本發(fā)明涉及白及組織培養(yǎng)方法，尤其涉及白及微塊莖的組培快繁方法。
背景技術(shù)：
：白及bletillastriat為蘭科白及屬(bletillarchb.f.)植物，為多年生宿根草本，地下部假鱗莖塊根狀，又稱良姜、紫蘭、甘根、連及草，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，1977年以后各版《中國(guó)藥典》均有收載。其味苦、甘、澀；性微寒，歸肺、肝、胃經(jīng)，具有收斂止血,消腫生肌的功能。主要用于治療咳血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、肺結(jié)核咳血、潰瘍病出血等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)塊根含有近5o種化合物，在醫(yī)藥、化工、食品等方面的應(yīng)用前景十分廣闊，綜合利用潛力很大。近年來(lái)野生資源遭到了無(wú)限制采挖，加上生態(tài)環(huán)境的破壞，野生資源量急劇減少，價(jià)格也逐年攀升，已被我國(guó)列為珍稀瀕危保護(hù)植物，同時(shí)也被列入《瀕危動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(cites)的附錄ⅱ中，受到國(guó)際保護(hù)。因此需要引導(dǎo)和開(kāi)展人工栽培滿足市場(chǎng)需求及保護(hù)野生白及資源。長(zhǎng)期以來(lái)，白及種植常常以分割塊莖的方式進(jìn)行繁殖種苗，不僅繁殖系數(shù)低、周期長(zhǎng)、耗種量大，且易導(dǎo)致病毒累積，種苗成本居高不下。白及種子非常細(xì)小且無(wú)胚乳，自然條件下萌發(fā)率極低，而種子非共生培養(yǎng)則能獲得萌發(fā)，已有白及種子無(wú)菌播種繁育種苗的研究報(bào)道和公開(kāi)的專利，有的采用“種子萌發(fā)原球莖→原球莖增殖→分化芽→生根培養(yǎng)”的組織培養(yǎng)途徑，有的采用“種子萌發(fā)原球莖→分化芽→誘導(dǎo)芽增殖叢生芽→生根培養(yǎng)”的途徑，也有“種子萌發(fā)原球莖→分化芽→生根培養(yǎng)”的培養(yǎng)途徑。以上組培育苗途徑和培養(yǎng)方法極易分化出叢生苗，苗體纖細(xì)瘦弱，生長(zhǎng)緩慢，很難形成微塊莖，種苗生產(chǎn)存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、種苗易老化、質(zhì)量參差不齊、移栽成活率較低、或者增殖率低、種植后塊莖產(chǎn)量低等諸多問(wèn)題，尚未能實(shí)現(xiàn)種苗工業(yè)化生產(chǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供白及微塊莖的組培快繁方法，該方法在種胚萌發(fā)培養(yǎng)和芽分化培養(yǎng)階段誘導(dǎo)種子高效萌發(fā)并快速分化出葉，在生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)階段促使微塊莖形成與根分化同步進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了使種子萌發(fā)率提高、快速繁育形成微塊莖，縮短白及組培育苗周期，提高田間種植塊莖藥材的產(chǎn)量，克服試管苗易老化、移栽成活率低、塊莖藥材產(chǎn)量低等目的。該項(xiàng)技術(shù)操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)周期短，節(jié)省成本，成苗率高，實(shí)用性強(qiáng)，為白及種業(yè)的產(chǎn)業(yè)化提供新方法。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：白及微塊莖的組培快繁方法，包括以下步驟：(1)白及果實(shí)的選擇：選擇外表顏色為黃綠色、黃色或褐色且飽滿、未開(kāi)裂的蒴果用于組織培養(yǎng)；(2)無(wú)菌播種：將步驟(1)中選取的果實(shí)用質(zhì)量百分比濃度為70-85％的酒精浸泡45秒以上，然后置于質(zhì)量百分比濃度為0.12-0.25％的升汞溶液中消毒8-15分鐘，之后用無(wú)菌水沖洗3-5次后，切開(kāi)果皮，將黃白色或黃色或褐色的粉狀種子均勻撒播在種胚萌發(fā)培養(yǎng)基表面；(3)種胚萌發(fā)培養(yǎng)：將上述撒播了種子后的種胚萌發(fā)培養(yǎng)基置于溫度為15-25℃且無(wú)光照條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)種胚萌發(fā)；(4)芽分化培養(yǎng)：在上述步驟(3)種胚萌發(fā)培養(yǎng)7-20天的時(shí)候，觀察種胚，當(dāng)種胚陸續(xù)膨大、萌發(fā)形成白色或乳黃色的尚未突破種皮的近球狀體時(shí)，轉(zhuǎn)入以下條件進(jìn)行光照培養(yǎng)：光照強(qiáng)度為2000-2500lx，光照時(shí)間8-10小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度15-25℃；光照培養(yǎng)10-20天，當(dāng)種胚由白色轉(zhuǎn)為綠色，近球狀體頂端分生組織陸續(xù)分化出子葉、子葉分化發(fā)育形成具2-3片葉的芽體，且95％以上的球狀體發(fā)育形成芽體時(shí)轉(zhuǎn)入下一階段培養(yǎng)；所述芽分化培養(yǎng)中，注意在種胚膨大發(fā)育尚未突破種皮時(shí)及時(shí)進(jìn)行光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)葉原基分化，以避免形成根原基。