本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種珍稀瀕危植物蒙古沙冬青離體快繁的方法。

背景技術(shù)：

蒙古沙冬青，又稱大沙冬青，屬豆科沙冬青屬。主要分布于內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏等地的荒漠地區(qū)。它對(duì)環(huán)境條件適應(yīng)能力極強(qiáng)，是我國北方荒漠地區(qū)唯一一種強(qiáng)旱生常綠闊葉灌木，也是阿拉善荒漠區(qū)特有的建群植物，對(duì)防沙固沙、防止水土流失、維持當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)平衡起著重要的作用，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和資源價(jià)值。但蒙古沙冬青狹小的分布范圍和近年來人類活動(dòng)的破壞，其數(shù)量正在不斷減少，現(xiàn)已瀕臨滅絕，被列為國家三級(jí)保護(hù)植物。蒙古沙冬青自然更新力弱，實(shí)生苗移植生根困難，因此采用組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行離體快速繁殖是保護(hù)蒙古沙冬青這種珍稀瀕危種質(zhì)資源、解決該物種自然更新能力弱、繁殖困難等問題的有效手段之一。

蒙古沙冬青的離體培養(yǎng)技術(shù)始于上世紀(jì)80年代。一般采用無菌育苗的方式獲得子葉、胚軸或小莖段，選用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織與芽的誘導(dǎo)分化。最早是在1988年，丁曉莉誘導(dǎo)出了愈傷和芽點(diǎn)。慈忠玲等在1994年對(duì)愈傷組織和體細(xì)胞胚發(fā)生過程做過研究，但體細(xì)胞胚中途退化，未能發(fā)育為完整的植株。1997年蔣志榮等選用無菌苗莖段進(jìn)行試驗(yàn),得到了比較合適的誘導(dǎo)芽和根的激素配比。2000年，何麗君等通過對(duì)沙冬青無菌實(shí)生苗不同部位的外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，直接得到了再生植株，轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中形成完整植株。

近年，有王方琳等在2016年以蒙古沙冬青無菌苗的子葉、莖段為外植體材料，研究了不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)不同外植體愈傷組織培養(yǎng)、叢生芽增殖及生根培養(yǎng)的影響，篩選出了適宜各階段培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方。通過部分組織如將子葉切成小片進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，再進(jìn)行芽的誘導(dǎo)與生根以體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方式進(jìn)行的再生植株誘導(dǎo)，在培養(yǎng)過程中存在許多問題如愈傷組織不易分化且褐化嚴(yán)重，不能多次繼代，分化的芽有玻璃化現(xiàn)象，有的雖然也能壯苗生根，卻達(dá)不到快速繁育等問題。迄今，針對(duì)蒙古沙冬青沒有經(jīng)過器官培養(yǎng)途徑進(jìn)行離體快速繁殖的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種珍稀瀕危植物蒙古沙冬青離體快繁的方法，以解決現(xiàn)有方法存在愈傷組織誘導(dǎo)中褐化嚴(yán)重、不易分化的問題。

為了使蒙古沙冬青這種生態(tài)意義巨大的樹種在野外繁殖資源缺少的情況下，能夠成功進(jìn)行繁殖使之能夠保存和可持續(xù)利用，并能夠避免傳統(tǒng)的離體培養(yǎng)中存在的諸多問題，縮短培養(yǎng)周期，研發(fā)了本發(fā)明珍稀瀕危植物蒙古沙冬青離體快繁的方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：一種珍稀瀕危植物蒙古沙冬青離體快繁的方法，包括如下步驟：

a、蒙古沙冬青外植體的獲得：

取消毒的蒙古沙冬青種子，在無菌條件下接種到含2.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后，切取萌發(fā)幼苗的兩片子葉節(jié)作為外植體；

b、叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將所述步驟a中得到的外植體近軸面朝上，傾斜插入b5培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)，然后用輔助光誘導(dǎo)15—20d；

