本發(fā)明屬于生物養(yǎng)殖領(lǐng)域，涉及一種提升羅仙子油脂藥用價(jià)值的飼養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

煙草作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，是很多國(guó)家財(cái)政收入的重要來(lái)源。作為煙草生產(chǎn)大國(guó)，自20世紀(jì)90年代后我國(guó)煙草的年產(chǎn)量均在2000kt以上，2010年至今我國(guó)年產(chǎn)煙草達(dá)到5000kt，其中煙草廢棄物約占25％。隨著國(guó)家卷煙工業(yè)的發(fā)展，優(yōu)質(zhì)煙葉及中上等煙葉需求量增大，而煙草廢棄物也隨之增加。

煙草廢棄物是指不適用于卷煙生產(chǎn)的低次等或下等煙葉，以及煙莖、煙花、煙種、煙筋、腋芽、卷煙企業(yè)積存的煙末、煙根、根出條。由于缺乏經(jīng)驗(yàn)及相關(guān)配套設(shè)施導(dǎo)致煙草廢棄物再利用率低，目前多采用直接焚燒和填埋的處理方式。前者會(huì)產(chǎn)生大量煙塵，不符合環(huán)保的要求。后者在處理過(guò)程中通常添加石灰和水及澆水蓄霉，雖能保證廢棄煙草的徹底毀形，但是容易污染地下水及周?chē)h(huán)境，且所需毀形場(chǎng)地較大、毀形過(guò)程繁瑣、耗費(fèi)人力物力。此外，還有一些煙區(qū)的煙農(nóng)將煙草廢棄物隨意丟棄田間，隨灌溉和雨水橫流，傳播病毒害、污染水土環(huán)境。隨著煙草年產(chǎn)量的增大，煙草廢棄物也逐漸增多，廢棄煙草的處理問(wèn)題日益嚴(yán)峻，充分利用廢棄煙草的有效成分為醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域提供原料，將其變廢為寶、循環(huán)利用，已成為我們亟待研究的新課題。

羅仙子所含化學(xué)成分復(fù)雜，具有多種藥理活性，因而近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分、藥理作用及臨床方面的研究也日漸深入。但對(duì)羅仙子的研究也存在以下問(wèn)題：對(duì)其化學(xué)成分的研究多集中于蛋白質(zhì)類(lèi)成分，而對(duì)油脂類(lèi)成分的研究還不夠深入，缺乏油脂類(lèi)成分提取精制工藝的研究。藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不甚明確，有效成分及作用機(jī)理未能揭示。因此，進(jìn)一步系統(tǒng)而深入地研究羅仙子油脂類(lèi)活性成分和藥理作用，這對(duì)指導(dǎo)臨床用藥和新藥開(kāi)發(fā)是非常有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提升羅仙子油脂藥用價(jià)值的飼養(yǎng)方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種提升羅仙子油脂藥用價(jià)值的飼養(yǎng)方法，用煙草飼喂羅仙子。

進(jìn)一步的，所述煙草飼喂羅仙子的具體方法為：將孵化出的羅仙子用含煙草的培養(yǎng)料進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～28℃，培養(yǎng)至羅仙子體長(zhǎng)13～15mm。

進(jìn)一步的，所述含煙草的培養(yǎng)料的配方為廢棄的鮮煙葉60～75％，麩皮15～23％，鋸末3～6％，魚(yú)粉3～6％，糠粉3～6％，所述百分比均為重量百分比。

煙草廢棄物在提高羅仙子油脂的藥用價(jià)值中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述煙草廢棄物為廢棄的鮮煙葉。

進(jìn)一步的，所述提高羅仙子油脂的藥用價(jià)值為提高羅仙子油脂的抗衰老作用

進(jìn)一步的，所述抗衰老作用為皮膚抗衰老作用。

進(jìn)一步的，所述皮膚抗衰老作用為提升皮膚含水量和/或提升皮膚羥脯氨酸含量和/或提高皮膚抗逆境能力。

進(jìn)一步的，所述提高皮膚抗逆境能力為提高皮膚抗氧化能力.