在原球莖形成初期由黑暗轉(zhuǎn)移到光照條件下分化出子葉，利于誘導(dǎo)健壯芽體及微塊莖，培養(yǎng)過(guò)程減少了現(xiàn)有技術(shù)的原球莖培養(yǎng)階段。(5)生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述步驟(4)芽分化培養(yǎng)發(fā)育出的芽體接種至生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行第一階段的生根光照培養(yǎng)；光照培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1300-1700lux，每天光照10-13小時(shí)，溫度18-28℃，培養(yǎng)時(shí)間40-65天；當(dāng)觀察芽體基部膨大，并且有的在膨大處萌生出3-5條白色根系，有的膨大呈1mm左右球狀并在其周邊長(zhǎng)出1-3條細(xì)根時(shí)，接著進(jìn)行第二階段的誘導(dǎo)微塊莖光照培養(yǎng)；光照培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度為1000-1500lux，每天光照6-8小時(shí)，溫度為17-23℃，培養(yǎng)20-30天；直至誘導(dǎo)培養(yǎng)根芽交界處膨大形成2mm以上近球形的微塊莖，且上部葉片展開(kāi)、葉長(zhǎng)3cm及以上。進(jìn)一步地，所述白及微塊莖的組培快繁方法還包括步驟(6)繼代培養(yǎng)：將上述步驟(5)生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的微塊莖的種苗切去葉片和根系，然后分割微塊莖重復(fù)步驟(5)的生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)，在微塊莖的葉痕處分化出數(shù)個(gè)粗壯的不定芽后，繼續(xù)培養(yǎng)不定芽基部形成小塊莖。繼代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了微塊莖和植株的增殖,平均增殖倍數(shù)3.63。所述的繼代培養(yǎng)條件與生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)條件相同。由此繼代長(zhǎng)出的芽非常粗壯，是種子苗不可相比的，切割再次轉(zhuǎn)移繼代培養(yǎng)，生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)突出，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，移栽成活率高，且藥材的產(chǎn)量也比種子苗的塊莖產(chǎn)量高。本發(fā)明進(jìn)一步提供種胚萌發(fā)培養(yǎng)基，它同時(shí)綜合n6和b5培養(yǎng)基的特點(diǎn)，合理調(diào)整培養(yǎng)基中的s元素和n元素的用量，并在此基礎(chǔ)上添加了椰汁和玉米粉等有機(jī)物，椰汁和玉米粉兩種有機(jī)物的協(xié)同增效作用促使白及種胚快速吸水膨大、萌發(fā)。步驟(2)所述種胚萌發(fā)培養(yǎng)基按照濃度計(jì)包括以下組分：硝酸銨1100mg/l、硝酸鉀1950mg/l、硫酸銨200mg/l、氯化鈣230-300mg/l、硝酸鈣80mg/l、硫酸鎂250-360mg/l、磷酸二氫鉀180-190mg/l、碘化鉀0.85mg/l、硼酸4.0mg/l、硫酸錳20.3mg/l、硫酸鋅6.2mg/l、鉬酸鈉0.31mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l、硫酸鐵27.8mg/l、鹽酸硫胺素1.2-2.5mg/l、鹽酸吡哆醇1.4mg/l、煙酸0.75mg/l、肌醇130mg/l、甘氨酸1.0mg/l、椰汁40-60ml/l、玉米粉40-200g/l和蔗糖10-20g/l及瓊脂6-8g/l。該培養(yǎng)基是改良ms一號(hào)培養(yǎng)基加椰汁40-60ml/l、玉米粉40-200g/l和蔗糖10-20g/l及瓊脂6-8g/l。本發(fā)明進(jìn)一步提供生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基同時(shí)綜合了n6和b5培養(yǎng)基的特點(diǎn)，調(diào)整了n元素和s元素的用量，大幅提高了鹽酸硫胺素等有機(jī)物使用量及其配比，有效降低了不利于生長(zhǎng)發(fā)育的有害物質(zhì)對(duì)試管苗的毒害作用；只添加生長(zhǎng)素萘乙酸(naa)而沒(méi)有添加細(xì)胞分裂素，利于芽體伸長(zhǎng)而不分化叢生苗，在蛋白胨的作用下更有利于培養(yǎng)健壯芽體；添加的玉米粉不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且富含粗纖維，與萘乙酸協(xié)同誘導(dǎo)發(fā)根壯根，促進(jìn)了微塊莖誘導(dǎo)和的繼代培養(yǎng)。