本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種樹蘭的組培繁育方法，采用花梗作為外植體的組培快繁技術(shù)。
背景技術(shù)：
樹蘭(epidendrumradians)為蘭科樹蘭屬，原產(chǎn)美洲熱帶地區(qū)的厄瓜多爾，是一種具有很高觀賞價值的熱帶氣生蘭。早期因樹蘭花色較單調(diào)、花型偏小，并未受到消費(fèi)者的注意，但近年來經(jīng)由品種的改良，樹蘭的株型花型已顯著改善，且花色鮮麗繁多，優(yōu)雅情趣，充滿青春活力，深受蘭花愛好者的青睞，具有很高的觀賞價值，既可作鮮切花，也可用作室內(nèi)盆栽花卉。
由于本屬是瀕危蘭花物種，數(shù)量稀少，常規(guī)的分株繁育，速度慢，效率低，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對優(yōu)良樹蘭品種進(jìn)行組培擴(kuò)繁，加快樹蘭的繁殖速度，形成一套全面、高效、實(shí)用性強(qiáng)的樹蘭組培快繁技術(shù)體系。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種樹蘭的組培繁育方法，該方法具有誘導(dǎo)率高、誘導(dǎo)時間短、叢生芽增殖率高、技術(shù)難度低、遺傳性能穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種樹蘭的組培繁育方法，包括如下步驟：
(1)花梗預(yù)處理：選取綠色，無病蟲害的花梗，用毛刷刷干凈花梗表面的雜質(zhì)，用75％酒精棉球擦洗花梗段，剪刀剪成帶1-2個芽，3-7cm長的花梗段，然后用飽和洗衣粉水浸泡15-20min，流水沖洗20-30min；
(2)花梗滅菌處理：在超凈工作臺上，將花梗段放入0.1％升汞中浸泡13-18min，然后用無菌水洗4-5次，在接種盤中，用手術(shù)刀慢慢刮去花梗上包住腋芽的苞片，不能弄傷腋芽，然后在放入0.1％升汞中浸泡5-8min，進(jìn)行第2次滅菌，無菌水洗4-5次，最后在接種盤中，切掉花梗段兩端0.5cm，按生長方向垂直插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不能沒過腋芽；
(3)萌發(fā)誘導(dǎo)階段：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)10d后，腋芽開始伸長生長，60d后，腋芽可長至4-5cm，長出4-5片葉片；
(4)繼代增殖階段：取出腋芽，從基部切離原母株，切去葉片，切掉頂芽，剩余的莖段接入繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)60d后，單芽變壯，且從莖段基部長出許多小芽，增殖倍數(shù)達(dá)3-5倍；
(5)壯苗生根階段：將叢生芽取出，把高于1.5cm的小芽切出，接入壯苗生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)60d后，單芽伸長生長成健壯小苗，長出3-5條根，低于1.5cm的小叢芽再繼續(xù)接入繼代增殖培養(yǎng)基中；
(6)煉苗階段：當(dāng)生根苗根長1.5-2.0cm，苗高5-9cm，葉片數(shù)6-8片時，移至溫棚內(nèi)煉苗14d，然后除去瓶蓋繼續(xù)煉苗1-2d；
(7)移栽：移栽時，先用清水洗去粘附于苗上的培養(yǎng)基，在蔭棚下晾5min，用口徑5cm帶孔小杯種植，并放置于四槽托內(nèi)，每杯種植2-3株，將小苗種植在移栽基質(zhì)正中，輕壓根部，淋透定根水；移栽10d后，用水溶性促根肥2000-3000倍濃度噴灑葉面，以葉面稍有水珠形成為度；栽植1-3個月內(nèi)，與水溶性均衡肥2000-3000倍濃度輪流噴灑，每3d噴灑1次，噴肥在晴天午后進(jìn)行。
作為優(yōu)選，步驟(2)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+6-ba0.5-1.0mg/l+椰汁30-50ml/l。
作為優(yōu)選，步驟(4)中所述的繼代增殖培養(yǎng)基ms+6-ba2.0-3.0mg/l+naa0.05-0.1mg/l+椰汁30-50ml/l+白糖30g/l+瓊脂4.2g/l，ph5.5-5.8。
作為優(yōu)選，步驟(5)中所述的壯苗生根培養(yǎng)基為1/2ms+naa0.5-1.0mg/l+香蕉30-50g/l+白糖25g/l+瓊脂4.2g/l，ph5.5-5.8。
作為優(yōu)選，步驟(6)中所述的煉苗的條件為：溫度20-28℃，光照強(qiáng)度5000lx。
作為優(yōu)選，步驟(7)中所述的移栽基質(zhì)以蘭石和樹皮按照1:1的體積比配制而成。
