本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種暗紫貝母野生鱗莖快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
暗紫貝母(fritillariaunibracteatahsiaoetk.c.hsia)為百合科貝母屬植物，是我國(guó)特有的名貴中藥材，也是貝母中經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的類群，它以地下干燥鱗莖入藥，具有止咳化痰、清熱潤(rùn)肺及散結(jié)等多重藥效(中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1980；徐國(guó)鈞，1997；韻海霞，2010)。尤其適合于老年人和兒童久治不愈的頑固性虛寒咳嗽。該物種主要分布于四川西北部(松潘、若爾蓋、馬爾康、刷經(jīng)寺、洪源、理縣)、青海南部以及甘肅南部等地，生長(zhǎng)于海拔2800～4500m的高山草地以及高山草甸和灌叢草地中，分布范圍十分有限，并且生長(zhǎng)過程中對(duì)土壤、氣候、溫度等生長(zhǎng)環(huán)境條件要求苛刻(馬吉義，2011)。由于暗紫貝母在中藥材市場(chǎng)上的需求量逐年攀升，導(dǎo)致人們過度采挖，野生資源極度匱乏，商品供不應(yīng)求，暗紫貝母價(jià)格不斷上漲，但是限于生長(zhǎng)環(huán)境特殊，鱗莖生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，從種子播種到長(zhǎng)成商品藥材一般需要四年時(shí)間(gaosl，1999；馬吉義，2011)，且種子萌發(fā)率低，大大限制了暗紫貝母的人工規(guī)模化栽培。因此如何保護(hù)這一瀕危種質(zhì)資源，擴(kuò)大其種植規(guī)模以滿足市場(chǎng)需求，就成為一個(gè)急待解決的問題。
近年來關(guān)于暗紫貝母的研究報(bào)道日趨增多，其中，較多的研究主要在化學(xué)成分的測(cè)定和比較(kanekok，1986；余世春，1990和1992；顏曉燕，2012)；藥理作用上多針對(duì)川貝母，對(duì)暗紫貝母的的研究相對(duì)較少(高山林，2000)。在生態(tài)學(xué)方面，研究的內(nèi)容涉及到暗紫貝母的生態(tài)分布及植被性質(zhì)(陳士林，1993和1997；徐波，2013)，以及暗紫貝母?jìng)€(gè)體生長(zhǎng)和物候與融雪梯度和海拔梯度之間的關(guān)系(陳文年，2012和2013)。人工種子繁殖上，由于種子采集困難，休眠期長(zhǎng)，且存在形態(tài)后熟和生理后熟，播種后出苗率低，難以形成規(guī)?；N植(于婧，2008)。組織培養(yǎng)是利用生物技術(shù)快速繁育植物種苗的主要手段之一，對(duì)于利用組培技術(shù)繁殖暗紫貝母的研究上雖有一定的報(bào)道(蔡朝輝等，1992；李隆云等，1995；高山林等，2000)，但多限于試驗(yàn)性的探討以及組培鱗莖和野生鱗莖的化學(xué)成分比較分析，快速繁育種苗的技術(shù)體系尚未成熟，離幼苗規(guī)?；a(chǎn)還有一定的距離；對(duì)組培苗的煉苗馴化栽培方面亦未見報(bào)道。
暗紫貝母的增殖增殖率不高、在增殖過程中易出現(xiàn)玻璃化和褐化現(xiàn)現(xiàn)，生根難和粗短肉質(zhì)根出現(xiàn)頻率較高等系列問題，影響整個(gè)快速繁殖體系。總體而言，目前暗紫貝母的人工繁育及栽培實(shí)際上還處于實(shí)驗(yàn)階段，尚未形成真正意義上的規(guī)?；N植。這其中，不能大量地生產(chǎn)人工種苗正是限制其規(guī)模化種植的瓶頸。鑒于人們對(duì)暗紫貝母藥用價(jià)值的擴(kuò)大認(rèn)識(shí)后，必將進(jìn)一步加速市場(chǎng)的需求量，野生資源現(xiàn)已極度匱乏，這就為暗紫貝母人工規(guī)?；耘嗵峁┢鯔C(jī)。因此，通過生物技術(shù)手段解決暗紫貝母栽培過程中的種苗問題將是發(fā)展暗紫貝母規(guī)?；N植的必然趨勢(shì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種暗紫貝母野生鱗莖快速繁殖的方法，采用l16(45)正交試驗(yàn)法和系統(tǒng)試驗(yàn)法篩選適宜暗紫貝母種苗快速繁育的培養(yǎng)基配方，解決了暗紫貝母小鱗片無菌繁殖過程中增殖率不高、易褐化、生根難等技術(shù)問題。
其具體技術(shù)方案為：
一種暗紫貝母野生鱗莖快速繁殖的方法，包括以下步驟：
步驟1、無菌小鱗片的獲得：從野外采集暗紫貝母2-3年生鱗莖，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒處理，處理過程為先在自來水中用濕棉布清洗干凈鱗莖外表面泥沙；然后從鱗莖基部分離鱗片，自來水沖洗2-12h；再轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，依次用70％酒精處理30-40s，無菌水沖洗2-3次，0.1％hgcl處理6-10min，無菌水沖洗3-5次；最后轉(zhuǎn)接入ms基本培養(yǎng)基進(jìn)行模擬原生境環(huán)境溫條件暗培養(yǎng)，晝夜溫度為18-20℃/8-12℃，期間注意觀察污染情況，及時(shí)轉(zhuǎn)接未污染材料至新的ms培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-30d后即可獲得一定數(shù)量的無菌小鱗片。