步驟(5)所述生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基按照濃度計(jì)包括：硝酸銨1200mg/l、硝酸鉀2000mg/l、硫酸銨230mg/l、氯化鈣280-330mg/l、硝酸鈣100-150mg/l、硫酸鎂200-300mg/l、磷酸二氫鉀180-250mg/l、碘化鉀0.85-0.95mg/l、硼酸4.5mg/l、硫酸錳20.3mg/l、硫酸鋅6.2mg/l、鉬酸鈉0.31mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l、硫酸鐵27.8mg/l、鹽酸硫胺素2-10mg/l、鹽酸吡哆醇1.8mg/l、煙酸0.75mg/l、肌醇125mg/l、生物素0.4mg/l、甘氨酸1.3mg/l、0.2-0.4mg/l萘乙酸(naa)、0.02-0.04mg/l多效唑、30-45g/l香蕉、0.5-2.0g/l蛋白胨、50-100g/l玉米粉、28-50g/l蔗糖、6-7g/l和6-7g/l瓊脂。該培養(yǎng)基是改良ms二號(hào)培養(yǎng)基加30-45g/l香蕉、0.5-2.0g/l蛋白胨、50-100g/l玉米粉、28-50g/l蔗糖、6-7g/l和6-7g/l瓊脂。進(jìn)一步地，步驟(1)所述的蒴果是采用人工授粉或者自然授粉得到的蒴果，所述的人工授粉包括同株人工授粉或異株人工授粉。本發(fā)明的原理：本發(fā)明提供2種培養(yǎng)基配方，以ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，綜合n6和b5培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)，添加了白及種子組培不同發(fā)育階段所需要的有機(jī)物質(zhì)，通過(guò)合理調(diào)整培養(yǎng)基中的s元素和n元素的用量，適時(shí)調(diào)整鹽酸硫胺素等有機(jī)物使用量及其配比，有效降低了不利于生長(zhǎng)發(fā)育的有害物質(zhì)對(duì)試管苗的毒害作用。同時(shí)在不同生長(zhǎng)階段給予不同光照強(qiáng)度，促進(jìn)白及種胚萌動(dòng)后及時(shí)分化葉原基，實(shí)現(xiàn)種子萌發(fā)、葉芽分化、塊莖形成及生根同步進(jìn)行，萌發(fā)率最高可以達(dá)到97％。培養(yǎng)過(guò)程不經(jīng)過(guò)原球莖階段，縮短培養(yǎng)時(shí)間近50天，降低了生產(chǎn)成本。培養(yǎng)得到的白及種苗濃綠健壯、長(zhǎng)勢(shì)旺盛、移栽成活率高、塊莖大，培養(yǎng)周期短，能有效提高田間種植的塊莖發(fā)育速度，提高藥材產(chǎn)量。本發(fā)明所提供的一種白及微塊莖的快速繁殖方法，對(duì)比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：1)本發(fā)明提供的白及微塊莖的組培快繁方法，在不同生長(zhǎng)階段給予不同光照強(qiáng)度與培養(yǎng)溫度，促進(jìn)白及種胚高效萌發(fā)，及其萌發(fā)后及時(shí)分化葉原基形成芽體，生根與塊莖形成在同一培養(yǎng)基中誘導(dǎo)完成，實(shí)現(xiàn)種子萌發(fā)與葉芽分化、生根成苗與微塊莖誘導(dǎo)同步完成，誘導(dǎo)率高，種苗質(zhì)量高和移栽成活率高，實(shí)現(xiàn)白及種苗的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)，能有效保護(hù)和搶救野生資源，還能滿足規(guī)?；a(chǎn)的需求。2)本發(fā)明結(jié)合改良的2種培養(yǎng)基配方和3種光照培養(yǎng)條件，通過(guò)合理調(diào)整ms基本培養(yǎng)基中的s元素和n元素的用量，以及適時(shí)調(diào)整鹽酸硫胺素等有機(jī)物質(zhì)使用量及其配比，從而能協(xié)同增效作用促使白及種胚快速吸水膨大、萌發(fā)；更有利于培養(yǎng)健壯芽體。3)繼代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了微塊莖和植株的增殖,平均增殖倍數(shù)3.63。由此繼代長(zhǎng)出的芽非常粗壯，是種子苗不可相比的，切割再次轉(zhuǎn)移繼代培養(yǎng)，生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)突出，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，移栽成活率高，且藥材的產(chǎn)量也比種子苗的塊莖產(chǎn)量高。