本發(fā)明屬于細(xì)胞工程育種技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種高效誘導(dǎo)泥鰍同源四倍體魚苗的方法。

背景技術(shù)：

同源四倍體，是指體細(xì)胞中含有四套相同來源染色體組的個(gè)體，通常是由二倍體生物染色體加倍產(chǎn)生。人工誘導(dǎo)魚類同源四倍體在水產(chǎn)動(dòng)物育種研究中具有重要的意義，一方面，能育的人工四倍體魚與普通二倍體魚交配，可得到大量的可供養(yǎng)殖生產(chǎn)的三倍體后代，解決了人工誘導(dǎo)三倍體在生產(chǎn)規(guī)模上的局限性、誘導(dǎo)效率不穩(wěn)定和胚胎死亡率高等問題，是規(guī)?；a(chǎn)三倍體魚的最佳方法；另一方面，人工合成的同源四倍體，由于確切的知道其起源祖先，并且，與二倍體相比，dna序列沒有差異，實(shí)現(xiàn)了倍性系列的配套，可以準(zhǔn)確地反應(yīng)多倍體形成早期基因變化與基因組變異特點(diǎn)，為研究生物進(jìn)化過程中染色體組復(fù)制的作用及基因的表達(dá)方式提供了良好的模式系統(tǒng)。因此，同源四倍體魚的誘導(dǎo)一直是染色體組工程育種中備受關(guān)注的問題。

泥鰍(misgurnusanguillicaudatus)以其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特有的滋補(bǔ)藥用功效而被譽(yù)為“水中人參”，深受中國(guó)、日本及韓國(guó)等地消費(fèi)者的青睞。近年來，泥鰍的市場(chǎng)需求量日益增加，市場(chǎng)價(jià)格節(jié)節(jié)攀升，泥鰍養(yǎng)殖已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖者的新寵，泥鰍新品種的培育對(duì)泥鰍產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。泥鰍四倍體在自然界中早已存在，但有研究發(fā)現(xiàn)，這些天然四倍體泥鰍是由二倍體泥鰍祖先通過種間雜交產(chǎn)生，并且已經(jīng)發(fā)生了二倍化，因此，真正具有遺傳功能的同源四倍體泥鰍只能通過人工誘導(dǎo)獲得。

關(guān)于泥鰍同源四倍體的誘導(dǎo)，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，但在其近緣種大鱗副泥鰍(paramisgurnusdabryanus)中，nam等(2001)曾有過報(bào)道，他們采用熱休克法誘導(dǎo)出了少量的四倍體個(gè)體，隨后常重杰&杜啟艷(2002)采用同樣的方法也獲得了部分四倍體個(gè)體。然而，在實(shí)際操作中，研究人員發(fā)現(xiàn)，由于胚胎個(gè)體間發(fā)育速度不同，同源四倍體魚的誘導(dǎo)誘導(dǎo)條件(如，處理起始時(shí)間、休克溫度和處理持續(xù)時(shí)間等)難以掌握，四倍體的出現(xiàn)率和存活率非常低下(常重杰&杜啟艷，2002)，并且誘導(dǎo)效果不穩(wěn)定、結(jié)果的可重復(fù)性很差。迄今為止，同源四倍體的人工誘導(dǎo)僅在虹鱒中獲得成功并應(yīng)用于生產(chǎn)，在泥鰍等其它魚類中尚未獲得兩性能育并形成群體的四倍體魚，這嚴(yán)重阻礙了泥鰍等魚類新品種的開發(fā)。

本發(fā)明中，我們開辟了一種新的、高效誘導(dǎo)同源四倍體泥鰍的方法，使用該方法誘導(dǎo)同源四倍體泥鰍，誘導(dǎo)效率遠(yuǎn)高于目前的誘導(dǎo)方法，并且效果穩(wěn)定、結(jié)果的可重復(fù)性強(qiáng)，在泥鰍多倍體育種、以及與多倍化相關(guān)的遺傳學(xué)研究等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高效誘導(dǎo)泥鰍同源四倍體魚苗的方法，本方法簡(jiǎn)便易行，可誘導(dǎo)出批量的同源四倍體魚苗，誘導(dǎo)效率較傳統(tǒng)的方法有顯著的提高，并且誘導(dǎo)結(jié)果穩(wěn)定。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種高效誘導(dǎo)泥鰍同源四倍體魚苗發(fā)方法，包括下述步驟：將野生二倍體泥鰍的卵子與精子按常規(guī)方式授精后，將受精卵置于40.5±0.5℃水浴中熱休克處理2-3min，隨后迅速轉(zhuǎn)移至1.5±0.5℃冰水中冷休克處理30-60min，受精卵復(fù)溫，然后繼續(xù)孵化至出苗。