作為優(yōu)選，步驟(7)中所述的水溶性促根肥的n∶p2o5∶k2o＝9：45：15。
作為優(yōu)選，步驟(7)中所述的水溶性均衡肥的n∶p2o5∶k2o＝20：20：20。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明的樹蘭組培快繁能快速獲得大量無菌苗，選取花梗作為外植體的優(yōu)點(diǎn)在于，花梗上的節(jié)間部位有生長旺盛的小芽，小芽是被苞片包裹著，具有污染率較低，滅菌難度低、誘導(dǎo)率高、誘導(dǎo)時間短、叢生芽增殖率高、技術(shù)難度低、遺傳性能穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，可避免生產(chǎn)中發(fā)生大量變異，對大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。
實(shí)施例1：
一種樹蘭的組培繁育方法，包括如下步驟：
(1)花梗預(yù)處理：選取綠色，無病蟲害的花梗，用毛刷刷干凈花梗表面的雜質(zhì)，用75％酒精棉球擦洗花梗段，剪刀剪成帶1芽，4cm長的花梗段，然后用飽和洗衣粉水浸泡15min，流水沖洗20min。
(2)花梗滅菌處理：在超凈工作臺上，將花梗段放入0.1％升汞中浸泡15min，無菌水洗4次，最后在接種盤中，用手術(shù)刀慢慢刮去花梗上包住腋芽的苞片，不能弄傷腋芽，然后在放入0.1％升汞中浸泡8min，進(jìn)行第二次滅菌，無菌水洗4次，最后在接種盤中，切掉花梗段兩端0.5cm，按生長方向垂直插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不能沒過腋芽。
(3)萌發(fā)誘導(dǎo)階段：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+6-ba0.5mg/l+椰汁30ml/l，約10d以后，腋芽開始伸長生長，60d后，腋芽可長至4cm，長出4片葉片。
(4)繼代增殖階段：取出腋芽，從基部切離原母株，切去葉片，切掉頂芽，剩余的莖段接入繼代增殖培養(yǎng)基ms+6-ba2.0mg/l+naa0.05mg/l+椰汁30ml/l+白糖30g/l+瓊脂4.2g/l，ph5.5，60d后，單芽變壯，且從莖段基部長出許多小芽，增殖倍數(shù)達(dá)3倍。
(5)壯苗生根階段：將叢生芽取出，把高于1.5cm的小芽切出，接入壯苗生根培養(yǎng)基1/2ms+naa0.5mg/l+香蕉30g/l+白糖25g/l+瓊脂4.2g/l，ph5.5，60d后，單芽伸長生長成健壯小苗，長出3-5條根，低于1.5cm的小叢芽繼續(xù)接入繼代增殖培養(yǎng)基中。
(6)煉苗階段：生根苗根長1.5cm，苗高5cm，葉片數(shù)6片時，移至溫棚內(nèi)煉苗14d，溫度20℃，光照強(qiáng)度5000lx，然后除去瓶蓋繼續(xù)煉苗1d。
(7)移栽：移栽基質(zhì)以蘭石和樹皮按照1:1的體積比配制，移栽時，用清水洗去粘附于苗上的培養(yǎng)基，在蔭棚下晾5min。用口徑5cm帶孔小杯種植，并放置于四槽托內(nèi)，每杯種植2株，將小苗種植在基質(zhì)正中，輕壓根部，淋透定根水。移栽10d后，用水溶性促根肥(n∶p2o5∶k2o＝9：45：15)2000倍濃度噴灑葉面，以葉面稍有水珠形成為度；栽植1-3個月內(nèi)，與水溶性均衡肥(n∶p2o5∶k2o＝20：20：20)2000倍濃度輪流噴灑，每3d一次，噴肥需在晴天午后實(shí)施。
實(shí)施例2：
一種樹蘭的組培繁育方法，包括如下步驟：
(1)花梗預(yù)處理：選取綠色，無病蟲害的花梗，用毛刷刷干凈花梗表面的雜質(zhì)，剪刀剪成帶1芽，5cm長的花梗段，然后用飽和洗衣粉水浸泡20min，流水沖洗30min。
(2)花梗滅菌處理：在超凈工作臺上，用75％酒精棉球擦洗花梗段，然后放入0.1％升汞中浸泡10min，無菌水洗5次，最后在接種盤中，切掉花梗段兩端0.5cm，用手術(shù)刀慢慢刮去花梗上包住腋芽的苞片，不能弄傷腋芽，然后按生長方向垂直插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不能沒過腋芽。
(3)萌發(fā)誘導(dǎo)階段：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+6-ba1.0mg/l+椰汁50ml/l，約10d以后，腋芽開始伸長生長，60d后，腋芽可長至5cm，長出5片葉片。
(4)繼代增殖階段：取出腋芽，從基部切離原母株，切去葉片，切掉頂芽，剩余的莖段接入繼代增殖培養(yǎng)基ms+6-ba3.0mg/l+naa0.1mg/l+椰汁50ml/l+白糖30g/l+瓊脂4.2g/l，ph5.8，60d后，單芽變壯，且從莖段基部長出許多小芽，增殖倍數(shù)達(dá)5倍。