c、叢生芽的伸長培養(yǎng)：

從子葉節(jié)處誘導(dǎo)出叢生芽后，剔除剩余子葉，轉(zhuǎn)接于b5培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)，然后用輔助光下伸長培養(yǎng)20—25d；

d、生根培養(yǎng)：

將所述步驟c中長度為2-3cm的叢生芽單株切下轉(zhuǎn)接到b5培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10d后，轉(zhuǎn)接入b5培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)20—30d；

e、擴(kuò)大繁殖：

切割所述步驟d中獲得的完整植株的帶腋芽的莖段，轉(zhuǎn)入到含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培養(yǎng)基，黑暗培養(yǎng)，然后用輔助光下伸長培養(yǎng)20—25d；待植株生長到2-3cm，轉(zhuǎn)接入含1.0-2.0mg/liba的1/2b5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根30—40d。

進(jìn)一步的，所述步驟a蒙古沙冬青外植體的獲得具體步驟為，取萌發(fā)的幼苗，上胚軸粗度為3-5mm，保留子葉近胚軸的分生組織部分2-5mm和上胚軸2-4mm，切去了其余部分，然后在兩片子葉中間沿胚軸縱向切開，去掉了腋芽，在子葉與胚軸交接處切開2—4個(gè)傷口，得到兩個(gè)子葉節(jié)外植體。

進(jìn)一步的，所述步驟a、步驟b和步驟c中黑暗培養(yǎng)溫度為，白天22-26℃，夜間17-21℃。

進(jìn)一步的，所述步驟b、步驟c、步驟d、步驟e中黑暗培養(yǎng)時(shí)間為5-7d。

進(jìn)一步的，所述步驟b中叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基。

進(jìn)一步的，所述步驟b和c中輔助光的光周期為14h/d，光強(qiáng)為1000-1500lux。

進(jìn)一步的，所述步驟c中叢生芽特征為，芽叢生，芽數(shù)清晰，芽平均長約0.3-0.5mm。

進(jìn)一步的，所述步驟c中伸長培養(yǎng)基為含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培養(yǎng)基。

進(jìn)一步的，所述步驟d中叢生芽的特征為：叢生芽的平均長度為2-3cm。

進(jìn)一步的，所述步驟d中生根培養(yǎng)基為含1.0-2.0mg/liba的1/2b5培養(yǎng)基。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

（1）本發(fā)明與現(xiàn)有的蒙古沙冬青離體培養(yǎng)相比，取子葉節(jié)這個(gè)部位直接進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)，再生根。這個(gè)過程不發(fā)生愈傷組織從而減少了愈傷組織誘導(dǎo)的步驟，通過子葉節(jié)直接培育成不定芽，極大地縮短了離體培養(yǎng)的時(shí)間，整個(gè)過程從種子萌發(fā)、子葉節(jié)的獲得、叢生芽的誘導(dǎo)與伸長到生根僅需79d。

（2）、在蒙古沙冬青種子萌發(fā)初期，施加外源激素6-ba，可以有效地刺激子葉節(jié)處潛在的分生細(xì)胞不斷分裂并打破頂端優(yōu)勢(shì)，使子葉節(jié)膨大增粗而有利于叢生芽的形成。

（3)、選取萌發(fā)7-11d的種子，胚軸較粗壯，很容易從中軸線分離，組織分裂能力最強(qiáng)更有利于叢生芽的形成。

（4）、叢生芽誘導(dǎo)、伸長培養(yǎng)步驟選用了b5培養(yǎng)基，可以極大地減輕蒙古沙冬青離體快繁過程中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象。

（5)、叢生芽誘導(dǎo)、伸長培養(yǎng)、生根培養(yǎng)步驟均采用黑暗培養(yǎng)5-7d后人工輔助光培養(yǎng)，可以極大地減輕每次轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基所引起的褐化現(xiàn)象。