4)本發(fā)明的培養(yǎng)方法促進(jìn)白及種子高效萌發(fā)，不經(jīng)歷原球莖階段，能快速分化葉和芽，無(wú)需經(jīng)歷壯苗階段直接誘導(dǎo)出微塊莖，誘導(dǎo)率高，種子萌發(fā)率可達(dá)97％，微塊莖誘導(dǎo)率達(dá)181％以上，縮短培養(yǎng)時(shí)間50天左右，降低了生產(chǎn)成本。培養(yǎng)得到的白及種苗與微塊莖濃綠健壯、長(zhǎng)勢(shì)旺盛、移栽成活率高，培養(yǎng)周期短，能有效提高田間種植的塊莖發(fā)育速度，提高產(chǎn)量。5)本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，具有投入少、產(chǎn)出高的特點(diǎn)，生產(chǎn)周期短，可操作性強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值高，適于工廠化規(guī)?；a(chǎn)。6)本發(fā)明利用種子進(jìn)行有性繁殖，能夠在一定時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量巨大的可供遺傳利用的種苗，還能經(jīng)過(guò)篩選獲得大量的性狀優(yōu)良的株系與品系，應(yīng)用前景廣闊。附圖說(shuō)明圖1為采用不同添加物對(duì)白及種子萌發(fā)率影響的結(jié)果；圖2為誘導(dǎo)萌發(fā)的白及芽體；圖3為具微塊莖的白及植株；圖4為分割微塊莖增殖培養(yǎng)萌發(fā)不定芽；圖5為移栽試管苗基部生成的塊莖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。根據(jù)本發(fā)明提出的白及微塊莖的組培快繁方法可選因素較多，可以設(shè)計(jì)出多種實(shí)施例，因此具體的實(shí)施例僅作為本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)方式的示例性說(shuō)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。為了具體的描述本發(fā)明，有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，選擇以下實(shí)施例進(jìn)行示例性說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明未述部分與現(xiàn)有技術(shù)相同。實(shí)施例1本發(fā)明白及微塊莖的組培快繁方法白及微塊莖的組培快繁方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)白及果實(shí)的選擇：選擇外表顏色為黃綠色、黃色或褐色且飽滿、未開(kāi)裂的蒴果用于組織培養(yǎng)；(2)無(wú)菌播種：將步驟(1)中選取的果實(shí)用質(zhì)量百分比濃度為70％的酒精浸泡45秒以上，然后置于質(zhì)量百分比濃度為0.12％的升汞溶液中消毒8分鐘，之后用無(wú)菌水沖洗3次后，切開(kāi)果皮，將黃白色或黃色或褐色的粉狀種子均勻撒播在種胚萌發(fā)培養(yǎng)基表面；(3)種胚萌發(fā)培養(yǎng)：將上述撒播了種子后的種胚萌發(fā)培養(yǎng)基置于溫度為15℃且無(wú)光照條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)種胚萌發(fā)；(4)芽分化培養(yǎng)：在上述步驟(3)種子萌發(fā)培養(yǎng)7天的時(shí)候，觀察種胚，當(dāng)種胚陸續(xù)膨大、萌發(fā)形成白色或乳黃色的尚未突破種皮的近球狀體時(shí)，接著在以下條件進(jìn)行光照培養(yǎng)：光照強(qiáng)度為2000lx，光照時(shí)間8小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度15℃；光照10-20天時(shí)，當(dāng)種胚由白色轉(zhuǎn)為綠色，近球狀體頂端分生組織陸續(xù)分化出子葉、子葉分化發(fā)育形成具2-3片葉的芽體，且95％以上的球狀體發(fā)育形成芽體時(shí)轉(zhuǎn)入下一階段培養(yǎng)；(5)生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述步驟(4)芽分化培養(yǎng)發(fā)育出的芽體接種至生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行第一階段的生根光照培養(yǎng)；光照培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1300lux，每天光照10小時(shí)，溫度18℃，培養(yǎng)時(shí)間40天；當(dāng)觀察芽體基部膨大，并且有的在膨大處萌生出3條白色根系，有的膨大呈1mm左右球狀并在其周邊長(zhǎng)出1條細(xì)根時(shí)，接著進(jìn)行第二階段的誘導(dǎo)微塊莖光照培養(yǎng)；光照培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度為1000lux，每天光照6-8小時(shí)，溫度為17℃，培養(yǎng)20天；直至誘導(dǎo)培養(yǎng)根芽交界處膨大形成2mm以上近球形的微塊莖，且上部葉片展開(kāi)、葉長(zhǎng)3cm及以上。