以上所述的方案中，優(yōu)選的，按照下述步驟進(jìn)行：

25℃條件下，將野生二倍體泥鰍的卵子與精子授精，28min后，將受精卵置于40.5℃水浴中熱休克處理2min，隨后迅速轉(zhuǎn)移至1.5℃冰水中冷休克處理45min，受精卵復(fù)溫，然后繼續(xù)孵化至出苗。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的誘導(dǎo)泥鰍同源四倍體泥鰍的方法，操作簡(jiǎn)便、方法高效。利用本發(fā)明所述方法，同源四倍體泥鰍魚苗的產(chǎn)率可達(dá)10.4±0.3％，遠(yuǎn)高于目前的誘導(dǎo)方法，并且效果穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)。本發(fā)明為同源四倍體泥鰍苗種的生產(chǎn)提供了高效的技術(shù)手段，在泥鰍多倍體育種、以及與多倍化相關(guān)的遺傳學(xué)研究等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為不同誘導(dǎo)方法下泥鰍魚苗的早期存活率、四倍體泥鰍的出現(xiàn)率和四倍體泥鰍的產(chǎn)率。

熱休克(40.5℃)指的是：25℃下，將野生二倍體泥鰍的卵子與精子授精28min后，將受精卵置于40.5℃水浴中，分別熱休克處理1min、2min和3min，共3組實(shí)驗(yàn)；

冷休克(1.5℃)指得是：25℃下，將野生二倍體泥鰍的卵子與精子授精28min后，將受精卵置于1.5℃水浴中，分別冷休克處理30min、45min和60min，共3組實(shí)驗(yàn)；

熱休克(40.5℃)+冷休克(1.5℃)指得是：25℃下，將野生二倍體泥鰍的卵子與精子授精28min后，先將受精卵置于40.5℃水浴中，分別熱休克處理1min、2min和3min，然后迅速轉(zhuǎn)移至1.5℃水浴中，冷休克處理30min、45min和60min，共9組實(shí)驗(yàn)；

以上處理結(jié)束后迅速置于25℃曝氣水中復(fù)溫，并繼續(xù)孵化。

圖2為流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法(dna相對(duì)含量)鑒定泥鰍同源四倍體魚苗的示意圖；

以已知二倍體泥鰍為內(nèi)參。

圖3為誘導(dǎo)的同源四倍體泥鰍的染色體核型及普通二倍體泥鰍的染色體核型示意圖；

其中：a為誘導(dǎo)后的同源四倍體泥鰍的染色體核型；

b為普通二倍體泥鰍的染色體核型。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)；所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1：

一種高效誘導(dǎo)泥鰍同源四倍體魚苗的方法，包括下述步驟：

(1)選擇性腺發(fā)育良好、體質(zhì)健壯的二倍體雌雄泥鰍作為親本，用lhrh-a2+dom混合注射法進(jìn)行人工催產(chǎn)，達(dá)到效應(yīng)時(shí)間后，用半干法進(jìn)行人工授精。將受精卵混合均勻后，平鋪于培養(yǎng)皿中(每個(gè)培養(yǎng)皿中的受精卵不少于100粒)，置于25℃曝氣水中孵化28min。

(2)將受精卵分成4組：

第一組：對(duì)照組(3個(gè)重復(fù))，不進(jìn)行任何處理，將受精卵直接置于25℃的曝氣水中孵化；

第二組：只進(jìn)行熱休克處理，40.5℃水浴中分別處理1min，2min和3min(每個(gè)時(shí)間梯度3個(gè)重復(fù))；

第三組：只進(jìn)行冷休克處理，1.5℃水浴中分別處理30min，45min和60min(每個(gè)時(shí)間梯度3個(gè)重復(fù))；

第四組：冷休克處理和熱休克處理相結(jié)合，40.5℃水浴中分別處理1min，2min和3min，然后迅速轉(zhuǎn)移至1.5℃水浴中分別處理30min，45min和60min(每個(gè)時(shí)間梯度3個(gè)重復(fù))；以上各組處理結(jié)束后，迅速轉(zhuǎn)移至25℃曝氣水中復(fù)溫，并繼續(xù)孵化。

(3)魚苗出膜后48h統(tǒng)計(jì)早期存活率，計(jì)算方法為：早期存活率＝(存活魚苗數(shù)/受精卵總數(shù))×100％。

(4)各組中孵出的魚苗分別轉(zhuǎn)移至水族箱(100cm×60cm×20cm，100l曝氣水)中，用豐年蟲培養(yǎng)。15天后，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法或染色體核型分析法統(tǒng)計(jì)各組中的四倍體的出現(xiàn)率，計(jì)算方法為：四倍體出現(xiàn)率＝(四倍體個(gè)體數(shù)/孵出的魚苗總數(shù))×100％。

(5)四倍體魚苗的產(chǎn)率的計(jì)算方法為：四倍體產(chǎn)率(％)＝(早期存活率×四倍體出現(xiàn)率)×100％

結(jié)果如表1所示，結(jié)果顯示，先經(jīng)熱休克處理再經(jīng)冷休克處理(即第四組)，誘導(dǎo)效果最好，具體數(shù)值如下：

表1不同誘導(dǎo)方法下泥鰍魚苗的早期存活率、四倍體泥鰍的出現(xiàn)率和四倍體泥鰍的產(chǎn)率

可以看到，受精后28min，將受精卵置于40.5℃水浴中熱休克處理2min，隨后迅速1.5℃冰水混合物中冷休克處理45min，四倍體魚苗的誘導(dǎo)率(即四倍體產(chǎn)率)最高，達(dá)10.4±0.3％(圖1)。