（6）、經(jīng)過叢生芽誘導(dǎo)、伸長、生根獲得的蒙古沙冬青完整植株長出的新的帶腋芽的莖段，可再次伸長培養(yǎng)并誘導(dǎo)生根形成完整植株，從而達(dá)到了快速擴(kuò)大繁殖的目的。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例可以進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例中ms、b5培養(yǎng)基為現(xiàn)有產(chǎn)品。

實(shí)施例1

（1）蒙古沙冬青外植體的獲得：將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有2.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后，取萌發(fā)的幼苗，上胚軸粗度為3-5mm，保留子葉近胚軸的分生組織部分2-5mm和上胚軸2-4mm，切去其余部分，然后在兩片子葉中間沿胚軸縱向切開，去掉腋芽，用解剖刀在子葉與胚軸交接處切開2—4個(gè)傷口，得到兩個(gè)子葉節(jié)外植體。

（2）叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d，培養(yǎng)溫度白天22-26℃，夜間17-21℃，然后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率78.3%，平均芽數(shù)2.6個(gè)。

（3)叢生芽的伸長培養(yǎng)：待子葉節(jié)出叢生芽長度為0.3-0.5mm時(shí)，剔除剩余子葉，轉(zhuǎn)接于含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d，培養(yǎng)溫度白天22-26℃，夜間17-21℃，然后人工輔助光誘導(dǎo)20d，叢生芽伸長率60.7%。

（4)生根培養(yǎng)：待叢生芽伸長至2-3cm時(shí)，單株切下轉(zhuǎn)接到b5培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10d后，轉(zhuǎn)接入含1.0-2.0mg/liba的1/2b5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)20d，生根率達(dá)53.1%，平均生根數(shù)2.3條。

（5）擴(kuò)大繁殖：切割獲得的完整植株的帶腋芽的莖段，轉(zhuǎn)入到含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培養(yǎng)基，黑暗培養(yǎng)5-7d后，人工輔助光下伸長培養(yǎng)20d，伸長率89.8%。待植株生長到2-3cm，轉(zhuǎn)接入含1.0-2.0mg/liba的1/2b5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根30d，生根率88.2%。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1不同之處在于,步驟（2）叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)中輔助光誘導(dǎo)20d。

實(shí)施例3

與實(shí)施例1不同之處在于,步驟（3)叢生芽的伸長培養(yǎng)中輔助光誘導(dǎo)20d。

將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d，培養(yǎng)溫度白天22-26℃，夜間17-21℃，然后人工叢生芽誘導(dǎo)率78.3%，平均芽數(shù)2.6個(gè)。

實(shí)施例4

與實(shí)施例1不同之處在于,步驟（4)生根培養(yǎng)中轉(zhuǎn)接入b5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)30d。

實(shí)施例5

與實(shí)施例1不同之處在于,步驟（5）擴(kuò)大繁殖中黑暗培養(yǎng)后用輔助光下伸長培養(yǎng)25d，轉(zhuǎn)接入b5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根40d。

為證明本發(fā)明效果，特作出以下16個(gè)對(duì)比例：

對(duì)比例1：將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率18.5%，平均芽數(shù)0.4個(gè)。

對(duì)比例2

將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有1.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率36.7%，平均芽數(shù)1.48個(gè)。

對(duì)比例3

將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有3.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率79.6%，平均芽數(shù)2.8個(gè)。

對(duì)比例4

將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有5.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率79.3%，平均芽數(shù)5.2個(gè)。

對(duì)比例5

將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有2.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)1-5d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率26.9%，平均芽數(shù)2個(gè)。

對(duì)比例6

將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有2.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)13-15d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率39.3%，平均芽數(shù)1.72個(gè)。

對(duì)比例7

將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有2.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率76.6%，平均芽數(shù)2.5個(gè)。

對(duì)比例8

將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有2.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含0.5mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率73.9%，平均芽數(shù)1.45個(gè)。

