本發(fā)明屬于海洋貝類養(yǎng)殖評價
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種基于心電參數(shù)確定雙殼貝類積溫促熟最佳溫度的方法。
背景技術(shù)：
：貝類產(chǎn)業(yè)是我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要組成部分,養(yǎng)殖產(chǎn)量超過海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的72％(中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒,2016)。以扇貝為代表的貝類養(yǎng)殖曾引領(lǐng)我國海水養(yǎng)殖的第三次浪潮，推動了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。標(biāo)準(zhǔn)化的人工育苗是雙殼貝類大規(guī)模商業(yè)化養(yǎng)殖的前提條件，而親貝培育又是人工育苗的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，直接影響著配子的質(zhì)量、卵子的受精率、受精卵的孵化率以及幼蟲的變態(tài)率等。因此，經(jīng)濟(jì)貝類培育過程中性腺發(fā)育的好壞,直接影響著苗種生產(chǎn)、生長與養(yǎng)殖。影響貝類性腺發(fā)育的因素除了自身以外,還包括溫度、鹽度、餌料供應(yīng)、種貝密度以及水環(huán)境等多種綜合因素。許多學(xué)者都認(rèn)為,影響海洋無脊椎動物生殖和發(fā)育的最重要因子是溫度。雙殼貝類棲息環(huán)境的水溫波動與其性腺發(fā)育有密切關(guān)系，如水溫對其呼吸、攝食、消化、排泄、運(yùn)動、生長、性腺發(fā)育與繁殖均產(chǎn)生重要作用。目前，人工控溫條件下的性腺發(fā)育和繁殖規(guī)律已經(jīng)在櫛孔扇貝(chlamysfarreri)、蝦夷扇貝(patinopectenyessoensis)、海灣扇貝(argopectenirradias)、華貴櫛孔扇貝(chlamysnobilis)、太平洋牡蠣(crassostreagigas)、菲律賓蛤仔(ruditapesphilippinarum)、紫貽貝(mytilusedulis)等雙殼貝類物種中得到開展。現(xiàn)階段，雙殼貝類性腺發(fā)育的研究主要通過肉眼解剖觀察,石蠟切片光鏡觀察等方法。上述方法雖然能夠從個體、組織和細(xì)胞水平等不同角度在不同程度上指示雙殼貝類的選種指標(biāo)，但是實(shí)驗(yàn)通量低、周期長，較難實(shí)現(xiàn)實(shí)時實(shí)地快速檢測。而且，個體、組織和細(xì)胞水平的檢測往往需要活體采樣，某種程度上會導(dǎo)致育種候選個體/群體損傷甚至死亡，無法很好的保證其活性作為后續(xù)育種和傳代的親本，尤其是對于親貝數(shù)量較少的種群或者瀕危雙殼貝類。因此，提供一種具有操作簡便、測定迅速、活體無損傷檢測、實(shí)時實(shí)地監(jiān)測雙殼貝類積溫促熟最佳溫度的方法就成為雙殼貝類育種的研究熱點(diǎn)之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是建立一種基于心電參數(shù)確定雙殼貝類積溫促熟最佳溫度的方法，利用雙殼貝類心電波幅作為指標(biāo)對其進(jìn)行快速準(zhǔn)確的積溫促熟最佳溫度的確定。本發(fā)明在不傷害育種參考個體/群體生物活性的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)心電參數(shù)指標(biāo)的快速無損傷檢測，解決現(xiàn)階段海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)雙殼貝類人工育苗生產(chǎn)過程中缺少快速、準(zhǔn)確、高效、活體測定性腺積溫促熟最佳溫度的問題。