本發(fā)明涉及植物抗性提高技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高柑橘抗旱性的方法。

背景技術(shù)：

球囊霉素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種叢枝菌根真菌分泌到土壤中的一類糖白質(zhì)。球囊霉素在土壤中的存在非常豐富，具體可分為總球囊霉素、易提取球囊霉素、免疫反應(yīng)性總球囊霉素、免疫反應(yīng)性易提取球囊霉素。由于球囊霉素組成和性質(zhì)的特異性，使其在土壤結(jié)構(gòu)和土壤有機(jī)質(zhì)組成中具有十分重要的意義。

干旱是由于長期降雨量不足導(dǎo)致的土壤水分缺失，是世界上最嚴(yán)重的自然災(zāi)害類型之一。在世界范圍內(nèi),干旱缺水對(duì)農(nóng)業(yè)和社會(huì)造成的損失相當(dāng)于其他自然災(zāi)害之和。柑橘是世界最重要的果樹之一，被列為世界四大水果之首，中國是柑橘的原產(chǎn)地和主產(chǎn)地，自古以來就種植柑橘，有著悠久的栽培歷史。我國的柑橘多在丘陵山地地區(qū)栽培，生長環(huán)境惡劣，且抵抗干旱條件差，遭受干旱的影響更大，水分是獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的主要限制因子之一。因此，如何提高柑橘抗旱性和獲得高質(zhì)高產(chǎn)成為一個(gè)緊要的課題。有關(guān)外源球囊霉素在叢枝菌根真菌提高柑橘抗旱性過程中的作用尚未見到報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種提高柑橘抗旱性的方法，具體的，本發(fā)明還提供了一種能提高柑橘抗旱性的球囊霉素蛋白抗旱劑。

本發(fā)明第一方面提供了一種提高柑橘抗旱性的方法，步驟包括：將抗旱劑施加于柑橘植株的根圍，所述抗旱劑的有效成分包括球囊霉素。

本發(fā)明第二方面提供了一種提高柑橘抗旱性的抗旱劑，其有效成分包括球囊霉素。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的一種提高柑橘抗旱性的方法簡單易操作，使用后效果顯著，合理、高效的發(fā)揮干旱條件下球囊霉素蛋白對(duì)柑橘的抗旱作用；在提高了柑橘的耐旱性的同時(shí)，還改善了土壤結(jié)構(gòu)，不僅具有經(jīng)濟(jì)效益，還有生態(tài)效益，具體的效果包括：(1)有效促進(jìn)柑橘植株?duì)I養(yǎng)生長、提高生物量；(2)促進(jìn)根系構(gòu)型的發(fā)展，增加主根長度和各級(jí)側(cè)根數(shù)量；(3)提高葉片的光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度以及胞間co2濃度，降低葉片的溫度；(4)提高葉片相對(duì)含水量，降低葉片水勢；(5)提高根際土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體含量和團(tuán)聚體穩(wěn)定性；(6)提高植物葉片和根系的抗氧化物酶活性；提高葉片和根系脫落酸和茉莉酸甲酯含量。并且，本發(fā)明提供的一種提高柑橘抗旱性的球囊霉素蛋白抗旱劑制備工藝簡單，原材料易得，生產(chǎn)成本低，還具有無污染、高效環(huán)保、低能耗等優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明第一方面提供了一種提高柑橘抗旱性的方法，步驟包括：將抗旱劑施加于柑橘植株的根圍，所述抗旱劑的有效成分包括球囊霉素。

在本發(fā)明的研究過程中發(fā)現(xiàn)，球囊霉素可以提高植物的抗旱性。球囊霉素是叢枝菌根真菌在土壤中產(chǎn)生的一種球囊霉素蛋白，是土壤有機(jī)質(zhì)的重要組分，內(nèi)含豐富的營養(yǎng)，含有大量的n、c、h、o、p和fe元素，還屬于一種熱激蛋白，該蛋白的部分序列與一種熱激蛋白hsp60的序列高度同源，同源性大于80％。熱激蛋白是一類在有機(jī)體受到高溫等逆境刺激后大量表達(dá)的蛋白質(zhì)，是植物對(duì)逆境脅迫短期適應(yīng)的必需組成成分，對(duì)減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。因此在干旱條件下，叢枝菌根真菌大量地分泌球囊霉素，減輕干旱脅迫對(duì)柑橘的不利影響，提高了柑橘的抗旱性。本發(fā)明對(duì)柑橘植株根圍施加外源球囊霉素，顯著提高了水穩(wěn)性團(tuán)聚體的含量和土壤團(tuán)聚體的穩(wěn)定性。

