáng)，藥用成分含量高，安全可靠等特性，這正是藥材優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)育種所希望達(dá)到的目標(biāo)。利用試管苗進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，容易控制實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好、工作效率高、減少嵌合體、誘變效果好，變異類型多，選擇余地大，可以在短期內(nèi)迅速組培繁育大量純度高、質(zhì)量好，沒(méi)有病蟲(chóng)害的試管苗，這對(duì)提高藥材產(chǎn)量和質(zhì)量十分有利。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種多倍體牛大力品種的培育方法，所述培育方法采用剛萌發(fā)的種子苗作為誘導(dǎo)材料，剛萌發(fā)的種子苗分生能力強(qiáng)。秋水仙素可抑制紡錘絲的合成，從而使染色體加倍，二甲基亞砜是滲透型細(xì)胞保護(hù)劑，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。本發(fā)明以特定的濃度的秋水仙素溶液對(duì)種子苗浸泡特定的時(shí)間，經(jīng)過(guò)從培養(yǎng)后得到的植株中，篩選即可得到多倍體牛大力植株，誘導(dǎo)率在70％-85％之間，得到的多倍體植株性狀優(yōu)良。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種多倍體牛大力品種的培育方法，所述方法包括以下步驟：

1)培育二倍體牛大力種子，得到牛大力種子苗；

2)選取生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的牛大力苗浸泡在二甲基亞砜混和秋水仙素合溶液中進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)；

3)對(duì)誘導(dǎo)后的牛大力苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)；

4)將增殖得到的叢生芽剪成單芽并轉(zhuǎn)接，進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)得到根莖葉完整的組培苗；

5)篩選所述組培苗，得到多倍體植株。

采用剛萌發(fā)的種子苗作為誘導(dǎo)材料，剛萌發(fā)的種子苗分生能力強(qiáng)。秋水仙素可抑制紡錘絲的合成，從而使染色體加倍，二甲基亞砜是滲透型細(xì)胞保護(hù)劑，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

本發(fā)明以特定的濃度的秋水仙素溶液對(duì)種子苗浸泡特定的時(shí)間，經(jīng)過(guò)從培養(yǎng)后得到的植株中，篩選即可得到多倍體牛大力植株，誘導(dǎo)率高，得到的多倍體植株性狀優(yōu)良。

優(yōu)選地，所述步驟1)中，培育種子的具體過(guò)程包括，選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，剝?nèi)シN皮，用升汞消毒處理3-5min，無(wú)菌水清洗4-6次，轉(zhuǎn)接到1/2ms培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-8d。

優(yōu)選地，所述二甲基亞砜的質(zhì)量百分濃度為0.05-0.15％。

優(yōu)選地，所述二甲基亞砜的質(zhì)量百分濃度為0.08-0.12％。

優(yōu)選地，所述秋水仙素的質(zhì)量濃度為0.01-0.2％。

優(yōu)選地，所述秋水仙素的質(zhì)量濃度為0.05-0.15％。

優(yōu)選地，所述步驟2)中，浸泡處理的時(shí)間為12-72h。

優(yōu)選地，所述步驟2)中，浸泡處理的溫度為15-20℃。

優(yōu)選地，所述增殖培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)均在23-27℃的條件下進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述增殖培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)均在光照強(qiáng)度1300-1700lx的條件下進(jìn)行，優(yōu)選地，光照時(shí)間為8-12h/d。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明的方法中選用剛萌發(fā)的牛大力種子苗作為誘導(dǎo)材料，剛萌發(fā)的牛大力種子苗具有很強(qiáng)的分生能力，經(jīng)過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)處理，可使細(xì)胞中的染色體成倍數(shù)性變化，本發(fā)明經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，誘導(dǎo)率70％-85％之間，得到的多倍體牛大力植株形狀優(yōu)良。

