本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于大豆體細(xì)胞胚狀體持續(xù)增殖和繼代保存的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

大豆是世界上最重要的油料作物和高蛋白糧食作物之一，也是人類植物性蛋白和油脂的重要來源。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用為大豆功能基因組學(xué)的研究及新品種培育提供了有效手段。作為推廣時間最早、推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，僅2014年，全球轉(zhuǎn)基因大豆種植面積就達(dá)9000萬公頃，占大豆總種植面積的82％，占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的49％。轉(zhuǎn)基因大豆已成為世界大豆主產(chǎn)國大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要動力。

組織培養(yǎng)作為轉(zhuǎn)基因大豆研究和育種基礎(chǔ)和前提，外植體細(xì)胞能否再生及再生頻率的高低在很大程度上決定了大豆轉(zhuǎn)化效率，并在一定程度上影響轉(zhuǎn)基因大豆育種效率。目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化中外植體細(xì)胞再生方式主要有2種，即不定芽器官發(fā)生(organogenesis)和體細(xì)胞胚發(fā)生(somaticembryogenesis)。大豆子葉節(jié)、莖尖、下胚軸、初生葉、花序等均可以通過不定芽器官發(fā)生方式再生(hincheemaw，1988；pazmm，2006；olhoftpm，2001；liuhk，2004；kots，2003；zhongh，2009)；而由大豆未成熟子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚狀體主要通過胚胎發(fā)生的方式再生。與不定芽器官發(fā)生方式相比，體細(xì)胞胚狀體發(fā)生方式的一個主要優(yōu)勢是體細(xì)胞胚體為單細(xì)胞起源，可以有效避免嵌合體的產(chǎn)生。因此，體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式也被認(rèn)為是解決大豆遺傳轉(zhuǎn)化中嵌合體問題的最有潛力的再生體系。另外，體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式的一個重要特點(diǎn)是可以模擬大豆合子胚發(fā)育過程，因而對于研究大豆胚體發(fā)育、種子形成等重要生理過程具有其獨(dú)特的意義。

1991年finer等首次利用基因槍法轉(zhuǎn)化大豆懸浮體細(xì)胞團(tuán)并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。stewart等(1996)利用該方法將抗蟲基因cry1ac導(dǎo)入大豆并獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆植株。同年，hadi等(1996)利用基因槍法將12個基因同時導(dǎo)入大豆體細(xì)胞團(tuán)，并獲得了轉(zhuǎn)基因大豆植株。在此基礎(chǔ)上，santarem等(1999)，ponappa等(1999)和khalafalla等(2005)進(jìn)一步研究了影響基因槍轉(zhuǎn)化效率的因素，并對基因槍轉(zhuǎn)化法進(jìn)行優(yōu)化。由于利用體細(xì)胞胚狀體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時不存在與微生物之間的互作，其轉(zhuǎn)化效率主要與胚狀體狀態(tài)、轟擊參數(shù)以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生率有關(guān)。如hazel等(1998)發(fā)現(xiàn)短時間培養(yǎng)(＜6個月)的大豆懸浮體細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)化效率極低，而培養(yǎng)6個月后的轉(zhuǎn)化效率則明顯提高。王曉春等(2005)發(fā)現(xiàn)利用基因槍轟擊球形期體細(xì)胞團(tuán)時，其轉(zhuǎn)化效率(8.0％)要顯著高于發(fā)育晚期的體細(xì)胞胚(0％)。finer等(1988)、parrott等(1989)、bailey等(1993)采用大豆體細(xì)胞胚狀體懸浮培養(yǎng)方法開展轉(zhuǎn)基因研究獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株。由于新生胚主要分布在舊胚表面，在進(jìn)行液體培養(yǎng)篩選時轉(zhuǎn)化胚體可以和篩選劑充分接觸，因而有效提高了篩選效果。其缺點(diǎn)是體細(xì)胞團(tuán)組織培養(yǎng)過程復(fù)雜，培養(yǎng)周期較長，易產(chǎn)生體細(xì)胞突變及再生苗不結(jié)實(shí)等情況。利用大豆未成熟子葉開展轉(zhuǎn)基因研究的一個主要問題是外植體取樣時間受季節(jié)和環(huán)境的影響。外植體取樣時間及發(fā)育狀態(tài)通常會嚴(yán)重影響誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生頻率和再生頻率。另外，在自然條件下，外植體取樣周期也受季節(jié)的嚴(yán)重限制。因此，如何實(shí)現(xiàn)大豆胚狀體的持續(xù)增殖與保存，為大豆遺傳轉(zhuǎn)化提供持續(xù)提供高分生能力且同步化的體細(xì)胞胚狀體，對于開展大豆轉(zhuǎn)基因研究和育種具有重要的意義?；谶@一理解，本發(fā)明利用大豆未成熟子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚狀體，在增殖培養(yǎng)基和特定培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)其持續(xù)增殖和繼代保存。在此基礎(chǔ)上，提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種大豆體細(xì)胞胚狀體持續(xù)增殖和繼代保存的培養(yǎng)方法。利用該改良培養(yǎng)方法可以保持大豆體細(xì)胞胚狀體持續(xù)增殖3年以上仍具有極強(qiáng)的再生能力，可以為大豆遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因研究持續(xù)提供高分生能力的外植體材料