本發(fā)明首先提供雙殼貝類心電波幅強(qiáng)度heartamplitude(ha)作為檢測雙殼貝類積溫促熟最佳溫度的指標(biāo)的應(yīng)用；本發(fā)明再一個方面提供一種確定雙殼貝類積溫促熟最佳溫度的方法，是通過心電波幅強(qiáng)度來確定的；所述的方法，包括如下的步驟：1)將infraredsensors(cny-70)的紅外感端粘到待檢測的雙殼貝類實(shí)驗(yàn)個體的殼外靠近心臟的位置；所述的雙殼貝類殼外靠近心臟的位置，為雙殼貝類殼外背部圍心腔；作為優(yōu)選，所述的雙殼貝類實(shí)驗(yàn)個體的數(shù)目不少于20個；2)將待測雙殼貝類個體放到水體中，待外套膜觸須伸展之后，儀器連通進(jìn)行檢測；選擇實(shí)驗(yàn)雙殼貝類的適溫范圍，從低溫到高溫逐漸升溫，進(jìn)行不同溫度下的心電參數(shù)的測定；作為優(yōu)選，升溫速度設(shè)定為0.2℃/min，每個整數(shù)溫度點(diǎn)穩(wěn)定維持10分鐘；3)計算每個實(shí)驗(yàn)個體整數(shù)溫度下的心電波幅強(qiáng)度，運(yùn)用回歸分析待測個體在適溫范圍溫度變化過程中的最大心電波幅強(qiáng)度(maximumheartamplitude-mha)及其對應(yīng)的溫度(tmha)；對測定的實(shí)驗(yàn)個體的tmha進(jìn)行統(tǒng)計，tmha平均值(m)±標(biāo)準(zhǔn)誤(sem)即為該雙殼貝類物種的積溫促熟最佳溫度。所述的雙殼貝類，包含但不限于蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝；本發(fā)明還提供一種基于扇貝心跳指標(biāo)的快速選種的標(biāo)準(zhǔn)，所述的標(biāo)準(zhǔn)如下：蝦夷扇貝(patinopectenyessoensis)積溫促熟最佳溫度為8.55±0.14℃；櫛孔扇貝(chlamysfarreri)積溫促熟最佳溫度為15.08±0.02℃；海灣扇貝(argopectenirradians)積溫促熟最佳溫度為18.78±0.12℃。本發(fā)明對雙殼貝類進(jìn)行體外非侵入性無損傷的心電參數(shù)檢測，將獲得的心電波幅強(qiáng)度作為確定其積溫促熟最佳溫度的依據(jù)。本發(fā)明方法結(jié)合了紅外感應(yīng)技術(shù)、濾波技術(shù)、波形放大技術(shù)，能夠快速靈敏地檢測雙殼貝類的心電波形。與傳統(tǒng)方法相比，本方法具有非侵入性、無損傷性、可長期跟蹤等特點(diǎn)，首次將tmha作為雙殼貝類積溫促熟最佳溫度的指標(biāo)。采用本種方法能夠究為雙殼貝類人工育苗工作中的親貝積溫促熟及瀕危雙殼貝類的人工繁育提供研究基礎(chǔ)。附圖說明圖1、蝦夷扇貝心電波幅強(qiáng)度隨溫度變化曲線圖；圖2、櫛孔扇貝心電波幅強(qiáng)度隨溫度變化曲線圖；圖3、海灣扇貝心電波幅強(qiáng)度隨溫度變化曲線圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明將心電波幅指標(biāo)作為一個新興數(shù)量指標(biāo)，應(yīng)用于雙殼貝類的苗種生產(chǎn)中，為親貝數(shù)量較少的種群或者瀕危雙殼貝類的無損傷繁育提供理論參考和方法指導(dǎo)。本發(fā)明通過對溫度脅迫條件下雙殼貝類的心電參數(shù)進(jìn)行檢測，同時分析心電波幅隨溫度的變化趨勢，采用回歸分析確定相應(yīng)個體/群體的最大心電波幅及其對應(yīng)的溫度，建立一種基于心電參數(shù)確定雙殼貝類積溫促熟最佳溫度的方法，為養(yǎng)殖雙殼貝類積溫促熟溫度的確定提供可靠的技術(shù)手段。本發(fā)明方法的總體步驟如下：1、雙殼貝類心電波形檢測儀器的連接(1)infraredsensors(cny-70)的接口端以rj11連接方式接入heartbeatmonitoramplifier(amp-03)；(2)heartbeatmonitoramplifier(amp-03)和powerlab8/35八通道研究型高速記錄主機(jī)(含labchartpro專業(yè)版)兩端均以bnc連接方式相互連接；(3)powerlab8/35八通道研究型高速記錄主機(jī)(含labchartpro專業(yè)版)以usb連接方式接入電腦(安裝labcharbv7forwindows)。