優(yōu)選的，所述球囊霉素為易提取球囊霉素。

更加優(yōu)選的，所述抗旱劑的制備步驟包括：

s1、采集橘園土壤表面0-20cm的黃壤，混勻風(fēng)干，過孔徑4mm的網(wǎng)篩去除土壤中雜質(zhì)；

s2、取步驟s1所得土壤1.0～5.0g，加入4～40ml20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液，振蕩30～60s，后于100-105kpa，120-125℃條件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，收集上清液得到易提取球囊霉素溶液，所得易提取球囊霉素溶液即抗旱劑。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述抗旱劑采用等體積的20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液稀釋后再施用。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液配制步驟包括：

a、配制a液：取0.42～4.2gc6h8o7·h2o溶于100～1000ml蒸餾水中配制得0.02mol/l檸檬酸溶液；

b、配制b液：取0.5365～5.365gna2hpo4·7h2o或0.716～7.16gna2hpo4·12h2o在蒸餾水中溶至100～1000ml配制得0.02mol/l磷酸氫二鈉溶液；

c、把a(bǔ)液和b液以13:87的比例充分混勻得20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述抗旱劑的施用量為：對(duì)于種植于盆中的柑橘植株，每盆的施用量為50～100ml；對(duì)于種植于田間的柑橘植株，每棵植株根圍施用450～550ml。在本發(fā)明的實(shí)施例中，分別對(duì)種植于盆中的柑橘植株以及種植于田間的柑橘植株施加所述抗旱劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)兩種狀態(tài)下柑橘植株均具有良好的效果。

本發(fā)明第二方面提供了一種提高柑橘抗旱性的抗旱劑，其有效成分包括球囊霉素。

優(yōu)選的，所述抗旱劑的制備步驟包括：

s1、采集橘園土壤表面0-20cm的黃壤，混勻風(fēng)干，過孔徑4mm的網(wǎng)篩去除土壤中雜質(zhì)；

s2、取步驟s1所得土壤1.0～5.0g，加入4～40ml20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液，振蕩30～60s，后于100-105kpa，120-125℃條件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，收集上清液得到易提取球囊霉素溶液，所得易提取球囊霉素溶液即抗旱劑。

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種提高柑橘抗旱性的方法予以進(jìn)一步說明。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無特殊說明，均為市場購買得到。

實(shí)施例一

1、球囊霉素蛋白抗旱劑的準(zhǔn)備

從橘園采集土層深度在0-20cm的黃壤，本實(shí)施例采用2016年3月于荊州市長江大學(xué)26年生柑橘園采集的0-20cm土壤(黃壤)，混合均勻，風(fēng)干，過孔徑4mm的篩子，去除土壤中的根系、垃圾以及石塊。然后再根據(jù)下面的方法反復(fù)提取足量的易提取球囊霉素溶液：

稱取已經(jīng)過處理土壤5.0g放入離心管中，加入40ml20mmol/l(ph＝7.0)的檸檬酸鈉浸提液，然后在振蕩器上振蕩60s，高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，10000g/s下離心10min，收集上清液，得到易提取球囊霉素溶液，提取完成后測定土壤中易提取球囊霉素的濃度為0.014mg/ml。最后用完全的易提取球囊霉素溶液加上相同體積的20mmol/l、ph7.0的檸檬酸緩沖液稀釋成1/2強(qiáng)度的易提取球囊霉素溶液備用，即為提高柑橘抗旱性的抗旱劑。

將上述抗旱劑用于提高柑橘抗旱性，將抗旱劑施加于柑橘植株的根圍，對(duì)于種植于盆中的柑橘植株，每盆的施用量為50～100ml；對(duì)于種植于田間的柑橘植株，每棵植株根圍施用450～550ml。具體的，將上述抗旱劑用于提高柑橘抗旱性，并通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)抗旱劑效果，所述實(shí)驗(yàn)過程如下所述。