采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：：

一種用于大豆體細(xì)胞胚狀體持續(xù)增殖和繼代保存的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)取開花后15-20天的大豆未成熟子葉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于黑暗條件下培養(yǎng)6-8周后，在外植體周圍誘導(dǎo)產(chǎn)生成簇、黃綠色的球形體細(xì)胞胚狀體；

(2)將球形胚狀體轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為400-1000lux低光照強(qiáng)度，光周期為16小時光/8小時暗交替，培養(yǎng)溫度25±1℃，每2-3周換一次增殖培養(yǎng)基，連續(xù)繼代培養(yǎng)3年以上。

作為優(yōu)選，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括以下成分：1×ms鹽、1×b5有機(jī)、2，4-d40mg/l、蔗糖60g/l、瓊脂8g/l，ph5.7。

作為優(yōu)選，所述增殖培養(yǎng)基包含以下成分：1×改良ms鹽、1×b5有機(jī)，天門冬酰胺670-750mg/l、2，4-d10-20mg/l、蔗糖10-30g/l、植物凝膠3-5g/l，ph5.7-6.2。

作為優(yōu)選，所述1×改良ms鹽包含以下成分：

硫酸銨(nh4)2so4：463mg/l

硝酸鉀kno3：2830mg/l

磷酸二氫鉀kh2po4：170mg/l

硫酸鎂mgso4·7h2o：370mg/l

氯化鈣cacl2·2h2o：440mg/l

乙二胺四乙酸二鈉na2edta：37.24mg/l

硫酸亞鐵feso4·7h2o：27.84mg/l

硫酸錳mnso4·h2o：16.9mg/l

硫酸鋅znso4·h2o：8.6mg/l

硫酸銅cuso4·7h2o：0.025mg/l

碘化鉀kl：0.83mg/l

氯化鈷cocl2·6h2o：0.025mg/l

硼酸h3bo3：6.2mg/l

鉬酸鈉na2moo4·2h2o：0.25mg/l。

作為優(yōu)選，所述1×b5有機(jī)包含以下成分：

肌醇myo-inositol：100mg/l

煙酸nicotinicacid：1mg/l

鹽酸吡哆醇pyridoxine-hcl：1mg/l

鹽酸硫胺素thiamine-hcl：10mg/l。

1×ms鹽

利用大豆未成熟子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚狀體，在增殖培養(yǎng)基和特定培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)持續(xù)增殖和繼代保存；

所述特定培養(yǎng)條件為400-1000lux低光照強(qiáng)度，光周期為16小時光/8小時暗，培養(yǎng)溫度25±1℃，每2-3周繼代一次；持續(xù)增殖和繼代保存3年以上的大豆體細(xì)胞胚狀體可以正常萌發(fā)并再生為完整的植株。

進(jìn)一步地，本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

1.取開花后15-20天的大豆未成熟子葉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在黑暗、26℃條件下培養(yǎng)約6-8周左右，在外植體周圍誘導(dǎo)產(chǎn)生成簇、黃綠色的球形體細(xì)胞胚狀體。

2.將處于球形胚狀體階段的外植體轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為400-1000lux低光照強(qiáng)度，光周期為16小時光/8小時暗，培養(yǎng)溫度25±1℃，每2-3周繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)3年以上。

3.將連續(xù)增殖3年以上的球形胚狀體轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(1×ms鹽，1×b5有機(jī)，麥芽糖60g/l，活性炭4-5g/l，植物凝膠3-5g/l，ph6.2-6.4)上，直至球形胚狀體分化為子葉形胚狀體；

4.將子葉形胚狀體置于培養(yǎng)皿中干燥處理2天，然后轉(zhuǎn)移至萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2ms鹽，1/2鐵鹽，1×b5有機(jī)，蔗糖30g/l，植物凝膠3.0g/l，ph7.0)中進(jìn)行培養(yǎng)，直至胚狀體再生為完整的小植株。

ms培養(yǎng)基是murashige和skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，其特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營養(yǎng)和生理需要。在本發(fā)明中，ms培養(yǎng)基中氮源(nh4no3和kno3)成份替換為(nh4)2so4和kno3

b5有機(jī)成份為：肌醇100mg/l，鹽酸1mg/l；鹽酸吡哆醇1mg/l，硫胺素10mg/l

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的一種用于大豆體細(xì)胞胚狀體持續(xù)增殖和繼代保存的改良培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，利用該方法繼代保存的大豆體細(xì)胞胚狀體可以持續(xù)增殖3年以上仍具有極強(qiáng)的再生能力，可以為大豆組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因研究持續(xù)提供高分生能力且同步化的體細(xì)胞胚狀體材料。