(2)本發(fā)明在誘導(dǎo)過(guò)程中還添加了二甲基亞砜，起到保護(hù)細(xì)胞的作用，從而減少了秋水仙素對(duì)細(xì)胞的毒害，提高了誘導(dǎo)率。

(3)本發(fā)明選擇了特定的秋水仙素濃度，該濃度能夠提高對(duì)于牛大力的誘導(dǎo)成功率。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明涉及一種多倍體牛大力品種的培育方法，所述方法包括以下步驟：

1)培育二倍體牛大力種子，得到牛大力種子苗；

2)選取生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的牛大力苗浸泡在二甲基亞砜混和秋水仙素合溶液中進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)；

3)對(duì)誘導(dǎo)后的牛大力苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)；

4)將增殖得到的叢生芽剪成單芽并轉(zhuǎn)接，進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)得到根莖葉完整的組培苗；

5)篩選所述組培苗，得到多倍體植株。

采用剛萌發(fā)的種子苗作為誘導(dǎo)材料，剛萌發(fā)的種子苗分生能力強(qiáng)。秋水仙素可抑制紡錘絲的合成，從而使染色體加倍，二甲基亞砜是滲透型細(xì)胞保護(hù)劑，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

本發(fā)明以特定的濃度的秋水仙素溶液對(duì)種子苗浸泡特定的時(shí)間，經(jīng)過(guò)從培養(yǎng)后得到的植株中，篩選即可得到多倍體牛大力植株，誘導(dǎo)率高，得到的多倍體植株性狀優(yōu)良。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟1)中，培育種子的具體過(guò)程包括，選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，剝?nèi)シN皮，用升汞消毒處理3-5min，無(wú)菌水清洗4-6次，轉(zhuǎn)接到1/2ms培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-8d。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述二甲基亞砜的質(zhì)量百分濃度為0.05-0.15％。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述二甲基亞砜的質(zhì)量百分濃度為0.08-0.12％。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述秋水仙素的質(zhì)量濃度為0.01-0.2％。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述秋水仙素的質(zhì)量濃度為0.05-0.15％。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟2)中，浸泡處理的時(shí)間為12-72h。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟2)中，浸泡處理的溫度為15-20℃。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述增殖培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)均在23-27℃的條件下進(jìn)行。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述增殖培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)均在光照強(qiáng)度1300-1700lx的條件下進(jìn)行，優(yōu)選地，光照時(shí)間為8-12h/d。

實(shí)施例1

按照以下步驟培育多倍體牛大力：

(1)選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，在超凈工作臺(tái)上，用手術(shù)刀剝?nèi)シN皮，放入滅菌瓶中，用0.1％升汞消毒處理3min，無(wú)菌水清洗4次，轉(zhuǎn)接到1/2ms培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)誘導(dǎo)3d后開(kāi)始萌芽；

(2)將步驟1)剛萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亞砜和0.01％秋水仙素的混合溶液中進(jìn)行處理72h，處理溫度15℃；

(3)將步驟2)中經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的牛大力苗用無(wú)菌水清洗1次，轉(zhuǎn)接到常規(guī)的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1300lx,光照時(shí)間10h/d，培養(yǎng)40d后開(kāi)形成叢生芽；

(4)將步驟3)叢生芽剪切成單芽，轉(zhuǎn)接到常規(guī)的生根培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5-7d后進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1700lx,光照時(shí)間10h/d，培育成完整植株；

(5)切取步驟4)篩選的目標(biāo)植株的莖尖、根尖0.5mm，用咔喏固定液(無(wú)水乙醇：乙酸體積比＝3:1)固定15min，清水洗凈，用解離液(濃鹽酸：甲醇體積比＝1:1)解離1min，清水洗凈，切取分生組織0.1mm，用卡寶品紅染色，壓片觀察，計(jì)算染色體數(shù)目，確定多倍體植株，誘導(dǎo)率為70％。