對(duì)比例9

將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有2.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含1.5mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率78.9%，平均芽數(shù)3.4個(gè)。

對(duì)比例10

將經(jīng)過常規(guī)方法消毒過的蒙古沙冬青種子接種到含有2.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7-11d后取萌發(fā)的幼苗，獲得子葉節(jié)外植體的方法與實(shí)施例1相同。將子葉節(jié)的近軸面朝上，傾斜45℃斜插入含2.5mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)15d，叢生芽誘導(dǎo)率79.6%，平均芽數(shù)4.3個(gè)。

對(duì)比例11

經(jīng)過種子萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)的蒙古沙冬青叢生芽（方法和條件與實(shí)施例1相同），與實(shí)施例1的區(qū)別在于待子葉節(jié)出叢生芽長度為0.3-0.5mm時(shí)，剔除剩余子葉，轉(zhuǎn)接于含1.0mg/l6-ba和0.1-0.3mg/lga3的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)20d，叢生芽伸長率18.5%。

對(duì)比例12

經(jīng)過種子萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)的蒙古沙冬青叢生芽（方法和條件與實(shí)施例1相同），與實(shí)施例1的區(qū)別在于待子葉節(jié)出叢生芽長度為0.3-0.5mm時(shí)，剔除剩余子葉，轉(zhuǎn)接于含1.0mg/l6-ba和0.5mg/lga3的b5培養(yǎng)基中，黑暗誘導(dǎo)5-7d后人工輔助光誘導(dǎo)20d，叢生芽伸長率5.0%。

對(duì)比例13

經(jīng)過種子萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)與伸長后的蒙古沙冬青叢生芽（方法和條件與實(shí)施例1相同），與實(shí)施例1的區(qū)別在于待叢生芽伸長至2-3cm時(shí)，單株切下轉(zhuǎn)接到b5培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10d后，轉(zhuǎn)接入含0.5mg/liba的1/2b5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)20d，生根率達(dá)40.7%，平均生根數(shù)1條。

對(duì)比例14

經(jīng)過種子萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)與伸長后的蒙古沙冬青叢生芽（方法和條件與實(shí)施例1相同），與實(shí)施例1的區(qū)別在于待叢生芽伸長至2-3cm時(shí)，單株切下轉(zhuǎn)接到b5培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10d后，轉(zhuǎn)接入含1.0-2.0mg/liaa的1/2b5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)20d，生根率達(dá)28.9%，平均生根數(shù)1條。

對(duì)比例15

經(jīng)過種子萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)與伸長后的蒙古沙冬青叢生芽（方法和條件與實(shí)施例1相同），與實(shí)施例1的區(qū)別在于待叢生芽伸長至2-3cm時(shí)，單株切下轉(zhuǎn)接到b5培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10d后，轉(zhuǎn)接入含1.0-2.0mg/lnaa的1/2b5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)20d，生根率達(dá)30.63%，平均生根數(shù)1.2條。

對(duì)比例16

經(jīng)過種子萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)與伸長后的蒙古沙冬青叢生芽（方法和條件與實(shí)施例1相同），與實(shí)施例1的區(qū)別在于待叢生芽伸長至2-3cm時(shí)，單株切下轉(zhuǎn)接到b5培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10d后，轉(zhuǎn)接入含1.5-2.0mg/liaa和0.5mg/lnaa的1/2b5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)20d，生根率達(dá)42.6%，平均生根數(shù)1.8條。