附圖說明：

圖1為持續(xù)增殖1年以上的大豆胚狀體視圖；

圖2為持續(xù)增殖3年以上的大豆胚狀體視圖；

圖3為胚狀體分化視圖；

圖4為胚狀體萌發(fā)再生視圖；

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但下述實(shí)施例僅僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非全部?；趯?shí)施方式中的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1：栽培大豆jack體細(xì)胞胚狀體持續(xù)增值及繼代保存的方法

選取開花后15-20天的大豆幼莢(品種為“jack”)，0.5％次氯酸鈉清毒10分鐘，無菌水沖洗5次。然后在無菌條件下取出未成熟子葉(～5mm)，置于無菌皿中4℃下處理2天。

去掉種皮，將幼胚分成兩瓣，背軸面朝上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1×ms鹽，1×b5有機(jī)，2，4-d40mg/l，蔗糖60g/l，瓊脂8g/l，ph5.7)上，每個皿接10個一對子葉，于黑暗條件下培養(yǎng)6-8周后，在外植體周圍誘導(dǎo)產(chǎn)生成簇、黃綠色的球形體細(xì)胞胚狀體。

將球形胚狀體轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基(1×改良ms鹽，1×b5有機(jī)，天門冬酰胺670-750mg/l，2，4-d10-20mg/l，蔗糖10-30g/l，植物凝膠3-5g/l，ph5.7-6.2)中持續(xù)增增。培養(yǎng)條件為400-1000lux低光照強(qiáng)度，光周期為16小時光/8小時暗，培養(yǎng)溫度25±1℃，每2-3周繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)3年以上。

將持續(xù)增殖培養(yǎng)3年以上的胚狀體轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(1×ms鹽，1×b5有機(jī)，麥芽糖60g/l，活性炭4-5g/l，植物凝膠3-5g/l，ph6.2-6.4)上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，直至形成子葉形胚狀體；

將子葉形胚狀體置于培養(yǎng)皿中干燥處理2天，然后轉(zhuǎn)移至萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2ms鹽，1/2鐵鹽，1×b5有機(jī)，蔗糖30g/l，植物凝膠3.0g/l，ph7.0)中進(jìn)行培養(yǎng)，直至再生為完整的小植株。

將再生植株轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)缽中溫室中進(jìn)行煉苗處理10-15天，然后轉(zhuǎn)移至溫室中生長結(jié)實(shí)。

實(shí)施例2：雜交大豆體細(xì)胞胚狀體持續(xù)增值及繼代保存的方法

選取開花后15-20天的大豆幼莢(品種為“雜交豆5號”)，0.5％次氯酸鈉清毒10分鐘，無菌水沖洗5次。然后在無菌條件下取出未成熟子葉(～5mm)，4℃下處理2天。

去掉種皮，將未成熟子葉背軸面朝上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1×ms鹽，1×b5有機(jī)，2，4-d40mg/l，蔗糖60g/l，瓊脂8g/l，ph5.7)上，于黑暗條件下培養(yǎng)6-8周后，在外植體周圍產(chǎn)生黃綠色的球形體細(xì)胞胚狀體。

將球形胚狀體轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基(1×改良ms鹽，1×b5有機(jī)，天門冬酰胺670-750mg/l，2，4-d10-20mg/l，蔗糖10-30g/l，植物凝膠3-5g/l，ph5.7-6.2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為400-1000lux低光照強(qiáng)度，光周期為16小時光/8小時暗，培養(yǎng)溫度25±1℃，每2-3周繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)3年以上。

將持續(xù)增殖培養(yǎng)3年以上的胚狀體轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(1×ms鹽，1×b5有機(jī)，麥芽糖60g/l，活性炭4-5g/l，植物凝膠3-5g/l，ph6.2-6.4)上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，直至形成子葉形胚狀體；

將子葉形胚狀體置于培養(yǎng)皿中干燥處理2天，然后轉(zhuǎn)移至萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2ms鹽，1/2鐵鹽，1×b5有機(jī)，蔗糖30g/l，植物凝膠3.0g/l，ph7.0)中進(jìn)行培養(yǎng)，直至再生為完整的小植株。

將再生植株轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)缽中溫室中進(jìn)行煉苗處理10-15天，然后轉(zhuǎn)移至溫室中生長結(jié)實(shí)。

如圖1-4所示，

圖1所示為持續(xù)增殖1年以上的大豆胚狀體；

圖2所示為持續(xù)增殖3年以上的大豆胚狀體；

圖3所示為胚狀體分化；

圖4所示為胚狀體萌發(fā)再生。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的僅為本發(fā)明的優(yōu)選例，并不用來限制本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。