2、實(shí)驗(yàn)處理

本試驗(yàn)采用2×2雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素一為水分處理，正常水分為田間最大持水量的75％，干旱處理為田間最大持水量的55％；因素二為1/2強(qiáng)度易提取球囊霉素溶液處理，即實(shí)施組(施加1/2強(qiáng)度易提取球囊霉素溶液)和對(duì)照組(施加檸檬酸鈉緩沖液)。共四個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)4次，共16盆，隨機(jī)排列，試驗(yàn)盆隨機(jī)擺放在長江大學(xué)園藝園林學(xué)院盆景園玻璃溫室內(nèi)。

2016年2月24日將枳種子從枳果實(shí)中剝離出來，并對(duì)種子進(jìn)行消毒，在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽。2016年3月30日，將長有4片真葉的枳實(shí)生苗移栽至裝有1.6kg栽培基質(zhì)的塑料盆中，每盆栽植2棵枳實(shí)生苗。栽培基質(zhì)使用的是純土(柑橘園表層土)，經(jīng)風(fēng)干、高壓蒸汽滅菌(121℃，2h)、過4mm篩，備用。試驗(yàn)盆規(guī)格為：上口徑15cm，下口徑11cm，高13.3cm。

移栽半個(gè)月，從4月16日開始每周澆灌50ml1/2易提取球囊霉素溶液和檸檬酸鈉緩沖液。6月16日進(jìn)行干旱脅迫處理，每天通過稱重法計(jì)算土壤水分的散失量，并通過澆灌1/2易提取球囊霉素溶液補(bǔ)充散失的水分(每盆施加的1/2易提取球囊霉素溶液和檸檬酸鈉緩沖液的體積每周限定50ml/盆)，如水分散失超過50ml，則余下天數(shù)用水補(bǔ)充。2016年7月27日結(jié)束試驗(yàn)。

3、結(jié)果

表1示出了實(shí)施組和對(duì)照組不同處理?xiàng)l件下對(duì)枳實(shí)生苗株高、莖粗、葉片數(shù)、地上部分和地下部分鮮重的影響，結(jié)果表明，雖然干旱脅迫顯著降低了枳實(shí)生苗株高、莖粗、葉片數(shù)、地上部分和地下部分鮮重；但是易提取球囊霉素不論正常水分還是干旱脅迫條件下，均能顯著提高枳實(shí)生苗的株高、莖粗、葉片數(shù)、地上部分和地下部分鮮重。在正常水分條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳實(shí)生苗株高、莖粗、葉片數(shù)、地上部分和地下部分鮮重，分別為38％、5％、25％、57％和5％；干旱脅迫條件下，實(shí)施組較對(duì)照組分別顯著提高了枳實(shí)生苗株高、莖粗、葉片數(shù)、地上部分和地下部分鮮重的49％、11％、33％、46％和51％。

表1不同處理?xiàng)l件下枳實(shí)生苗株高、莖粗、葉片數(shù)、地上部分和地下部分鮮重

注：同一列數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝4)的不同小寫字母(a，b，c和d)表示處理間存在顯著差異(p<0.05)。下同。

由表2結(jié)果可得，干旱脅迫抑制了枳實(shí)生苗根系構(gòu)型的發(fā)展，但是易提取球囊霉素在兩種水分條件下都顯著促進(jìn)了枳實(shí)生苗根系構(gòu)型的發(fā)展。在正常水分條件下，與對(duì)照組相比，實(shí)施組枳實(shí)生苗有較高的根系總長度、投影面積和體積，且分別高出9％,7％,10％和19％；干旱脅迫條件下，與對(duì)照組相比，實(shí)施組顯著增加了枳實(shí)生苗根系的總長度、投影面積、表面積和體積，分別顯著增加了15％、13％、20％和50％。

表2不同處理?xiàng)l件下枳實(shí)生苗根系的總長度、投影面積、表面積、根系平均直徑和根系體積

由表3結(jié)果可得，干旱脅迫顯著降低了主根長度和各級(jí)側(cè)根數(shù)量，但是易提取球囊霉素在兩種水分條件下都顯著增加了主根長度和各級(jí)側(cè)根數(shù)量。在正常水分條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著增加了主根長度和一級(jí)側(cè)根、二級(jí)側(cè)根和三級(jí)側(cè)根的數(shù)量，分別為15％、36％、7％和67％；在干旱條件下，實(shí)施組較對(duì)照組分別顯著增加了主根長度和一級(jí)側(cè)根、二級(jí)側(cè)根和三級(jí)側(cè)根數(shù)量為8％、22％、87和300％，