對(duì)比例1-4說明，與實(shí)施例1將蒙古沙冬青種子接種到含有2.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中不同，將種子接種到不含有6-ba或含有1.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，獲得的子葉節(jié)胚軸細(xì)弱，用于叢生芽誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)率低，芽數(shù)少。將種子接種到含有3.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，獲得的子葉節(jié)用于叢生芽誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)率與實(shí)施例1相差僅1.3%，平均芽數(shù)僅相差0.2個(gè)，但是叢生芽中部分葉片出現(xiàn)畸形，不利于后期生長發(fā)育。將種子接種到含有5.0mg/l6-ba的ms培養(yǎng)基中，獲得的子葉節(jié)用于叢生芽誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)率與實(shí)施例1相差僅1.0%，平均芽數(shù)雖比實(shí)施例1多1倍，但是6-ba濃度也相應(yīng)的增加到了2.5倍，生產(chǎn)成本增加，且叢生芽多細(xì)密呈簇狀，后期生長無有效芽。

對(duì)比例5-6說明，與實(shí)施例1種子黑暗培養(yǎng)7-11d不同，種子黑暗培養(yǎng)時(shí)間為1-5d，培養(yǎng)1d時(shí)，由于萌發(fā)時(shí)間短，種皮未自然脫落，胚軸未伸出，兩片子葉較難分離。3d-5d時(shí)，子葉黃色，胚軸有伸長但較短且細(xì)弱，獲取子葉節(jié)外植體時(shí)容易斷裂，用于叢生芽誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)率低。種子黑暗培養(yǎng)13-15d，子葉節(jié)處分生組織的分生能力減弱，使得叢生芽誘導(dǎo)降低，平均芽數(shù)降低。

對(duì)比例7說明，與實(shí)施例1將子葉節(jié)接種于含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中不同，將子葉節(jié)接種于含有相同濃度6-ba的ms培養(yǎng)基中，叢生芽誘導(dǎo)率與實(shí)施例1僅相差1.7%，平均芽數(shù)僅相差0.1個(gè)，但是使用ms培養(yǎng)基，生長20d時(shí)葉緣、芽有褐化現(xiàn)象，轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基易褐化死亡。

對(duì)比例8-10說明，與實(shí)施例1將子葉節(jié)接含1.0mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中不同，將子葉節(jié)接種于含有0.5mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，平均芽數(shù)較少。將子葉節(jié)接種于含有1.5mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，叢生芽誘導(dǎo)率與實(shí)施例1相差僅0.6%，平均芽數(shù)雖多0.8個(gè)，但是叢生芽多成簇狀，后期生長發(fā)育中雖有莖葉，但部分為畸形葉。對(duì)比例10將子葉節(jié)接種于含有2.5mg/l6-ba的b5培養(yǎng)基中，叢生芽誘導(dǎo)率與實(shí)施例1相差僅1.3%，平均芽數(shù)雖比實(shí)施例1增加了約1.6倍，但是6-ba濃度也相應(yīng)的增加到了2.5倍，生產(chǎn)成本增加，且叢生芽多細(xì)密呈簇狀，后期生長無有效芽。

對(duì)比例11-12說明，與實(shí)施例1將誘導(dǎo)出的叢生芽轉(zhuǎn)接于含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培養(yǎng)基中不同，將誘導(dǎo)出的叢生芽轉(zhuǎn)接于含1.0mg/l6-ba和0.1-0.3mg/l的ga3的b5培養(yǎng)基中，葉片細(xì)長，莖葉呈黃綠略帶透明，呈玻璃化，莖伸長率低。將誘導(dǎo)出的叢生芽轉(zhuǎn)接于含1.0mg/l的6-ba和0.5mg/l的ga3的b5培養(yǎng)基中，葉片增長增寬，葉片黃綠透明呈玻璃化，莖伸長率低。

對(duì)比例13-16說明，與實(shí)施例1將單株叢生芽轉(zhuǎn)接入含1.0-2.0mg/l的iba的1/2b5培養(yǎng)基不同，將將單株叢生芽轉(zhuǎn)接入含0.5mg/l的iba、1.0-2.0mg/l的iaa、1.0-2.0mg/l的naa、1.5-2.0mg/liaa和0.5mg/lnaa的1/2b5培養(yǎng)基均不利于單株芽生根，生根率較低且生根數(shù)較少。