本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及一種新型細(xì)胞凍存液。

背景技術(shù)：

細(xì)胞培養(yǎng)是生物與健康相關(guān)研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)。隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，目前細(xì)胞培養(yǎng)已成為細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科研究的重要基礎(chǔ)。為了深入探討細(xì)胞的生長活動規(guī)律、有關(guān)疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機制，開發(fā)具有不同針對性的細(xì)胞培養(yǎng)方法具有重要意義。

細(xì)胞凍存技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)中一個非常重要的手段，也是細(xì)胞培養(yǎng)中的重要技術(shù)。人們在細(xì)胞生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的研究中，越來越多的運用組織細(xì)胞培養(yǎng)增殖技術(shù)，將有研究意義或有應(yīng)用前景的活體細(xì)胞，采用低溫度進(jìn)行長期保存數(shù)月、數(shù)年、數(shù)十年甚至數(shù)百年，一旦需要，可隨時對所保存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，恢復(fù)其完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性，供生命科學(xué)研究實驗。

本發(fā)明所述的新型細(xì)胞凍存液安全性、穩(wěn)定性好，細(xì)胞復(fù)蘇后存活率高，可以適用于人源以及非人源的多種細(xì)胞的培養(yǎng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明提供了一種新型細(xì)胞凍存液，用于多種人源以及非人源細(xì)胞的培養(yǎng)。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種新型細(xì)胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5-15份、羥乙基淀粉2-5份、殼聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、維生素c1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基80-90份。本發(fā)明所述的新型細(xì)胞凍存液組分合理，營養(yǎng)豐富，其中，右旋糖酐為滲透性保護(hù)液，而n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺則抑制細(xì)胞活動和基因表達(dá)，維生素c的抗氧化性好，在保證休眠細(xì)胞的營養(yǎng)的同時還可以顯著減少對細(xì)胞的損傷，提高凍存細(xì)胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態(tài)。

進(jìn)一步的，上述的新型細(xì)胞凍存液，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82-88份、碳酸氫鈉12-25份、丙酮酸鈉10-16份、絲膠蛋白5-9份、氯化鉀35-45份、無水硫酸鎂6-10份、氯化鈉70-78份、無水磷酸二氫鈉10-14份、葉酸0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、煙酰胺0.3-0.6份、無水氯化鈣25-35份、硝酸鐵0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸鈉12-16份、d-泛酸鈣0.3-0.6份、酒石酸膽堿0.6-0.8份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.2-0.4份、鹽酸吡哆辛0.3-0.5份、n-異丙基丙烯酰胺0.2-0.4份、亞麻酸1-2份、乙醇胺0.6-0.8份、芳香酸酯0.3-0.8份、酚紅鈉1-1.3份和去離子水100份?；A(chǔ)培養(yǎng)基組分合理，營養(yǎng)豐富，可以提高細(xì)胞凍存時的營養(yǎng)物質(zhì)，保證凍存細(xì)胞的活性。

進(jìn)一步的，上述的新型細(xì)胞凍存液，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5-10份、l-鹽酸胱氨酸3-8份、l-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-鹽酸組氨酸4-6份、l-異亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-鹽酸賴氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-蘇氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-纈氨酸8-12份。

進(jìn)一步的，上述的新型細(xì)胞凍存液，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子2-10份、白介素23-8份、白介素43-6份、白介素141-5份、ifn-γ3-6份和神經(jīng)白細(xì)胞素1-4份。

進(jìn)一步的，上述的新型細(xì)胞凍存液，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括體積比10-30%的胎牛血清?？梢愿鶕?jù)需要，進(jìn)一步增加胎牛血清，提高凍存細(xì)胞的存活率，保持細(xì)胞活性。

進(jìn)一步的，上述的新型細(xì)胞凍存液，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。可以有效防止凍存細(xì)胞被污染。

進(jìn)一步的，上述的新型細(xì)胞凍存液，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。青霉素和鏈霉素活性好，效果佳。