表3不同處理?xiàng)l件下主根長度和一級(jí)側(cè)根、二級(jí)側(cè)根和三級(jí)側(cè)根的數(shù)量

由表4結(jié)果可得，干旱脅迫抑制了枳實(shí)生苗葉片的光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度以及胞間co2濃度，增加了葉片溫度，但是易提取球囊霉素在兩種水分條件下都顯著提高了枳實(shí)生苗葉片的光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度以及胞間co2濃度。正常水分條件下，實(shí)施組顯著提高了枳實(shí)生苗葉片的光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度，比對(duì)照組分別顯著提高了42％、522％、487％和237％；干旱條件下，實(shí)施組也顯著提高了干旱脅迫下枳實(shí)生苗葉片的光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度，分別顯著提高了38％、400％、331％和152％，葉片溫度顯著降低了0.72℃。

表4不同處理?xiàng)l件下葉片溫度、光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間co2濃度

由表5結(jié)果可得，干旱脅迫顯著降低了枳實(shí)生苗葉片相對(duì)含水量和增加了葉片水勢，但是易提取球囊霉素在兩種水分條件下都顯著提高了枳實(shí)生苗葉片相對(duì)含水量和降低了葉片水勢。在正常水分條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳實(shí)生苗葉片相對(duì)含水量和降低了葉片水勢，提高了19％，降低了24％；干旱條件下，實(shí)施組也顯著提高了枳實(shí)生苗葉片的相對(duì)含水量和降低了葉片水勢，提高了20％和降低了11％。

表5不同處理?xiàng)l件下枳實(shí)生苗葉片相對(duì)含水量、葉片水勢

由表6結(jié)果可得，不論正常水分還是干旱脅迫條件下，易提取球囊霉素都顯著提高枳根際的水穩(wěn)性團(tuán)聚體含量和團(tuán)聚體穩(wěn)定性。在正常水分條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳根際wsa1.00～2.00mm和wsa0.25～0.50mm，分別提高了79％和7％，平均質(zhì)量直徑顯著提高了44％；干旱條件下，實(shí)施組也顯著提高了wsa1.00～2.00mm和wsa0.25～0.50mm，分別顯著提高了36％和54％，平均質(zhì)量直徑顯著提高了34％。

表6不同處理?xiàng)l件下枳根際水穩(wěn)性團(tuán)聚體百分?jǐn)?shù)、平均質(zhì)量直徑

由表7-1結(jié)果可得，在正常水分條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳實(shí)生苗葉片的鐵-超氧化物岐化酶，提高了208％；干旱條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳實(shí)生苗葉片錳-超氧化物岐化酶和鐵-超氧化物岐化酶活性，分別提高了9％和30％。

由表7-2結(jié)果可得，在正常水分條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳實(shí)生苗根系錳-超氧化物岐化酶和銅鋅-超氧化物岐化酶活性，分別提高了24％和41％；干旱條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳實(shí)生苗葉片錳-超氧化物岐化酶、鐵-超氧化物岐化酶和銅鋅-超氧化物岐化酶活性，分別提高了122％、13％和47％。

綜合表7-1和7-1結(jié)果可得，不論正常水分還是干旱脅迫條件下，易提取球囊霉素都顯著提高了枳實(shí)生苗葉片和根系的超氧化物岐化酶活性。

表7-1不同處理?xiàng)l件下枳實(shí)生苗葉片的超氧化物岐化酶活性

表7-2不同處理?xiàng)l件下枳實(shí)生苗根系的超氧化物岐化酶活性

由表8-1結(jié)果可得，在正常水分條件下，實(shí)施組和對(duì)照組在葉片內(nèi)源激素含量上沒有顯著差異；干旱條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳實(shí)生苗葉片脫落酸、生長素和茉莉酸甲酯的含量，分別提高了8％、9％和26％。

由表8-2結(jié)果可得，在正常水分條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳實(shí)生苗根系赤霉素、油菜素內(nèi)酯、玉米素核苷和茉莉酸甲酯的含量，分別提高了23％、18％、12％和21％；干旱條件下，實(shí)施組較對(duì)照組顯著提高了枳實(shí)生苗根系赤霉素和油菜素內(nèi)酯的含量，分別提高了20％和10％。