步驟(2)所述種胚萌發(fā)培養(yǎng)基按照濃度計(jì)包括以下組分：硝酸銨1100mg/l、硝酸鉀1950mg/l、硫酸銨200mg/l、氯化鈣230mg/l、硝酸鈣80mg/l、硫酸鎂250mg/l、磷酸二氫鉀180mg/l、碘化鉀0.85mg/l、硼酸4.0mg/l、硫酸錳20.3mg/l、硫酸鋅6.2mg/l、鉬酸鈉0.31mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l、硫酸鐵27.8mg/l、鹽酸硫胺素1.2-2.5mg/l、鹽酸吡哆醇1.4mg/l、煙酸0.75mg/l、肌醇130mg/l、甘氨酸1.0mg/l、椰汁40ml/l、玉米粉40g/l和蔗糖10g/l及瓊脂6-8g/l。步驟(5)所述生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基按照濃度計(jì)包括：硝酸銨1200mg/l、硝酸鉀2000mg/l、硫酸銨230mg/l、氯化鈣280mg/l、硝酸鈣100mg/l、硫酸鎂200mg/l、磷酸二氫鉀180mg/l、碘化鉀0.85mg/l、硼酸4.5mg/l、硫酸錳20.3mg/l、硫酸鋅6.2mg/l、鉬酸鈉0.31mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l、硫酸鐵27.8mg/l、鹽酸硫胺素2-10mg/l、鹽酸吡哆醇1.8mg/l、煙酸0.75mg/l、肌醇125mg/l、生物素0.4mg/l、甘氨酸1.3mg/l、0.2mg/l萘乙酸(naa)、0.02mg/l多效唑、30g/l香蕉、0.5g/l蛋白胨、50g/l玉米粉、28g/l蔗糖、6g/l和6-7g/l瓊脂。步驟(1)所述的蒴果是采用人工授粉或者自然授粉得到的蒴果，所述的人工授粉包括同株人工授粉或異株人工授粉。實(shí)施例2本發(fā)明白及微塊莖的組培快繁方法白及微塊莖的組培快繁方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)白及果實(shí)的選擇：選擇外表顏色為黃綠色、黃色或褐色且飽滿、未開(kāi)裂的蒴果用于組織培養(yǎng)；(2)無(wú)菌播種：將步驟(1)中選取的果實(shí)用質(zhì)量百分比濃度為85％的酒精浸泡45秒以上，然后置于質(zhì)量百分比濃度為0.25％的升汞溶液中消毒15分鐘，之后用無(wú)菌水沖洗5次后，切開(kāi)果皮，將黃白色或黃色或褐色的粉狀種子均勻撒播在種胚萌發(fā)培養(yǎng)基表面；(3)種胚萌發(fā)培養(yǎng)：將上述撒播了種子后的種胚萌發(fā)培養(yǎng)基置于溫度為25℃且無(wú)光照條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)種胚萌發(fā)；(4)芽分化培養(yǎng)：在上述步驟(3)種子萌發(fā)培養(yǎng)20天的時(shí)候，觀察種胚，當(dāng)種胚陸續(xù)膨大、萌發(fā)形成白色或乳黃色的尚未突破種皮的近球狀體時(shí)，接著在以下條件進(jìn)行光照培養(yǎng)：光照強(qiáng)度為2500lx，光照時(shí)間10小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度25℃；光照培養(yǎng)10-20天，當(dāng)種胚由白色轉(zhuǎn)為綠色，近球狀體頂端分生組織陸續(xù)分化出子葉、子葉分化發(fā)育形成具2-3片葉的芽體，且95％以上的球狀體發(fā)育形成芽體時(shí)轉(zhuǎn)入下一階段培養(yǎng)；如圖2所示的是誘導(dǎo)萌發(fā)的白及芽體。(5)生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述步驟(4)芽分化培養(yǎng)發(fā)育出的芽體接種至生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行第一階段的生根光照培養(yǎng)；光照培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1700lux，每天光照13小時(shí)，溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間65天；當(dāng)觀察芽體基部膨大，并且有的在膨大處萌生出5條白色根系，有的膨大呈1mm左右球狀并在其周邊長(zhǎng)出3條細(xì)根時(shí)，接著進(jìn)行第二階段的誘導(dǎo)微塊莖光照培養(yǎng)；光照培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度為1500lux，每天光照8小時(shí)，溫度為23℃，培養(yǎng)30天；直至誘導(dǎo)培養(yǎng)根芽交界處膨大形成2mm以上近球形的微塊莖，且上部葉片展開(kāi)、葉長(zhǎng)3cm及以上。如圖3所示是具微塊莖的白及植株。(6)繼代培養(yǎng)：將上述步驟(5)生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的微塊莖的種苗切去葉片和根系，然后分割微塊莖重復(fù)步驟(5)的生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)，在微塊莖的葉痕處分化出數(shù)個(gè)粗壯的不定芽后，繼續(xù)培養(yǎng)不定芽基部形成小塊莖。