(5)壯苗生根階段：將叢生芽取出，把高于1.5cm的小芽切出，接入壯苗生根培養(yǎng)基1/2ms+naa1.0mg/l+香蕉50g/l+白糖25g/l+瓊脂4.2g/l，ph5.8，60d后，單芽伸長生長成健壯小苗，長出5條根，低于1.5cm的小叢芽繼續(xù)接入繼代增殖培養(yǎng)基中。
(6)煉苗階段：生根苗根長2.0cm，苗高9cm，葉片數(shù)8片時，移至溫棚內(nèi)煉苗14d，溫度28℃，光照強(qiáng)度5000lx，然后除去瓶蓋繼續(xù)煉苗2d。
(7)移栽：移栽基質(zhì)以蘭石和樹皮按照1:1的體積比配制，移栽時，用清水洗去粘附于苗上的培養(yǎng)基，在蔭棚下晾5min。用口徑5cm帶孔小杯種植，并放置于四槽托內(nèi)，每杯種植2株，將小苗種植在基質(zhì)正中，輕壓根部，淋透定根水。移栽10d后，用水溶性促根肥(n∶p2o5∶k2o＝9：45：15)2000倍濃度噴灑葉面，以葉面稍有水珠形成為度；栽植1-3個月內(nèi)，與水溶性均衡肥(n∶p2o5∶k2o＝20：20：20)2000倍濃度輪流噴灑，每3d一次，噴肥需在晴天午后實(shí)施。
實(shí)施例3：
一種樹蘭的組培繁育方法，包括如下步驟：
(1)花梗預(yù)處理：選取綠色，無病蟲害的花梗，用毛刷刷干凈花梗表面的雜質(zhì)，用75％酒精棉球擦洗花梗段，剪刀剪成帶2個芽，5cm長的花梗段，然后用飽和洗衣粉水浸泡18min，流水沖洗25min；
(2)花梗滅菌處理：在超凈工作臺上，將花梗段放入0.1％升汞中浸泡14min，然后用無菌水洗4次，在接種盤中，用手術(shù)刀慢慢刮去花梗上包住腋芽的苞片，不能弄傷腋芽，然后在放入0.1％升汞中浸泡5-8min，進(jìn)行第2次滅菌，無菌水洗5次，最后在接種盤中，切掉花梗段兩端0.5cm，按生長方向垂直插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不能沒過腋芽；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+6-ba0.8mg/l+椰汁40ml/l；
(3)萌發(fā)誘導(dǎo)階段：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)10d后，腋芽開始伸長生長，60d后，腋芽可長至4cm，長出5片葉片；
(4)繼代增殖階段：取出腋芽，從基部切離原母株，切去葉片，切掉頂芽，剩余的莖段接入繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)60d后，單芽變壯，且從莖段基部長出許多小芽，增殖倍數(shù)達(dá)4倍；所述的繼代增殖培養(yǎng)基ms+6-ba2.5mg/l+naa0.08mg/l+椰汁40ml/l+白糖30g/l+瓊脂4.2g/l，ph5.6；
(5)壯苗生根階段：將叢生芽取出，把高于1.5cm的小芽切出，接入壯苗生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)60d后，單芽伸長生長成健壯小苗，長出4條根，低于1.5cm的小叢芽再繼續(xù)接入繼代增殖培養(yǎng)基中；所述的壯苗生根培養(yǎng)基為1/2ms+naa0.8mg/l+香蕉40g/l+白糖25g/l+瓊脂4.2g/l，ph5.6；
(6)煉苗階段：當(dāng)生根苗根長1.8cm，苗高7cm，葉片數(shù)7片時，移至溫棚內(nèi)煉苗14d，然后除去瓶蓋繼續(xù)煉苗1d；所述的煉苗的條件為：溫度24℃，光照強(qiáng)度5000lx；
(7)移栽：移栽時，先用清水洗去粘附于苗上的培養(yǎng)基，在蔭棚下晾5min，用口徑5cm帶孔小杯種植，并放置于四槽托內(nèi)，每杯種植3株，將小苗種植在移栽基質(zhì)正中，輕壓根部，淋透定根水；移栽10d后，用水溶性促根肥2500倍濃度噴灑葉面，以葉面稍有水珠形成為度；栽植2個月內(nèi)，與水溶性均衡肥2500倍濃度輪流噴灑，每3d噴灑1次，噴肥在晴天午后進(jìn)行；所述的移栽基質(zhì)以蘭石和樹皮按照1:1的體積比配制而成；所述的水溶性促根肥的n∶p2o5∶k2o＝9：45：15；所述的水溶性均衡肥的n∶p2o5∶k2o＝20：20：20。
待植株苗移栽90天后，分別對實(shí)施例1-3移栽后的樹蘭植株的生長情況及移栽成活率進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果見表1。
表1采用本發(fā)明方法繁育的樹蘭植株的生長情況及移栽成活率
由表1可知，采用本發(fā)明的方法繁育的樹蘭植株健壯、長出新葉、新根的生長情況，移栽成活率均在92％以上生根率均為100％。
上述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍之內(nèi)。