本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種用于大規(guī)模種植的白木香組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

白木香(aquilariasinensis)，又名莞香、女兒香、土沉香，為瑞香科(thmelaceae)植物。白木香樹為多年生常綠的木本植物，是香料及藥用植物，也是我國(guó)唯一能夠生產(chǎn)沉香的植物資源。野生資源主要分布在廣西省、海南省和福建省等省市，有少部分分布在云南的西雙版納和思茅等地區(qū)。白木香樹是一種名貴的藥材，高級(jí)的香料，隨著國(guó)際市場(chǎng)需求數(shù)量的增大，其價(jià)格也不斷的上漲。上等沉香藥材價(jià)格每公斤高達(dá)萬(wàn)元之上，使其在市場(chǎng)上供不應(yīng)求。白木香其味辛、苦，性溫，具納氣平喘、有止痛止吐的功效，主要用于治療胃寒嘔吐、腎虛氣喘、胸腹?jié)q悶疼痛。由此帶來的過度伐木和采香，使得土沉香資源面臨滅絕，白木香樹1987年被評(píng)為國(guó)家珍稀瀕危三級(jí)保護(hù)植物，其次1999年又被國(guó)家批準(zhǔn)為國(guó)務(wù)院二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。

白木香樹是屬于自然野生樹種，繁殖方式主要是通過種子繁殖，但目前野生成年的母樹已經(jīng)極其稀少，無(wú)法產(chǎn)生大量的種子，造成大面積推廣種植較困難;而且種子繁殖的種苗較容易產(chǎn)生變異，難保留良種優(yōu)勢(shì)。

植物組織培養(yǎng)是一種將植物體的部分細(xì)胞或組織與母體分離，在適當(dāng)?shù)臈l件下加以培養(yǎng)，使它們能夠生長(zhǎng)、發(fā)育、分化與增殖的技術(shù)。原理是來自植物細(xì)胞的全能性分化能力，也就是植物體內(nèi)的某一類細(xì)胞，能夠獨(dú)立發(fā)育并且分化成為完整的植物成體。植物組織培養(yǎng)能夠以少量的母體培養(yǎng)出大量的植物，這使植物組織培養(yǎng)有許多的用途，例如基礎(chǔ)植物學(xué)與遺傳學(xué)研究，以及農(nóng)業(yè)上的育種與品種保留。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為cn104686341b的中國(guó)發(fā)明專利，公開了一種白木香的組織培養(yǎng)技術(shù)，涉及白木香（aquilariasinensis）通過離體快繁技術(shù)獲得優(yōu)質(zhì)種苗的育苗方法。該方法以白木香帶芽莖段為外植體，經(jīng)過外植體消毒、叢生芽誘導(dǎo)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程從而建立了白木香組織培養(yǎng)快速繁殖體系，加速白木香良種的推廣和資源開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。但上述方法中叢生芽的量少，長(zhǎng)出的叢生芽顏色偏黃，生命力不旺盛。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種叢生芽的量多，得到的叢生芽葉大而綠，生命力旺盛的用于大規(guī)模種植的白木香組織培養(yǎng)方法。

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：用于大規(guī)模種植的白木香組織培養(yǎng)方法，包括無(wú)菌苗培養(yǎng)、芽誘導(dǎo)及芽增殖、生根壯苗培養(yǎng)和煉苗移栽。無(wú)菌苗培養(yǎng)步驟包括將白木香種子胚先用無(wú)菌水清洗，再用70~80%酒精漂洗，無(wú)菌水清洗后再放入10~18%次氯酸鈉中浸泡，再用無(wú)菌水清洗，并放入種子萌發(fā)培養(yǎng)基中。種子萌發(fā)培養(yǎng)基為添加了0.7~1.5mg/l的ga3的ms培養(yǎng)基。種子消毒較容易，污染率低，直接取白木香腋芽作為外植體消毒較困難，污染率高。