如圖4所示的是分割微塊莖增殖培養(yǎng)萌發(fā)不定芽步驟(2)所述種胚萌發(fā)培養(yǎng)基按照濃度計(jì)包括以下組分：硝酸銨1100mg/l、硝酸鉀1950mg/l、硫酸銨200mg/l、氯化鈣300mg/l、硝酸鈣80mg/l、硫酸鎂360mg/l、磷酸二氫鉀190mg/l、碘化鉀0.85mg/l、硼酸4.0mg/l、硫酸錳20.3mg/l、硫酸鋅6.2mg/l、鉬酸鈉0.31mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l、硫酸鐵27.8mg/l、鹽酸硫胺素2.5mg/l、鹽酸吡哆醇1.4mg/l、煙酸0.75mg/l、肌醇130mg/l、甘氨酸1.0mg/l、椰汁60ml/l、玉米粉200g/l和蔗糖20g/l及瓊脂8g/l。步驟(5)所述生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基按照濃度計(jì)包括：硝酸銨1200mg/l、硝酸鉀2000mg/l、硫酸銨230mg/l、氯化鈣330mg/l、硝酸鈣150mg/l、硫酸鎂300mg/l、磷酸二氫鉀250mg/l、碘化鉀0.85-0.95mg/l、硼酸4.5mg/l、硫酸錳20.3mg/l、硫酸鋅6.2mg/l、鉬酸鈉0.31mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l、硫酸鐵27.8mg/l、鹽酸硫胺素10mg/l、鹽酸吡哆醇1.8mg/l、煙酸0.75mg/l、肌醇125mg/l、生物素0.4mg/l、甘氨酸1.3mg/l、0.4mg/l萘乙酸(naa)、0.04mg/l多效唑、45g/l香蕉、2.0g/l蛋白胨、100g/l玉米粉、50g/l蔗糖、7g/l和6-7g/l瓊脂。步驟(1)所述的蒴果是采用人工授粉或者自然授粉得到的蒴果，所述的人工授粉包括同株人工授粉或異株人工授粉。實(shí)施例3本發(fā)明白及微塊莖的組培快繁方法白及微塊莖的組培快繁方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)白及果實(shí)的選擇：選擇外表顏色為黃綠色、黃色或褐色且飽滿、未開(kāi)裂的蒴果用于組織培養(yǎng)；(2)無(wú)菌播種：將步驟(1)中選取的果實(shí)用質(zhì)量百分比濃度為80％的酒精浸泡45秒以上，然后置于質(zhì)量百分比濃度為20％的升汞溶液中消毒10分鐘，之后用無(wú)菌水沖洗4次后，切開(kāi)果皮，將黃白色或黃色或褐色的粉狀種子均勻撒播在種胚萌發(fā)培養(yǎng)基表面；(3)種胚萌發(fā)培養(yǎng)：將上述撒播了種子后的種胚萌發(fā)培養(yǎng)基置于溫度為20℃且無(wú)光照條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)種胚萌發(fā)；(4)芽分化培養(yǎng)：在上述步驟(3)種子萌發(fā)培養(yǎng)13天的時(shí)候，觀察種胚，當(dāng)種胚陸續(xù)膨大、萌發(fā)形成白色或乳黃色的尚未突破種皮的近球狀體時(shí)，接著在以下條件進(jìn)行光照培養(yǎng)：光照強(qiáng)度為2200lx，光照時(shí)間9小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度20℃；光照培養(yǎng)10-20天，當(dāng)種胚由白色轉(zhuǎn)為綠色，近球狀體頂端分生組織陸續(xù)分化出子葉、子葉分化發(fā)育形成具2-3片葉的芽體，且95％以上的球狀體發(fā)育形成芽體時(shí)轉(zhuǎn)入下一階段培養(yǎng)；(5)生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述步驟(4)芽分化培養(yǎng)發(fā)育出的芽體接種至生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行第一階段的生根光照培養(yǎng)；光照培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1500lux，每天光照12小時(shí)，溫度22℃，培養(yǎng)時(shí)間55天；當(dāng)觀察芽體基部膨大，并且有的在膨大處萌生出4條白色根系，有的膨大呈1mm左右球狀并在其周邊長(zhǎng)出2條細(xì)根時(shí)，接著進(jìn)行第二階段的誘導(dǎo)微塊莖光照培養(yǎng)；光照培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度為1200lux，每天光照7小時(shí)，溫度為20℃，培養(yǎng)22天；直至誘導(dǎo)培養(yǎng)根芽交界處膨大形成2mm以上近球形的微塊莖，且上部葉片展開(kāi)、葉長(zhǎng)3cm及以上。所述白及微塊莖的組培快繁方法還包括步驟(6)繼代培養(yǎng)：將上述步驟(5)生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的微塊莖的種苗切去葉片和根系，然后分割微塊莖重復(fù)步驟(5)的生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)，在微塊莖的葉痕處分化出數(shù)個(gè)粗壯的不定芽后，繼續(xù)培養(yǎng)不定芽基部形成小塊莖。