有益效果：本發(fā)明所述的新型細(xì)胞凍存液，其組分合理，營養(yǎng)豐富，在保證休眠細(xì)胞的營養(yǎng)的同時還可以顯著減少對細(xì)胞的損傷，提高凍存細(xì)胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態(tài)。

附圖說明

圖1為實施例1-4細(xì)胞存活率的測定圖。

具體實施方式

下面將通過幾個具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些實施例只是為了說明問題，并不是一種限制。

實施例1

一種新型細(xì)胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5份、羥乙基淀粉2份、殼聚糖5份、谷胱甘肽2份、維生素c1份、右旋糖酐0.3份、丙二醇0.5份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基80份。

其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉10份、絲膠蛋白5份、氯化鉀35份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉10份、葉酸0.3份、肌醇0.8份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣25份、硝酸鐵0.2份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.3份、酒石酸膽堿0.6份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.3份、n-異丙基丙烯酰胺0.2份、亞麻酸1份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸3份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子2份、白介素23份、白介素43份、白介素141份、ifn-γ3份和神經(jīng)白細(xì)胞素1份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括體積比10%的胎牛血清。此外，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。

將上述細(xì)胞凍存液，應(yīng)用于人源性肝癌細(xì)胞a549的凍存。

實施例2

一種新型細(xì)胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜15份、羥乙基淀粉5份、殼聚糖10份、谷胱甘肽5份、維生素c4份、右旋糖酐4份、丙二醇2份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺1份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基90份。

其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉16份、絲膠蛋白9份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂10份、氯化鈉78份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.5份、肌醇1.2份、煙酰胺0.6份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.4份、丁二酸8份、丁二酸鈉16份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽堿0.8份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.5份、n-異丙基丙烯酰胺0.4份、亞麻酸2份、乙醇胺0.8份、芳香酸酯0.8份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸10份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸5份、l-鹽酸組氨酸6份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-蘇氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-纈氨酸12份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子8份、白介素28份、白介素44份、白介素145份、ifn-γ6份和神經(jīng)白細(xì)胞素4份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括體積比30%的胎牛血清。此外，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。

將上述細(xì)胞凍存液，應(yīng)用于小鼠來源的黑色素瘤細(xì)胞b16的凍存。

實施例3

一種新型細(xì)胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜10份、羥乙基淀粉3份、殼聚糖6份、谷胱甘肽3份、維生素c2份、右旋糖酐3份、丙二醇1份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基85份。

其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、絲膠蛋白6份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、無水磷酸二氫鈉12份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、n-異丙基丙烯酰胺0.3份、亞麻酸1.6份、乙醇胺0.7份、芳香酸酯0.5份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸8份、l-鹽酸胱氨酸6份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-鹽酸賴氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸9份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子6份、白介素25份、白介素44份、白介素145份、ifn-γ5份和神經(jīng)白細(xì)胞素3份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括體積比15%的胎牛血清。此外，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。

將上述細(xì)胞凍存液，應(yīng)用于猴腎細(xì)胞marc145的凍存。

實施例4

一種新型細(xì)胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜15份、羥乙基淀粉2份、殼聚糖6份、谷胱甘肽3份、維生素c1份、右旋糖酐4份、丙二醇1份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基90份。

其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉12份、絲膠蛋白6份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉72份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.3份、肌醇1份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.3份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、n-異丙基丙烯酰胺0.4份、亞麻酸2份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括4份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸5份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸10份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子2份、白介素28份、白介素43份、白介素144份、ifn-γ5份和神經(jīng)白細(xì)胞素2份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括體積比30%的胎牛血清。此外，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。

將上述細(xì)胞凍存液，應(yīng)用于大鼠的永生化肝星形細(xì)胞hsc-t6的凍存。

將實施例1-4凍存的細(xì)胞分別取凍存后3個月、6個月、9個月、12個月、18個月以及24個月的凍存細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，并對細(xì)胞存活率進(jìn)行測定，細(xì)胞存活率均在85%以上。

以上所述僅是發(fā)明的幾個實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。