2、雙殼貝類心電波形檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化(1)將實(shí)驗(yàn)雙殼貝類外殼的附著生物清除干凈，放在實(shí)驗(yàn)條件下5-7天使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境；(2)將infraredsensors(cny-70)的紅外感端用blu-tag型膠(藍(lán)丁膠)粘到實(shí)驗(yàn)雙殼貝類殼外靠近心臟的位置(背部圍心腔中)；(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，檢測之前10分鐘，將待測雙殼貝類個體放到充氣的5l的實(shí)驗(yàn)水體環(huán)境中，待外套膜觸須充分伸展之后，儀器連通進(jìn)行檢測。選擇實(shí)驗(yàn)雙殼貝類適溫范圍，從低溫到高溫逐漸升溫，升溫速度設(shè)定為0.2℃/min，每個整數(shù)溫度點(diǎn)穩(wěn)定維持10分鐘進(jìn)行該溫度下心電參數(shù)的測定。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)個體仍然放回實(shí)驗(yàn)前的水體環(huán)境中。3、數(shù)據(jù)分析(1)計算每只實(shí)驗(yàn)個體每個整數(shù)溫度下的心電波幅強(qiáng)度-ha，運(yùn)用回歸分析待測個體在室溫范圍溫度變化過程中的最大心電波幅強(qiáng)度mha及其對應(yīng)的溫度tmha；將每個個體按上述步驟重復(fù)三次或以上，作為此條件下該個體的積溫促熟最佳溫度tmsii；(2)對測定物種n個個體的tmha進(jìn)行統(tǒng)計，tmha平均值(m)±標(biāo)準(zhǔn)誤(sem)即為該雙殼貝類物種的積溫促熟最佳溫度。下面以心電波幅強(qiáng)度為指標(biāo)評價，對適溫范圍內(nèi)的蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝進(jìn)行積溫促熟最佳溫度確定的方法為例詳細(xì)敘述本發(fā)明的方法。實(shí)施例11、扇貝心電波形檢測儀器的連接：(1)infraredsensors(cny-70)的接口端以rj11連接方式接入heartbeatmonitoramplifer(amp-03)；(2)heartbeatmonitoramplifer(amp-03)和powerlab8/35八通道研究型高速記錄主機(jī)(含labchartpro專業(yè)版)兩端均以bnc接口相互連接；(3)powerlab8/35八通道研究型高速記錄主機(jī)(含labchartpro專業(yè)版)以以usb連接方式接入電腦(安裝labcharbv7forwindows)。2、扇貝心電波形檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化：(1)將實(shí)驗(yàn)扇貝外殼的附著生物清除干凈，放在實(shí)驗(yàn)條件下暫養(yǎng)5-7天，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境；(2)將infraredsensors(cny-70)的紅外感端用blu-tag型膠(藍(lán)丁膠)粘到扇貝殼外靠近心臟的位置(背部圍心腔中)；(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，檢測之前10分鐘，將待測雙殼貝類個體放到充氣的5l的實(shí)驗(yàn)水體環(huán)境中，待外套膜觸須充分伸展之后，儀器連通進(jìn)行檢測。選擇所選實(shí)驗(yàn)雙殼貝類適溫范圍(蝦夷扇貝1-31℃；櫛孔扇貝1-37℃；海灣扇貝10-37℃)，從低溫到高溫逐漸升溫，升溫速度設(shè)定為0.2℃/min，整數(shù)溫度點(diǎn)穩(wěn)定維持10分鐘進(jìn)行該溫度下的心電參數(shù)的測定，實(shí)驗(yàn)扇貝保證不少于6個個體的重復(fù)樣。