步驟2、無菌小鱗片愈傷組織和叢生芽的誘導(dǎo)：在前期測(cè)定暗紫貝母原生境地土壤營(yíng)養(yǎng)元素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)l16(45)正交試驗(yàn)，考慮母液類型、tdz濃度、kt濃度、iaa濃度和naa濃度5個(gè)因素，優(yōu)化無菌小鱗片愈傷組織和叢生芽誘導(dǎo)的配方。其中愈傷組織誘導(dǎo)的適宜配方為ms+0.5-1.0mg/ltdz+0.5-1.0mg/lkt+0.1-0.2mg/liaa+0.1-0.2mg/lnaa+瓊脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；增殖配方為自配1+0.5-1.0mg/ltdz+0.05-0.1mg/lkt+0.05-0.1mg/liaa+0.01-0.05mg/lnaa+瓊脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l，其中自配1根據(jù)暗紫貝母原生境地土壤營(yíng)養(yǎng)元素含量而設(shè)計(jì)，其詳細(xì)組分為5.794mg/lnh4no3+42.372mg/l(nh4)2hpo4+110.91mg/lcacl2.2h2o+13.913mg/lmgso4+16.895mg/lkh2po4+24.186mg/lna2hpo4培養(yǎng)條件與步驟1相同，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)45d后，誘導(dǎo)率可達(dá)63％左右，小鱗片直接增殖培養(yǎng)75d，增殖率可達(dá)775％左右。
步驟3、叢生小鱗莖的增殖培養(yǎng)：基于前期研究發(fā)現(xiàn)，暗紫貝母叢生小鱗莖在增殖過程中易出現(xiàn)水浸狀玻璃化和褐化現(xiàn)象，本研究在轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基后，采取了10-12℃低溫連續(xù)培養(yǎng)30-45d后，再進(jìn)行正常變溫暗培養(yǎng)，可有效防止再生鱗莖在繼代增殖過程中的玻璃化和褐化現(xiàn)象。培養(yǎng)基采用自配1+1.0-2.0mg/l6-ba+0.1-0.2mg/lnaa+瓊脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l，晝夜溫度為18-20℃/8-12℃，培養(yǎng)90d后，增殖率可達(dá)532％左右。
步驟4、再生小鱗莖的生根誘導(dǎo)：待再生小鱗莖長(zhǎng)至一定大小后，將其分離成單個(gè)小鱗莖，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。暗紫貝母生根困難、粗壯肉質(zhì)根出現(xiàn)頻率較高，因此在進(jìn)行生根培養(yǎng)時(shí)要篩選健壯的再生小鱗莖為生根材料，生根前需提前在4-12℃低溫下培養(yǎng)10-20d，以抑制小鱗莖玻璃化和增加生根率，平均每一枚再生小鱗莖的生根率可達(dá)4-7條，培養(yǎng)基配方為自配1+naa0.1-0.5mg/l，培養(yǎng)條件同步驟1，待根長(zhǎng)0.5-1cm時(shí)即可開始移栽馴化。
步驟5、生根小鱗莖的移栽馴化：生根小鱗莖的出瓶時(shí)間最好選擇每年的4-5月，將無菌生根小鱗莖連同培養(yǎng)瓶一起運(yùn)往原生境地進(jìn)行馴化栽培，移栽前將生根小鱗莖小心從培養(yǎng)瓶取出，洗凈根表面培養(yǎng)基，再放入80％甲基托布津1000倍液中浸泡1-5min后，移栽到原生境土中，期間注意人工調(diào)控?zé)捗鐪囟葹?2-20℃，濕度80％左右；遮陰80％以上，馴化時(shí)間為1個(gè)月，待小鱗莖芽出土后，可逐漸去除遮陽網(wǎng)。
進(jìn)一步，步驟2中，所述愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為ms+1.0mg/ltdz+1.0mg/lkt+0.2mg/liaa+0.2mg/lnaa+瓊脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；鱗莖增殖的培養(yǎng)基配方自配2+2.0mg/ltdz+0.1mg/lkt+0.05mg/liaa+0.2mg/lnaa+瓊脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；步驟3中，所述培養(yǎng)基配方為自配1+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+瓊脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；步驟4中，所述培養(yǎng)基配方為自配1+naa0.2mg/l。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