實(shí)施例2

按照以下步驟培育多倍體牛大力：

(1)選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，在超凈工作臺(tái)上，用手術(shù)刀剝?nèi)シN皮，放入滅菌瓶中，用0.1％升汞消毒處理5min，無(wú)菌水清洗6次，轉(zhuǎn)接到1/2ms培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)誘導(dǎo)5d；

(2)將步驟1)剛萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亞砜和0.1％秋水仙素的混合溶液中進(jìn)行處理24h，處理溫度20℃；

(3)將步驟2)中經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的牛大力苗用無(wú)菌水清洗2次，轉(zhuǎn)接到常規(guī)的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx,光照時(shí)間12h/d，培養(yǎng)45d后形成叢生芽；

(4)將步驟3)叢生芽剪切成單芽，轉(zhuǎn)接到常規(guī)的生根培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5-7d后進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1300lx,光照時(shí)間10h/d，培育成完整植株；

(5)切取步驟4)篩選的目標(biāo)植株的莖尖、根尖1mm，用咔喏固定液(無(wú)水乙醇：乙酸體積比＝3:1)固定10min，清水洗凈，用解離液(濃鹽酸：甲醇體積比＝1:1)解離3min，清水洗凈，切取分生組織0.1mm，用卡寶品紅染色，壓片觀察，計(jì)算染色體數(shù)目，確定多倍體植株，誘導(dǎo)率為78.5％。

實(shí)施例3

(1)選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，無(wú)菌條件下，剝?nèi)シN皮，用0.1％升汞消毒處理3min，無(wú)菌水清洗5次，轉(zhuǎn)接到1/2ms培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)誘導(dǎo)8d；

(2)將步驟1)剛萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亞砜和0.15％秋水仙素的混合溶液中進(jìn)行處理20h，處理溫度15℃；

(3)將步驟2)中誘導(dǎo)的牛大力苗用無(wú)菌水清洗2次，轉(zhuǎn)接到常規(guī)的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1700lx,光照時(shí)間10h/d；

(4)將步驟3)叢生芽剪切成單芽，轉(zhuǎn)接到常規(guī)的生根培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5-7d后進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx,光照時(shí)間12h/d，培育成完整植株；

(5)切取步驟4)篩選的目標(biāo)植株的莖尖、根尖0.5mm，用咔喏固定液(無(wú)水乙醇：乙酸體積比＝3:1)固定20min以上，清水洗凈后，用解離液(濃鹽酸：甲醇體積比＝1:1)解離3min，清水洗凈，切取分生組織0.1mm，用卡寶品紅染色，壓片觀察，計(jì)算染色體數(shù)目，確定多倍體植株，誘導(dǎo)率為85％。

實(shí)施例4

(1)選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，無(wú)菌條件下，剝?nèi)シN皮，用0.1％升汞消毒處理3min，無(wú)菌水清洗5次，轉(zhuǎn)接到1/2ms培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)誘導(dǎo)8d；

(2)將步驟1)剛萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亞砜和0.15％秋水仙素的混合溶液中進(jìn)行處理20h，處理溫度15℃；

(3)將步驟2)中誘導(dǎo)的牛大力苗用無(wú)菌水清洗2次，轉(zhuǎn)接到常規(guī)的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx,光照時(shí)間10h/d；

(4)將步驟3)叢生芽剪切成單芽，轉(zhuǎn)接到常規(guī)的生根培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5-7d后進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx,光照時(shí)間8h/d，培育成完整植株；

(5)切取步驟4)篩選的目標(biāo)植株的莖尖、根尖0.5mm，用咔喏固定液(無(wú)水乙醇：乙酸體積比＝3:1)固定20min以上，清水洗凈后，用解離液(濃鹽酸：甲醇體積比＝1:1)解離3min，清水洗凈，切取分生組織0.1mm，用卡寶品紅染色，壓片觀察，計(jì)算染色體數(shù)目，確定多倍體植株，誘導(dǎo)率為85％。

盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。