芽誘導(dǎo)和芽增殖步驟包括去除將幼苗子葉去掉，留下頂芽轉(zhuǎn)接到添加0.7~1.5mg/l6-ba、0.07~0.15mg/lnaa、0.4~0.6mg/lkt和活性短肽的ms培養(yǎng)基，即芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成叢生芽。選取無(wú)菌苗的頂芽為外植體縮短了叢生芽的誘導(dǎo)時(shí)間；子葉和不帶芽的莖段只能誘導(dǎo)出大量的愈傷組織，所以外植體選為無(wú)菌苗頂芽。上述方法培育的叢生芽的量多，得到的叢生芽葉大而綠，生命力旺盛。

活性短肽的氨基酸序列為scasvckshrarrcgsvfrcycrclrc。上述活性短肽可明顯提高分化后細(xì)胞的增殖速度，得到的叢生芽的量多，葉大而綠，生命力旺盛。

芽誘導(dǎo)和芽增殖步驟包括將叢生芽轉(zhuǎn)入添加0.04~0.06mg/lbap、27~34g/l蔗糖、0.07~0.14g/l肌醇和6~9g/l瓊脂的ms培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，得到無(wú)根苗叢，將苗叢的無(wú)根苗從基部切割，并切成0.4~0.7cm長(zhǎng)的小段，再將小段和切割后剩下的苗叢分別轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成叢生芽，重復(fù)上述步驟得到大量的叢生芽和無(wú)根苗。

生根壯苗培養(yǎng)步驟為先將無(wú)根苗轉(zhuǎn)移到添加0.8~1.5mg/liba和0.4~0.6mg/lnaa的1/2ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)1~3d，再轉(zhuǎn)入無(wú)生長(zhǎng)素的1/2ms培養(yǎng)基中間接誘根產(chǎn)生。無(wú)根苗在生長(zhǎng)素作用下形成較多的根原基，在無(wú)生長(zhǎng)素的抑制作用下讓根伸長(zhǎng)并正常生長(zhǎng)，從而解決了根原基的發(fā)生和根伸長(zhǎng)之間的矛盾，并減少了愈傷組織的形成。采用上述方法誘導(dǎo)白木香外植體生根，不僅生根率較高，而且生根苗基部無(wú)愈傷組織，根系生長(zhǎng)良好。

煉苗移栽步驟包括待生根的試管苗長(zhǎng)至3~5cm高時(shí)，將試管苗置窗前散射光處3~5d再打開封口膜煉苗2~3d，接著從瓶中取出試管苗，用清水洗凈粘附根系的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入到珍珠巖的基質(zhì)中，淋足定根水，套上帶小孔的塑料袋保濕防風(fēng)，20~30d后移去塑料套，之后每隔1~2d噴水一次。試管苗葉片表面的角質(zhì)層已形成，可有效抵抗低強(qiáng)度的光線照射及減少水分散失，但抗應(yīng)激性弱，上述方法可提高白木香苗莖稈強(qiáng)度，增強(qiáng)抗猝能力。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1.本發(fā)明方法培育白木香苗的時(shí)間短，得到的白木香苗病毒少、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，得到的白木香枝條較粗，抗風(fēng)性較強(qiáng)，生命力相比現(xiàn)有技術(shù)組織培養(yǎng)培育的白木香更為旺盛，成活率更高。

2.在芽分化培養(yǎng)基中加入氨基酸序列為scasvckshrarrcgsvfrcycrclrc的活性短肽。上述活性短肽可明顯提高分化后細(xì)胞的增殖速度，叢生芽的量多，得到的叢生芽葉大而綠，生命力旺盛。

3.無(wú)根苗在生長(zhǎng)素作用下形成較多的根原基，在無(wú)生長(zhǎng)素的抑制作用下讓根伸長(zhǎng)并正常生長(zhǎng)，從而解決了根原基的發(fā)生和根伸長(zhǎng)之間的矛盾，并減少了愈傷組織的形成。采用分階段間接誘導(dǎo)白木香外植體生根的方法，不僅生根率較高，而且生根苗基部無(wú)愈傷組織，根系生長(zhǎng)良好。