進(jìn)一步的，所述提高皮膚抗氧化能力為提高皮膚超氧化物歧化酶或/和gsh-px谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)利用煙草飼喂羅仙子可提高羅仙子油脂的藥用價(jià)值，提升了羅仙子油脂的抗皮膚衰老作用，有利于皮膚的抗氧化能力，對(duì)羅仙子的開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1為vc對(duì)dpph自由基清除率；

圖2為不同方法制備的羅仙子精油對(duì)dpph自由基清除率；

圖3為vc對(duì)abts自由基清除率；

圖4為不同方法制備的羅仙子精油對(duì)對(duì)abts自由基清除率；

圖5為各小組實(shí)驗(yàn)期間體重變化；

圖6為各組小鼠皮膚切片病理組織學(xué)觀察(he染色，100倍)。

具體實(shí)施方式

一種提升羅仙子油脂藥用價(jià)值的飼養(yǎng)方法，用煙草飼喂羅仙子。

優(yōu)選的，所述煙草飼喂羅仙子的具體方法為：將孵化出的羅仙子用含煙草的培養(yǎng)料進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～28℃，培養(yǎng)至羅仙子體長(zhǎng)13～15mm。

優(yōu)選的，所述含煙草的培養(yǎng)料的配方為廢棄的鮮煙葉60～75％，麩皮15～23％，鋸末3～6％，魚(yú)粉3～6％，糠粉3～6％，所述百分比均為重量百分比。

優(yōu)選的，所述廢棄的鮮煙葉為粉碎的粒徑為2～3cm的碎片。

煙草廢棄物在提高羅仙子油脂的藥用價(jià)值中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述煙草廢棄物為廢棄的鮮煙葉。

優(yōu)選的，所述提高羅仙子油脂的藥用價(jià)值為提高羅仙子油脂的抗衰老作用

優(yōu)選的，所述抗衰老作用為皮膚抗衰老作用。

優(yōu)選的，所述皮膚抗衰老作用為提升皮膚含水量和/或提升皮膚羥脯氨酸含量和/或提高皮膚抗逆境能力。

優(yōu)選的，所述提高皮膚抗逆境能力為提高皮膚抗氧化能力.

優(yōu)選的，所述提高皮膚抗氧化能力為提高皮膚超氧化物歧化酶或/和gsh-px谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1一種提升羅仙子油脂藥用價(jià)值的飼養(yǎng)方法

將廢棄煙葉(不適用鮮煙葉)粉碎為粒徑2～3cm的碎片，添加適量輔料，攪拌均勻，配制成含煙草的培養(yǎng)料。含煙草的培養(yǎng)料配方如下(質(zhì)量百分比，％)：廢棄煙葉65％，麩皮20％，鋸末5％，魚(yú)粉5％，糠粉5％。將培養(yǎng)料置于容器中，厚度6cm；然后在培養(yǎng)料表面接入新孵出的羅仙子，在28℃條件下飼養(yǎng)至羅仙子體長(zhǎng)13～15mm時(shí)，即可采收。

實(shí)施例2一種提升羅仙子油脂藥用價(jià)值的飼養(yǎng)方法

將廢棄煙葉(不適用鮮煙葉)粉碎為粒徑2～3cm的碎片，添加適量輔料，攪拌均勻，配制成含煙草的培養(yǎng)料。含煙草的培養(yǎng)料配方如下(質(zhì)量百分比，％)：廢棄煙葉75％，麩皮15％，鋸末3％，魚(yú)粉4％，糠粉4％。將培養(yǎng)料置于容器中，厚度7cm；然后在培養(yǎng)料表面接入新孵出的羅仙子，在25℃條件下飼養(yǎng)至羅仙子體長(zhǎng)13～15mm時(shí)，即可采收。

實(shí)施例3一種提升羅仙子油脂藥用價(jià)值的飼養(yǎng)方法

將廢棄煙葉(不適用鮮煙葉)粉碎為粒徑2～3cm的碎片，添加適量輔料，攪拌均勻，配制成含煙草的培養(yǎng)料。含煙草的培養(yǎng)料配方如下(質(zhì)量百分比，％)：廢棄煙葉60％，麩皮23％，鋸末6％，魚(yú)粉6％，糠粉5％。將培養(yǎng)料置于容器中，厚度5cm；然后在培養(yǎng)料表面接入新孵出的羅仙子，在27℃條件下飼養(yǎng)至羅仙子體長(zhǎng)13～15mm時(shí)，即可采收。