采用本發(fā)明的技術(shù)方案，暗紫貝母增殖率較前人研究有所提高；解決了暗紫貝母再生小鱗莖增殖過程中易褐化、生根難、畸形根多等問題。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
一種暗紫貝母野生鱗莖快速繁殖的方法，包括以下步驟：
步驟1、無菌小鱗片的獲得：從野外采集暗紫貝母2-3年生鱗莖，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒處理，處理過程為先在自來水中用濕棉布清洗干凈鱗莖外表面泥沙；然后從鱗莖基部分離鱗片，自來水沖洗2-12h；再轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，依次用70％酒精處理30-40s，無菌水沖洗2-3次，0.1％hgcl處理6-10min，無菌水沖洗3-5次；最后轉(zhuǎn)接入ms基本培養(yǎng)基進(jìn)行模擬原生境環(huán)境溫條件暗培養(yǎng)，晝夜溫度為18-20℃/8-12℃，期間注意觀察污染情況，及時(shí)轉(zhuǎn)接未污染材料至新的ms培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-30d后即可獲得一定數(shù)量的無菌小鱗片。
步驟2、無菌小鱗片愈傷組織和叢生芽的誘導(dǎo)：在前期測(cè)定暗紫貝母原生境地土壤營(yíng)養(yǎng)元素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)l16(45)正交試驗(yàn)，考慮母液類型、tdz濃度、kt濃度、iaa濃度和naa濃度5個(gè)因素，優(yōu)化無菌小鱗片愈傷組織和叢生芽誘導(dǎo)的配方。其中愈傷組織誘導(dǎo)的適宜配方為ms+0.5-1.0mg/ltdz+0.5-1.0mg/lkt+0.1-0.2mg/liaa+0.1-0.2mg/lnaa+瓊脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；增殖配方為自配1+0.5-1.0mg/ltdz+0.05-0.1mg/lkt+0.05-0.1mg/liaa+0.01-0.05mg/lnaa+瓊脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l，其中自配1根據(jù)暗紫貝母原生境地土壤營(yíng)養(yǎng)元素含量而設(shè)計(jì)。培養(yǎng)條件與步驟1相同。
步驟3、叢生小鱗莖的增殖培養(yǎng)：基于前期研究發(fā)現(xiàn)，暗紫貝母叢生小鱗莖在增殖過程中易出現(xiàn)玻璃化和褐化現(xiàn)象，本研究在轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基后，采取了10-12℃低溫連續(xù)培養(yǎng)30-45d后，再進(jìn)行正常變溫暗培養(yǎng)，可有效防止再生鱗莖在繼代增殖過程中的玻璃化和褐化現(xiàn)象。培養(yǎng)基采用自配1+1.0-2.0mg/l6-ba+0.1-0.2mg/lnaa+瓊脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l，晝夜溫度為18-20℃/8-12℃。
步驟4、再生小鱗莖的生根誘導(dǎo)：待再生小鱗莖長(zhǎng)至一定大小后，將其分離成單個(gè)小鱗莖，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。暗紫貝母生根困難、粗壯肉質(zhì)根出現(xiàn)頻率較高，因此在進(jìn)行生根培養(yǎng)時(shí)要篩選健壯的再生小鱗莖為生根材料，生根前需提前在4-12℃低溫下培養(yǎng)10-20d，以抑制小鱗莖玻璃化和增加生根率，培養(yǎng)基配方為自配1+naa0.1-0.5mg/l，培養(yǎng)條件同步驟1，待根長(zhǎng)0.5-1cm時(shí)即可開始移栽馴化。
步驟5、生根小鱗莖的移栽馴化：生根小鱗莖的出瓶時(shí)間最好選擇每年的4-5月，將無菌生根小鱗莖連同培養(yǎng)瓶一起運(yùn)往原生境地進(jìn)行馴化栽培，移栽前將生根小鱗莖小心從培養(yǎng)瓶取出，洗凈根表面培養(yǎng)基，再放入80％甲基托布津1000倍液中浸泡1-5min后，移栽到原生境土中，期間注意人工調(diào)控?zé)捗鐪囟葹?2-20℃，濕度80％左右；遮陰80％以上，待小鱗莖芽出土后，可逐漸去除遮陽網(wǎng)。
步驟4中，所述培養(yǎng)基配方為自配1+naa0.2mg/l。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn)單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。