綜合表7-1和7-1結(jié)果可得，不論正常水分還是干旱脅迫條件下，易提取球囊霉素都顯著提高了枳實(shí)生苗葉片和根系的內(nèi)源激素含量。

表8-1不同處理?xiàng)l件下枳實(shí)生苗葉片內(nèi)源激素含量

表8-2不同處理?xiàng)l件下枳實(shí)生苗根系內(nèi)源激素含量

綜上所述，本發(fā)明一種提高柑橘抗旱性方法的具體作用有：促進(jìn)植株?duì)I養(yǎng)生長、提高植株生物量；促進(jìn)根系構(gòu)型的發(fā)展，增加主根長度和各級(jí)側(cè)根數(shù)量；提高葉片的光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度以及胞間co2濃度，降低葉片的溫度；提高葉片相對(duì)含水量，降低葉片水勢；提高根際土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體含量和團(tuán)聚體穩(wěn)定性；提高植物葉片和根系的抗氧化物酶活性；提高葉片和根系的脫落酸、茉莉酸甲酯和生長素含量

實(shí)施例二

本實(shí)施例提供了一種提高柑橘抗旱性的抗旱劑，其制備步驟包括：

s1、在橘園采集0～20cm黃壤，混合均勻，風(fēng)干，過孔4mm的篩子，去除土壤中的根系、垃圾以及石塊等雜質(zhì)；

s2、配制20mmol/l(ph＝7.0)檸檬酸鈉浸提液：(1)a液：0.02mol/l檸檬酸溶液(取4.2gc6h8o7·h2o溶于1000ml蒸餾水)；(2)b液：0.02mol/l磷酸氫二鈉溶液(取5.365gna2hpo4·7h2o或7.16gna2hpo4·12h2o溶至1000ml)；(3)分別量取a液和b液130ml、870ml，充分混勻得到1000ml20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液。

取步驟s1所得土壤4.0g放入離心管50ml中，加入32ml20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液，振蕩60s，后于103kpa，121℃條件下提取30min，再在12000g/s下離心8min，收集上清液得到易提取球囊霉素溶液，最后用完全的易提取球囊霉素溶液加上相同體積的20mmol/l、ph7.0的檸檬酸緩沖液稀釋成1/2強(qiáng)度的易提取球囊霉素溶液備用，即為可直接使用的提高柑橘抗旱性的抗旱劑。

將上述抗旱劑用于提高柑橘抗旱性，對(duì)種植于田間的柑橘植株進(jìn)行施加，每棵植株根圍施用500ml，抗旱效果與實(shí)施例一基本一致。

實(shí)施例三

本實(shí)施例提供了一種提高柑橘抗旱性的抗旱劑，其制備步驟包括：

s1、在橘園采集0～20cm黃壤，混合均勻，風(fēng)干，過孔4mm的篩子，去除土壤中的根系、垃圾以及石塊等雜質(zhì)；

s2、配制20mmol/l(ph＝7.0)檸檬酸鈉浸提液：(1)a液：0.02mol/l檸檬酸溶液(取4.2gc6h8o7·h2o溶于1000ml蒸餾水)；(2)b液：0.02mol/l磷酸氫二鈉溶液(取5.365gna2hpo4·7h2o或7.16gna2hpo4·12h2o溶至1000ml)；(3)分別量取a液和b液130ml、870ml，充分混勻得到1000ml20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液。

取步驟s1所得土壤5.0g放入離心管50ml中，加入32ml20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液，振蕩60s，后于103kpa，121℃條件下提取30min，再在12000g/s下離心8min，收集上清液得到易提取球囊霉素溶液，最后用完全的易提取球囊霉素溶液加上相同體積的20mmol/l、ph7.0的檸檬酸緩沖液稀釋成1/2強(qiáng)度的易提取球囊霉素溶液備用，即為可直接使用的提高柑橘抗旱性的抗旱劑。

將上述抗旱劑用于提高柑橘抗旱性，對(duì)種植于田間的柑橘植株進(jìn)行施加，每棵植株根圍施用550ml，抗旱效果與實(shí)施例一基本一致。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。