實(shí)施例4高藥用價(jià)值的羅仙子精油的提取

1)羅仙子粗油的制備：將實(shí)施例1～3任一所得羅仙子幼蟲(chóng)微波干燥后，碾碎得羅仙子粉末，羅仙子粉末與溶劑正己烷混勻，料液比為1：20，超聲提取2～4次，每次40min，超聲功率為450w；過(guò)濾，減壓回收溶劑，得羅仙子粗油；

2)粗油脫膠：將羅仙子粗油加熱至50℃時(shí)加入水，用水體積為粗油體積的18％，于50℃條件下攪拌15min，離心5min，離心轉(zhuǎn)速為4000r/min，取上清液，得脫膠油；

3)脫酸：將脫膠油加熱至55℃，根據(jù)脫膠油酸值加入剛好能夠中和酸的10％w/v的naoh溶液，另外再加入體積為脫膠油體積0.2％的堿溶液，繼續(xù)于55℃加熱攪拌30min，待產(chǎn)生的絮狀物凝結(jié)后停止攪拌，離心取上清得脫酸油；

4)水洗：將上步所得脫酸油加熱至85℃，加入85℃水，水體積為脫酸油的30％，繼續(xù)加熱至85℃攪拌30min，靜置分層，取油層即得高藥用價(jià)值的羅仙子精油。

實(shí)施例5高藥用價(jià)值的羅仙子精油的化學(xué)組成和相對(duì)含量分析

方法：

(1)脂肪酸甲酯的制備

精密稱(chēng)取本發(fā)明制備的羅仙子精油0.15g，加入0.5mol/l的氫氧化鉀-甲醇溶液2ml，65℃水浴至油滴完全消失，冷卻后加入14％三氟化硼-甲醇溶液2ml，水浴煮沸10min，室溫中冷卻，加入異辛烷10ml，飽和氯化鈉溶液20ml，取上清液于試管中，加無(wú)水硫酸鈉，離心分層，取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)gc-ms分析條件

色譜條件：色譜柱hp-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；采用程序升溫，初溫160℃，以5℃/min升溫至170℃，以3℃/min升溫至176℃，保持2min，以5℃/min升溫至190℃，保持10min；進(jìn)樣口溫度280℃；檢測(cè)器溫度250℃；載氣為高純氦氣，流速1.0ml/min；進(jìn)樣量1.0μl，分流比40∶1。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊(ei)，電子能量70ev，接口溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍(m/z)35～500u。質(zhì)譜檢索軟件nist02，采用峰面積歸一法進(jìn)行定量分析。

對(duì)照組：同時(shí)以現(xiàn)有常規(guī)普通飼料(除了不含煙草，其他成分與本發(fā)明所用的含煙草的培養(yǎng)料的成分相同，下文中所有“普通飼料”均指這種情況)飼養(yǎng)的羅仙子作為對(duì)照組，對(duì)照組中除了飼養(yǎng)羅仙子的為普通飼料，其他所有條件與本發(fā)明方法相同。

結(jié)果：

(1)對(duì)普通飼料飼養(yǎng)的羅仙子(對(duì)照組)與本發(fā)明煙草飼養(yǎng)的羅仙子進(jìn)行精油提取，前者得油率為17.65％；本發(fā)明方法得油率為18.45％。

(2)對(duì)普通飼料飼養(yǎng)的羅仙子(對(duì)照組)與本發(fā)明煙草飼養(yǎng)的羅仙子提取的精油進(jìn)行化學(xué)成分組成及相對(duì)含量的檢測(cè)，分析結(jié)果如表1所示，兩組精油中共有的脂肪酸類(lèi)成分為13種，然而本發(fā)明方法制得的羅仙子精油中還存在少量的5-十六碳烯酸。普通飼料飼養(yǎng)羅仙子精油(對(duì)照綠春縣)中所含飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比為41.4％/58.5％，本發(fā)明方法制得的羅仙子精油為40.58％/59.42％，可看出本發(fā)明方法制得的羅仙子精油中不飽和脂肪酸比例高于普通飼料飼養(yǎng)羅仙子。