步驟(2)所述種胚萌發(fā)培養(yǎng)基按照濃度計(jì)包括以下組分：硝酸銨1100mg/l、硝酸鉀1950mg/l、硫酸銨200mg/l、氯化鈣280mg/l、硝酸鈣80mg/l、硫酸鎂300mg/l、磷酸二氫鉀185mg/l、碘化鉀0.85mg/l、硼酸4.0mg/l、硫酸錳20.3mg/l、硫酸鋅6.2mg/l、鉬酸鈉0.31mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l、硫酸鐵27.8mg/l、鹽酸硫胺素2.0mg/l、鹽酸吡哆醇1.4mg/l、煙酸0.75mg/l、肌醇130mg/l、甘氨酸1.0mg/l、椰汁50ml/l、玉米粉120g/l和蔗糖15g/l及瓊脂7g/l。步驟(5)所述生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基按照濃度計(jì)包括：硝酸銨1200mg/l、硝酸鉀2000mg/l、硫酸銨230mg/l、氯化鈣300mg/l、硝酸鈣120mg/l、硫酸鎂250mg/l、磷酸二氫鉀210mg/l、碘化鉀0.90mg/l、硼酸4.5mg/l、硫酸錳20.3mg/l、硫酸鋅6.2mg/l、鉬酸鈉0.31mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l、硫酸鐵27.8mg/l、鹽酸硫胺素7mg/l、鹽酸吡哆醇1.8mg/l、煙酸0.75mg/l、肌醇125mg/l、生物素0.4mg/l、甘氨酸1.3mg/l、0.3mg/l萘乙酸(naa)、0.03mg/l多效唑、37g/l香蕉、1.2g/l蛋白胨、75g/l玉米粉、41g/l蔗糖、7g/l和6g/l瓊脂。步驟(1)所述的蒴果是采用人工授粉或者自然授粉得到的蒴果，所述的人工授粉包括同株人工授粉或異株人工授粉。表1不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)白及種子萌發(fā)的影響將白及種子播撒于下述各個(gè)培養(yǎng)基中，然后置于溫度為15-25℃且無(wú)光照條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)種子萌發(fā)種胚(ms、n6、b5和實(shí)施例1所述的種胚萌發(fā)培養(yǎng)基)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。從上表可知，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基，萌發(fā)快速，且接種30d生長(zhǎng)發(fā)育情況良好。表2不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)白及微塊莖培養(yǎng)的影響注：微塊莖平均粒徑＝(微塊莖長(zhǎng)經(jīng)+微塊莖短莖)/2實(shí)施例2步驟(4)芽分化培養(yǎng)發(fā)育出的芽體接種至生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行生根光照培養(yǎng)(ms、n6、b5和實(shí)施例2所述的生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基)，然后按照實(shí)施例2所述的生根與微塊莖培養(yǎng)，其它條件相同，從上表可知，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基，微塊莖誘導(dǎo)率高，微塊莖平均粒徑大，植株漲勢(shì)好。培養(yǎng)基中添加不同添加物對(duì)白及種子萌發(fā)的影響實(shí)驗(yàn)(1)白及果實(shí)的選擇：采集自然授粉的白及蒴果，選擇果實(shí)飽滿、外表顏色黃綠色或近黃色且未開(kāi)裂者用于組織培養(yǎng)；(2)無(wú)菌播種：將步驟(1)中選取的果實(shí)用質(zhì)量百分比濃度為70-85％的酒精浸泡60秒后，置于質(zhì)量百分比濃度為0.15％升汞溶液中消毒8-10分鐘，用無(wú)菌水沖洗干凈后(一般沖洗3-5次即可)，切開(kāi)果皮，將黃白色或黃色粉狀物種子均勻撒播在種胚萌發(fā)的固體培養(yǎng)基表面，所述培養(yǎng)基分別為ms改良一號(hào)培養(yǎng)基加相同濃度(50g/l)的椰汁、玉米粉、馬鈴薯、玉米粉+椰汁、什么都沒(méi)有添加；(3)種胚萌發(fā)培養(yǎng)：接種后的培養(yǎng)瓶置于溫度20±5℃、無(wú)光照條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)種子萌發(fā)；(4)萌發(fā)結(jié)果調(diào)查：圖1表明，在ms改良一號(hào)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加椰汁、玉米粉、馬鈴薯、玉米粉+椰汁、什么都沒(méi)有添加對(duì)白及種子萌發(fā)有一定的影響作用。