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)個體仍然放回實(shí)驗(yàn)前的水體環(huán)境中。3、數(shù)據(jù)分析(1)計算每個實(shí)驗(yàn)扇貝個體整數(shù)溫度下的心電波幅強(qiáng)度-ha，運(yùn)用回歸分析待測個體在室溫范圍溫度變化過程中的最大心電波形強(qiáng)度mha及其對應(yīng)的溫度tmha；將每個個體按上述步驟重復(fù)三次或以上，作為此條件下此個體的積溫促熟最佳溫度tmhai；(2)對測定物種n個個體的tmha進(jìn)行統(tǒng)計，tmha平均值(m)±標(biāo)準(zhǔn)誤(sem)即為該雙殼貝類物種的積溫促熟最佳溫度。蝦夷扇貝為冷水貝，1-31℃溫度變化過程中，其mha為1.654±0.027v，對應(yīng)的溫度tmha-蝦夷為8.55±0.14℃(圖1)；櫛孔扇貝為溫水貝，1-37℃溫度變化過程中，其mha為1.903±0.014v，對應(yīng)的溫度tmha-櫛孔為15.08±0.02℃(圖2)；海灣扇貝為溫水貝，10-37℃溫度變化過程中，其mha為1.622±0.026v，對應(yīng)的溫度tmha-海灣為18.78±0.12℃(圖3)；不同生活習(xí)性的三種扇貝的tmha-蝦夷<tmha-櫛孔<tmha-海灣，而且與對應(yīng)物種實(shí)際生產(chǎn)過程中經(jīng)驗(yàn)值較為吻合，驗(yàn)證了tmha作為指示雙殼貝類物種的積溫促熟最佳溫度的準(zhǔn)確性(表1)。表1依據(jù)心電波幅測定不同扇貝物種的積溫促熟最佳溫度tmsi和實(shí)際生產(chǎn)過程中經(jīng)驗(yàn)值t(表1)扇貝物種tmsit蝦夷扇貝8.55±0.14℃8-9℃櫛孔扇貝15.08±0.02℃15-16℃海灣扇貝18.78±0.12℃18-20℃應(yīng)用本發(fā)明方法，選取二齡蝦夷扇貝個體(n＝180，取自大連市長?？h獐子島海區(qū))、二齡櫛孔扇貝個體(n＝180，取自青島市嶗山區(qū)沙子口海區(qū))和一齡蝦夷海灣個體(n＝180，取自青島市黃島開發(fā)區(qū)膠南海區(qū))隨機(jī)分為兩組(n＝90)，每組分為三個平行樣(n＝30)。分別按照本發(fā)明測定的tmha溫度(實(shí)驗(yàn)組)和經(jīng)驗(yàn)值(對照組)的溫度進(jìn)行親貝的積溫促熟。實(shí)驗(yàn)過程中除了水溫差異外，其他積溫促熟條件(餌料、換水、充氣等)保持一致。做好標(biāo)記后車間暫養(yǎng)，跟蹤統(tǒng)計性腺指數(shù)、產(chǎn)卵量、受精率、孵化率和變態(tài)率(表2)，驗(yàn)證本發(fā)明方法在育種工作中的應(yīng)用。結(jié)果顯示，每種扇貝實(shí)驗(yàn)組和對照組各45個個體，實(shí)驗(yàn)組(tmha)的性腺指數(shù)和產(chǎn)卵量均顯著高于對照組(經(jīng)驗(yàn)值)(one-wayanova，p<0.05)；受精率和孵化率，實(shí)驗(yàn)組(tmha)的略微高于對照組(經(jīng)驗(yàn)值)，但無顯著性差異(one-wayanova，p>0.05)；育苗過程中最重要指標(biāo)之一的變態(tài)率，實(shí)驗(yàn)組(tmha)極顯著高于對照組(經(jīng)驗(yàn)值)(one-wayanova，p<0.01)。通過整個苗期生產(chǎn)的對比，實(shí)驗(yàn)組(tsim)的蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝的苗種數(shù)量的增產(chǎn)率對照組(經(jīng)驗(yàn)值)分別提高48.97％，45.03％和61.51％。結(jié)果表明本發(fā)明的檢測標(biāo)準(zhǔn)可以有效的確定扇貝積溫促熟最佳溫度，從而為扇貝的人工育苗和科研提供翔實(shí)和有效的實(shí)驗(yàn)方法，為我國雙殼貝類的高質(zhì)健康養(yǎng)殖提供技術(shù)支撐。當(dāng)前第1頁12