具體實(shí)施例

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：

用于大規(guī)模種植的白木香組織培養(yǎng)方法，包括無(wú)菌苗培養(yǎng)、芽誘導(dǎo)及芽增殖、生根壯苗培養(yǎng)和煉苗移栽。無(wú)菌苗培養(yǎng)步驟包括將白木香種子胚先用無(wú)菌水清洗，再用75%酒精漂洗，無(wú)菌水清洗后再放入12%次氯酸鈉中浸泡，再用無(wú)菌水清洗，并放入種子萌發(fā)培養(yǎng)基中。種子萌發(fā)培養(yǎng)基為添加了1.2mg/l的ga3的ms培養(yǎng)基。種子消毒較容易，污染率低，直接取白木香腋芽作為外植體消毒較困難，污染率高。

芽誘導(dǎo)和芽增殖步驟包括去除將幼苗子葉去掉，留下頂芽轉(zhuǎn)接到添加1.2mg/l6-ba、1.2mg/lnaa、0.5mg/lkt和活性短肽的ms培養(yǎng)基，即芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成叢生芽。選取無(wú)菌苗的頂芽為外植體縮短了叢生芽的誘導(dǎo)時(shí)間；子葉和不帶芽的莖段只能誘導(dǎo)出大量的愈傷組織，所以外植體選為無(wú)菌苗頂芽。上述方法培育的叢生芽的量多，得到的叢生芽葉大而綠，生命力旺盛。

活性短肽的氨基酸序列為scasvckshrarrcgsvfrcycrclrc。上述活性短肽可明顯提高分化后細(xì)胞的增殖速度，得到的叢生芽的量多，葉大而綠，生命力旺盛。

芽誘導(dǎo)和芽增殖步驟包括將叢生芽轉(zhuǎn)入添加0.05mg/lbap、31g/l蔗糖、1.2g/l肌醇和8g/l瓊脂的ms培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，得到無(wú)根苗叢，將苗叢的無(wú)根苗從基部切割，并切成0.5cm長(zhǎng)的小段，再將小段和切割后剩下的苗叢分別轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成叢生芽，重復(fù)上述步驟得到大量的叢生芽和無(wú)根苗。

生根壯苗培養(yǎng)步驟為先將無(wú)根苗轉(zhuǎn)移到添加1.2mg/liba和0.5mg/lnaa的1/2ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，再轉(zhuǎn)入無(wú)生長(zhǎng)素的1/2ms培養(yǎng)基中間接誘根產(chǎn)生。無(wú)根苗在生長(zhǎng)素作用下形成較多的根原基，在無(wú)生長(zhǎng)素的抑制作用下讓根伸長(zhǎng)并正常生長(zhǎng)，從而解決了根原基的發(fā)生和根伸長(zhǎng)之間的矛盾，并減少了愈傷組織的形成。采用上述方法誘導(dǎo)白木香外植體生根，不僅生根率較高，而且生根苗基部無(wú)愈傷組織，根系生長(zhǎng)良好。

煉苗移栽步驟包括待生根的試管苗長(zhǎng)至3~5cm高時(shí)，將試管苗置窗前散射光處4d，再打開封口膜煉苗2d，接著從瓶中取出試管苗，用清水洗凈粘附根系的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入到珍珠巖的基質(zhì)中，淋足定根水，套上帶小孔的塑料袋保濕防風(fēng)，2,5d后移去塑料套，之后每隔1~2d噴水一次。試管苗葉片表面的角質(zhì)層已形成，可有效抵抗低強(qiáng)度的光線照射及減少水分散失，但抗應(yīng)激性弱，上述方法可提高白木香苗莖稈強(qiáng)度，增強(qiáng)抗猝能力。