結(jié)果顯示：沒(méi)有添加的對(duì)照萌發(fā)率最低，僅有40％左右，添加椰汁的萌發(fā)率約61％，添加馬鈴薯的萌發(fā)率67.32％與添加玉米粉(78.63％)及玉米粉+椰汁(96.71％)間具明顯差異，同時(shí)添加玉米粉與椰汁表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)萌發(fā)作用，不僅具有協(xié)同增效的促進(jìn)作用，萌發(fā)率高達(dá)93.11％，遠(yuǎn)高于添加馬鈴薯的萌發(fā)率，而且配制培養(yǎng)基時(shí)無(wú)需制備馬鈴薯汁/泥，大大簡(jiǎn)化了程序，便于工廠化生產(chǎn)。萘乙酸對(duì)白及微塊莖形成和生長(zhǎng)的影響(1)將誘導(dǎo)分化發(fā)育的芽體轉(zhuǎn)接至以下添加不同濃度萘乙酸(naa)的生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整形成的ms改良二號(hào)培養(yǎng)基，分別添加0.02mg/l多效唑、35g/l香蕉、1.0g/l蛋白胨、50g/l玉米粉和50g/l蔗糖及7g/l瓊脂粉上，萘乙酸(naa)的濃度為0-0.6mg/l進(jìn)行比較。(2)接種的培養(yǎng)瓶置于室溫23±5℃，光照強(qiáng)度1300-1700lux，每天光照10小時(shí)的條件下培養(yǎng)40-65天。此時(shí)需調(diào)整光照條件誘導(dǎo)微塊莖形成。所述誘導(dǎo)微塊莖的光照條件為光照度1000-1500lux，每天光照6-8小時(shí)，培養(yǎng)溫度為20±3℃，培養(yǎng)20-30天。(3)微塊莖形成的調(diào)查：結(jié)果見(jiàn)表3。萘乙酸(naa)對(duì)白及微塊莖形成有顯著的促進(jìn)作用，沒(méi)有添加naa，則微塊莖誘導(dǎo)率僅8.7％；naa濃度越高，誘導(dǎo)率越高，但微塊莖越小，可利用率也小。綜合考量微塊莖誘導(dǎo)率和大小，naa的濃度以0.2-0.4mg/l為宜。表3萘乙酸對(duì)白及微塊莖形成和生長(zhǎng)的影響萘乙酸naa(mg/l)微塊莖誘導(dǎo)率(％)微塊莖平均粒徑(mm)08.70.790.153.11.160.21674.170.31983.630.42843.120.5330.31.200.63410.77蛋白胨對(duì)白及微塊莖形成和生長(zhǎng)的影響(1)將誘導(dǎo)分化發(fā)育的芽體轉(zhuǎn)接至以下添加不同濃度蛋白胨的生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整形成的ms改良二號(hào)培養(yǎng)基，分別添加0.3mg/l萘乙酸(naa)、0.02mg/l多效唑、35g/l香蕉、50g/l玉米粉和50g/l蔗糖及7g/l瓊脂粉上，蛋白胨的試驗(yàn)濃度為0-3.0mg/l進(jìn)行比較。(2)接種的培養(yǎng)瓶置于室溫23±5℃，光照強(qiáng)度1300-1700lux，每天光照10小時(shí)的條件下培養(yǎng)40-65天。此時(shí)需調(diào)整光照條件誘導(dǎo)微塊莖形成。所述誘導(dǎo)微塊莖的光照條件為光照度1000-1500lux，每天光照6-8小時(shí)，培養(yǎng)溫度為20±3℃，培養(yǎng)20-30天。(3)微塊莖形成的調(diào)查：結(jié)果見(jiàn)表4。蛋白胨對(duì)微塊莖的形成和發(fā)育有影響，隨著蛋白胨濃度的提高，塊莖增大明顯，濃度達(dá)2.5mg/l時(shí)，微塊莖達(dá)最大，但誘導(dǎo)率下降明顯，且出現(xiàn)死苗塊莖軟、爛?？梢?jiàn)，蛋白胨促進(jìn)微塊莖發(fā)育增大，高濃度對(duì)種苗有一定的毒害作用，死苗比例隨著蛋白胨濃度提高增大。表4蛋白胨對(duì)白及微塊莖形成和生長(zhǎng)的影響玉米粉對(duì)白及微塊莖形成和生長(zhǎng)的影響(1)將誘導(dǎo)分化發(fā)育的芽體轉(zhuǎn)接至以下添加不同濃度玉米粉的生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述生根與微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整形成的ms改良二號(hào)培養(yǎng)基，添加0.3mg/l萘乙酸(naa)、0.02mg/l多效唑、35g/l香蕉、50g/l玉米粉和50g/l蔗糖及7g/l瓊脂粉上，蛋白胨的試驗(yàn)濃度為0-3.0mg/l進(jìn)行比較。(2)接種的培養(yǎng)瓶置于室溫23±5℃，光照強(qiáng)度1300-1700lux，每天光照10小時(shí)的條件下培養(yǎng)40-65天。此時(shí)需調(diào)整光照條件誘導(dǎo)微塊莖形成。所述誘導(dǎo)微塊莖的光照條件為光照度1000-1500lux，每天光照6-8小時(shí)，培養(yǎng)溫度為20±3℃，培養(yǎng)20-30天。(3)微塊莖形成的調(diào)查：結(jié)果見(jiàn)表5。玉米粉促進(jìn)微塊莖形成作用明顯，隨著濃度提高誘導(dǎo)率提高明顯，微塊莖則隨之變小，植株的下部葉片黃化，根細(xì)長(zhǎng)，出現(xiàn)死苗現(xiàn)象。表5玉米粉對(duì)白及微塊莖形成和生長(zhǎng)的影響當(dāng)前第1頁(yè)12