表1羅仙子精油中脂肪酸的組成及相對(duì)含量

實(shí)施例6高藥用價(jià)值的羅仙子精油的理化值測(cè)定

對(duì)照組：以現(xiàn)有常規(guī)普通飼料飼養(yǎng)的羅仙子作為對(duì)照組，對(duì)照組中除了飼養(yǎng)羅仙子的為普通飼料，其他所有條件與本發(fā)明方法相同。

對(duì)照組羅仙子粗油與本發(fā)明煙草喂養(yǎng)的羅仙子粗油經(jīng)精制后由渾濁的褐色變?yōu)槌吻宓慕瘘S色，刺激性氣味顯著減弱；檢測(cè)精制后普通飼料飼養(yǎng)羅仙子粗油、精油(對(duì)照組)與本發(fā)明羅仙子粗油、精油的各理化值。

檢測(cè)結(jié)果如表2所示，其中，酸值表示油脂中游離脂肪酸的含量，為評(píng)價(jià)油脂質(zhì)量的重要指標(biāo)，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gbt26516-2011按摩精油及gbt29990-2013潤(rùn)膚油中均對(duì)精油酸值作了規(guī)定，分別要求低于≤7mg/g及≤5mg/g，對(duì)照組精油與本發(fā)明方法制得的精油均符合以上標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。說(shuō)明除了煙草飼喂羅仙子這一技術(shù)特征外，本發(fā)明方法中的其他技術(shù)特征對(duì)獲得具有高藥用價(jià)值的羅仙子精油的作用也是至關(guān)重要的。

表2羅仙子精油和羅仙子粗油的理化值測(cè)定結(jié)果(n＝3)

實(shí)施例7高藥用價(jià)值的羅仙子精油清除dpph自由基能力的測(cè)定

dpph自由基是一種穩(wěn)定的紫色有機(jī)自由基，在517nm處有強(qiáng)吸收。分別吸取2ml不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與2mldpph+工作液混合，渦流振蕩30s后暗處?kù)o置10min，于517nm處測(cè)定其吸光度，每個(gè)濃度平行測(cè)三次，計(jì)算清除率和ic50值(清除率為50％時(shí)樣品的質(zhì)量濃度)。按上述方法分別對(duì)本發(fā)明方法制得的高藥用價(jià)值的羅仙子精油、對(duì)照組羅仙子精油(除了飼養(yǎng)羅仙子的為普通飼料，其他所有條件與本發(fā)明方法相同)、陽(yáng)性對(duì)照組(vc)進(jìn)行清除dpph⁺能力的檢測(cè)。

由圖1、2和表3可知，兩種羅仙子精油均有一定清除dpph自由基的能力，在所選濃度范圍內(nèi)隨著樣品濃度的增大，自由基清除率呈現(xiàn)正向線性關(guān)系。由線性方程計(jì)算本發(fā)明精油與對(duì)照組精油抑制dpph的ic50值分別為45.73mg/ml、48.86mg/ml。由此可看出，本發(fā)明煙草飼養(yǎng)的羅仙子精油較普通飼料飼養(yǎng)羅仙子精油抗dpph自由基活性更強(qiáng)。

表3不同方法制備的羅仙子精油對(duì)dpph自由基清除作用測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例8高藥用價(jià)值的羅仙子精油清除abts自由基能力的測(cè)定

abts自由基溶液呈藍(lán)綠色在734nm處有最大吸收，在其與抗氧化物結(jié)合形成絡(luò)合物后，反應(yīng)溶液褪色，溶液吸光度降低。分別對(duì)本發(fā)明方法制得的高藥用價(jià)值的羅仙子精油、對(duì)照組羅仙子精油(除了飼養(yǎng)羅仙子的為普通飼料，其他所有條件與本發(fā)明方法相同)、陽(yáng)性對(duì)照組(vc)進(jìn)行清除abts自由基能力的測(cè)定。