實(shí)施例2：

用于大規(guī)模種植的白木香組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1）無(wú)菌苗培養(yǎng)：將白木香種子胚先用無(wú)菌水清洗，再用75%酒精漂洗，無(wú)菌水清洗后再放入15%次氯酸鈉中浸泡，再用無(wú)菌水清洗，并放入種子萌發(fā)培養(yǎng)基中。種子萌發(fā)培養(yǎng)基為添加了1mg/l的ga3的ms培養(yǎng)基；

2）芽誘導(dǎo)和芽增殖：去除將幼苗子葉去掉，留下頂芽轉(zhuǎn)接到添加1.0mg/l6-ba、1.0mg/lnaa、0.5mg/lkt和活性短肽的ms培養(yǎng)基，即芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成叢生芽?；钚远屉牡陌被嵝蛄袨閟casvckshrarrcgsvfrcycrclrc。將叢生芽轉(zhuǎn)入添加0.05mg/lbap、30g/l蔗糖、1.0g/l肌醇和8g/l瓊脂的ms培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，得到無(wú)根苗叢，將苗叢的無(wú)根苗從基部切割，并切成0.6cm長(zhǎng)的小段，再將小段和切割后剩下的苗叢分別轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成叢生芽，重復(fù)上述步驟得到大量的叢生芽和無(wú)根苗；

3）生根壯苗培養(yǎng)：先將無(wú)根苗轉(zhuǎn)移到添加1.0mg/liba和0.5mg/lnaa的1/2ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，再轉(zhuǎn)入無(wú)生長(zhǎng)素的1/2ms培養(yǎng)基中間接誘根產(chǎn)生；

4）煉苗移栽：待生根的試管苗長(zhǎng)至3~5cm高時(shí)，將試管苗置窗前散射光處4d，再打開封口膜煉苗2d，接著從瓶中取出試管苗，用清水洗凈粘附根系的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入到珍珠巖的基質(zhì)中，淋足定根水，套上帶小孔的塑料袋保濕防風(fēng)，2,5d后移去塑料套，之后每隔1~2d噴水一次。

實(shí)施例3：

用于大規(guī)模種植的白木香組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1）無(wú)菌苗培養(yǎng)：將白木香種子胚先用無(wú)菌水清洗，再用80%酒精漂洗，無(wú)菌水清洗后再放入13%次氯酸鈉中浸泡，再用無(wú)菌水清洗，并放入種子萌發(fā)培養(yǎng)基中。種子萌發(fā)培養(yǎng)基為添加了1.1mg/l的ga3的ms培養(yǎng)基；

2）芽誘導(dǎo)和芽增殖：去除將幼苗子葉去掉，留下頂芽轉(zhuǎn)接到添加1.1mg/l6-ba、1.1mg/lnaa、0.6mg/lkt和活性短肽的ms培養(yǎng)基，即芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成叢生芽。活性短肽的氨基酸序列為scasvckshrarrcgsvfrcycrclrc。將叢生芽轉(zhuǎn)入添加0.06mg/lbap、32g/l蔗糖、1.1g/l肌醇和7g/l瓊脂的ms培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，得到無(wú)根苗叢，將苗叢的無(wú)根苗從基部切割，并切成0.6cm長(zhǎng)的小段，再將小段和切割后剩下的苗叢分別轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成叢生芽，重復(fù)上述步驟得到大量的叢生芽和無(wú)根苗；

3）生根壯苗培養(yǎng)：先將無(wú)根苗轉(zhuǎn)移到添加1.1mg/liba和0.5mg/lnaa的1/2ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，再轉(zhuǎn)入無(wú)生長(zhǎng)素的1/2ms培養(yǎng)基中間接誘根產(chǎn)生；

4）煉苗移栽：待生根的試管苗長(zhǎng)至3~5cm高時(shí)，將試管苗置窗前散射光處4d，再打開封口膜煉苗2d，接著從瓶中取出試管苗，用清水洗凈粘附根系的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入到珍珠巖的基質(zhì)中，淋足定根水，套上帶小孔的塑料袋保濕防風(fēng)，2,5d后移去塑料套，之后每隔1~2d噴水一次。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<110>浦江縣美澤生物科技有限公司

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