測(cè)定結(jié)果如圖3、4和表4所示，兩種羅仙子精油均對(duì)abts自由基有一定的清除能力，且呈良好的濃度依賴關(guān)系，普通飼料飼養(yǎng)羅仙子精油與本發(fā)明煙草飼養(yǎng)的羅仙子精油清除abts自由基的ic50值分別為34.73mg/ml、25.95mg/ml。由此可知，后者對(duì)abts的清除作用稍強(qiáng)于前者。

表4不同方法制備的羅仙子精油對(duì)對(duì)abts自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例9高藥用價(jià)值的羅仙子精油抗衰老能力的測(cè)定

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物與試劑

1號(hào)油為普通飼料飼養(yǎng)的羅仙子提取得到的羅仙子精油(對(duì)照組羅仙子精油)；2號(hào)油為本發(fā)明廢棄煙草飼料喂養(yǎng)羅仙子后提取得到的羅仙子精油；1號(hào)油(對(duì)照組羅仙子精油)中除了飼養(yǎng)羅仙子的食物為普通飼料，其他所有條件均與本發(fā)明方法相同。屈臣氏橄欖多效護(hù)理油(以下簡(jiǎn)稱(chēng)橄欖油)，批號(hào)fh11，佛山市夢(mèng)莎美容化妝品有限公司生產(chǎn)，衛(wèi)生許可證號(hào)：xk16-1089328；維力康維生素e軟膠囊，廣州白云山制藥總廠生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)，2150005；屈臣氏絲滑柔和脫毛膏，廣州市華安堂生物科技有限公司生產(chǎn)，衛(wèi)生許可證：gd-fda(2011)。

羥脯氨酸(hyp)試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)為20160105；超氧化物岐化酶(sod)試劑盒(wst-1法)，生產(chǎn)批號(hào)為20151230；丙二醛(mda)測(cè)試盒，生產(chǎn)批號(hào)為20151230；谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(gsh-px)測(cè)試盒，生產(chǎn)批號(hào)為20160105；蛋白定量測(cè)試盒，生產(chǎn)批號(hào)為20160105；均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性小鼠120只，體重18-22g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于鼠籠中，每籠15只，每?jī)商旄鼡Q一次墊料，正常飼養(yǎng)給予飼料和飲用水。

1.3儀器

tdl80-2b臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；

pk-s23電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

auy120分析天平，日本島津；

uv-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津。

鼠籠，小鼠注射器，剃毛器等均由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥方劑與藥理系提供。

2方法

2.1動(dòng)物分組、造模及給藥

取昆明種雌性小鼠120只，按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組(空白組)、衰老模型組、橄欖油組、維生素e(vite)組、1號(hào)油高、低劑量組、2號(hào)油高、低劑量組，每組15只?？瞻讓?duì)照組正常飼養(yǎng)，其余每組每日給予3％d-半乳糖溶液頸背部皮下注射一次，造成亞急性衰老模型，連續(xù)注射42天。從造模后第11天起每日在皮下注射d-半乳糖1h后，各給藥組每天予以相應(yīng)油涂抹于背部。觀察并記錄、比較各組小鼠體重和皮膚老化情況。

從造模后第11天起各給藥組每天涂抹相應(yīng)藥物于背部(100μl)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1號(hào)油-高劑量組：100μl1號(hào)油(對(duì)照組羅仙子精油)；

1號(hào)油-低劑量組：50μl1號(hào)油(對(duì)照組羅仙子精油)+50μl橄欖油；

2號(hào)油-高劑量組：100μl2號(hào)油(本發(fā)明羅仙子精油)；

2號(hào)油-低劑量組：50μl2號(hào)油(本發(fā)明羅仙子精油)+50μl橄欖油；

橄欖油組：100μl橄欖油；

維生素e(vite)組：100μl維生素e(含α-生育酚28mg)。

2.2指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第42天，禁食12h，末次涂藥1h后，處死小鼠，切取1cm²皮膚，精密稱(chēng)其濕重，隨即將其放入烘箱中，于80℃烘干12h，精密稱(chēng)其干重，并記錄，求出小鼠皮膚含水量。另取背部皮膚1cm²取下后迅速冰凍保存,擬作皮膚組織勻漿之用。制備10％組織勻漿液，3000r/min離心10min，取上清液備用，用做檢測(cè)小鼠皮膚組織的組織蛋白濃度、hyp含量、sod活性、mda含量、gsh-px活力，具體操作方法參考試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。取皮膚一塊0.5×0.5(單位：cm)的皮膚置10％甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，he染色，做成病理切片，光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄小鼠皮膚病理形態(tài)變化。另取各小鼠的脾臟和胸腺，記錄下每只小鼠的脾臟重量和胸腺重量，再計(jì)算臟器系數(shù)。

計(jì)算公式為：臟器系數(shù)＝臟器重量(單位：g)/體重(單位：g)。

3結(jié)果

3.1小鼠體重變化

將定期記錄的各組小鼠體重整理成圖表，如圖5、表5所示，圖中縱坐標(biāo)表示各組小鼠體重平均值，橫坐標(biāo)表示小鼠組別(系列1-8分別為空白對(duì)照組，衰老模型組，橄欖油組，維生素e組，1號(hào)油高濃度組，1號(hào)油低濃度，2號(hào)油高濃度組和2號(hào)油低濃度組)如下列各圖所示每周記錄各組小鼠的體重均值。

對(duì)實(shí)驗(yàn)期間記錄的小鼠體重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行f檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，整理得到下表。

表5實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重變化

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01

根據(jù)小鼠體重?cái)?shù)據(jù)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示(表5)，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前各組體重比較無(wú)顯著差異(p均大于0.05)。實(shí)驗(yàn)期間小鼠體重雖有波動(dòng)，但至第6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，橄欖油組、vite組、1號(hào)精油高/低組、2號(hào)精油高/低組均對(duì)小鼠體重?zé)o顯著性影響。

3.2小鼠脾臟與胸腺臟器系數(shù)

表6小鼠臟器系數(shù)

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01

根據(jù)小鼠臟器系數(shù)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)結(jié)果，顯示各組之間相互比較無(wú)顯著性差異，如表6所示，即：空白組與衰老模型組比較，p＞0.05，提示在此造模時(shí)間內(nèi)，d-半乳糖對(duì)衰老模型組的小鼠的免疫器官可能無(wú)顯著影響；橄欖油組，vite組，1號(hào)精油高、低組，2號(hào)精油高、低組均對(duì)小鼠免疫器官無(wú)顯著性影響。

3.3小鼠皮膚hyp含量

表7小鼠皮膚hyp(羥脯氨酸)含量

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01

如表7所示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠皮膚勻漿中hyp含量有極顯著下降(p＜0.01)，結(jié)合小鼠皮膚老化情況圖片，說(shuō)明造模成功。與衰老模型組相比，各組別中小鼠皮膚中hyp含量數(shù)值均比其要高。其中橄欖油組和1號(hào)精油高劑量組的小鼠皮膚hyp含量與衰老模型組相比，提高的程度無(wú)顯著性差異(p＞0.05)；而維生素e組、1號(hào)精油低劑量組、2號(hào)精油高劑量組和低劑量組的小鼠皮膚hyp含量與衰老模型組相比有較為顯著的提高(p＜0.05)，其中2號(hào)精油高、低劑量組中hyp含量與維生素e組中hyp的含量接近，高于1號(hào)精油低劑量組；上述結(jié)果說(shuō)明1號(hào)精油低劑量組、2號(hào)精油高劑量組和低劑量組均具有抗衰老作用，其中2號(hào)精油(本發(fā)明方法制備的羅仙子精油)抗衰老效果更佳。

3.4小鼠皮膚病理形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)各組小鼠皮膚組織切片，he染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照(見(jiàn)圖6)，結(jié)果表明：

1)空白對(duì)照組：光鏡下可見(jiàn)小鼠皮膚形態(tài)正常，表皮的基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層及角質(zhì)層界限清楚，真皮位于表皮下面，此層內(nèi)有血管、汗腺、毛囊和皮脂腺等，小鼠皮膚真皮膠原纖維束細(xì)長(zhǎng)，排列成束狀，緊密(見(jiàn)圖6a)。

2)衰老模型組：光鏡下可見(jiàn)皮膚組織生長(zhǎng)受到障礙，真皮層明顯變薄，毛囊與皮脂腺數(shù)量銳減，膠原纖維層明顯減少，排列疏松，部分纖維明顯斷裂，排列紊亂(見(jiàn)圖6b)。

3)維生素e組：可見(jiàn)小鼠皮膚生長(zhǎng)良好，毛囊數(shù)較衰老模型組明顯增加，膠原纖維束呈波紋狀排列，較緊密(見(jiàn)圖6c)。

4)橄欖油組組：小鼠皮膚生長(zhǎng)較好，與衰老模型組比較，真皮厚度略有增加，毛囊數(shù)增加不明顯(見(jiàn)圖6d)。

5)1號(hào)油高、低劑量組：小鼠皮膚生長(zhǎng)較好，表皮與真皮界線可分，表皮較規(guī)則，真皮厚度較平均，染色較均勻，細(xì)胞層數(shù)較模型組有所增加(見(jiàn)圖6e)。1號(hào)油低劑量組小鼠真皮厚度和毛囊數(shù)較衰老模型組均有增加，膠原纖維束排列成束狀，(見(jiàn)圖6f)。

6)2號(hào)油高、低劑量組：小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，生長(zhǎng)良好，皮膚增厚，表皮與真皮界線清晰，表皮規(guī)則，真皮層較厚，染色均勻致密，細(xì)胞層數(shù)增多，皮下脂肪豐富。毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)完整，毛囊數(shù)與衰老模型組相比明顯增加，膠原纖維排列較緊密，與維生素e組相似(見(jiàn)圖6g和h)。

上述結(jié)果說(shuō)明1號(hào)精油高/低劑量組、2號(hào)精油高/低劑量組均可改善、恢復(fù)衰老皮膚外觀和組織構(gòu)造，具有抗衰老作用，且2號(hào)精油(本發(fā)明方法制備的羅仙子精油)抗衰老效果更佳。

3.5各組小鼠皮膚含水量

由表8可得，與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠皮膚含水量較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說(shuō)明小鼠亞急性衰老模型造模成功。與衰老模型組相比，維生素e組，橄欖油組及羅仙子脂肪油組的小鼠皮膚含水量均增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，且給予2號(hào)精油(本發(fā)明方法制備的羅仙子精油)的小鼠皮膚含水量略高于1號(hào)精油組。

表8各組小鼠皮膚含水量比較

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

3.6各組小鼠sod活力比較

由表9可得，與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠皮膚sod(超氧化物歧化酶)活力明顯較低，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，說(shuō)明小鼠亞急性衰老模型造模成功。與衰老模型組相比，2號(hào)油(本發(fā)明方法制備的羅仙子精油)高、低濃度組小鼠皮膚sod活力明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

表9各組小鼠皮膚sod活力比較

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

3.7各組小鼠皮膚mda含量比較

mda(丙二醛)是反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的一個(gè)指標(biāo)，膜脂過(guò)氧化作用是對(duì)細(xì)胞有害的，會(huì)慢慢將細(xì)胞膜系統(tǒng)瓦解，并最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。在正常情況下，mda含量很低。而一般在逆境情況下，都會(huì)隨著時(shí)間的推移和逆境的積累，mda含量顯著增高。

由表10可得，與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠皮膚mda(丙二醛)含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說(shuō)明小鼠亞急性衰老模型造模成功。與衰老模型組相比，維生素e組、1號(hào)油低濃度組、2號(hào)油高、低濃度組小鼠皮膚的mda含量均明顯降低，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，橄欖油組、1號(hào)油高濃度組小鼠皮膚的mda含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

表10各組小鼠mda含量比較

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

3.8各組小鼠皮膚gsh-px活力比較

由表11可得，與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠皮膚gsh-px(谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)活力較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說(shuō)明小鼠亞急性衰老模型造模成功。維生素e組、1號(hào)高濃度組、2號(hào)油高、低濃度組小鼠皮膚組織中的gsh-px活力明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

表11各組小鼠gsh-px活力比較

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

綜上所述，本發(fā)明方法制備的羅仙子精油能提高皮膚的抗氧化能力，具有改善、恢復(fù)衰老皮膚外觀和組織結(jié)構(gòu)的作用，抗皮膚衰老效果確切。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。