本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，具體涉及一種控制太白貝母組織培養(yǎng)過程中內生菌污染的方法。
背景技術：
：《中華人民共和國藥典》收載的川貝母為百合科植物川貝母fritillariacirrhosad.don、暗紫貝母fritillariaunibracteatahsiaoetk.c.hsia、甘肅貝母fritillariaprzewalskiimaxim.梭砂貝母fritillariadelavayifranch.太白貝母fritillariataipaiensisp.y.li或瓦布貝母fritillariaunibracteatahsiaoetk.c.hsiavarwabuensis(y.tangets.c.yue)z.d.liu,s.c.chen的干燥鱗莖。是名貴川產(chǎn)道地大宗藥材之一，主要用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血等病癥，臨床需求量巨大。太白貝母作為新增來源列入2010版《中國藥典》，具有野生資源少、適應性強、低海拔也能正常生長發(fā)育等特性，是川貝母中適宜家種栽培的最佳品種。太白貝母種植業(yè)迎來了新的發(fā)展機遇。而現(xiàn)有川貝母產(chǎn)量嚴重不足，需求量卻逐年增加，存在嚴重的供求矛盾。其藥材來源中有4種已列入國家三級保護植物名錄且栽種困難。在其生長期內生物量積累緩慢、植株死亡率高，從而導致經(jīng)濟效益低下，農(nóng)民種植積極性不高，這一直是制約川貝種植發(fā)展的瓶頸。在《中國中藥雜志》1996年01期中收載了《太白貝母的快速繁殖試驗》，文中報道了太白貝母組織培養(yǎng)快速繁殖試驗。研究表明：采用ms+naa1.0mg/l+6～ba3.0mg/l培養(yǎng)基，誘導愈傷組織和再生鱗莖的頻率為93％；愈傷組織和再生鱗莖中含有15種人體必需的常量和微量元素，其中大多數(shù)元素的含量均明顯超過栽培鱗莖。但在現(xiàn)有技術中通過此方法培育得到的鱗莖在培育過程中感染內生菌的幾率非常大，能順利進行轉代繼續(xù)培養(yǎng)的比例低。因此，對控制太白貝母組培內生菌的污染非常關鍵。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌的污染率高的控制方法。本發(fā)明太白貝母組織培養(yǎng)過程中內生菌的控制方法，包括如下步驟：s1、外植體選擇及預處理：以3～4月挖取的太白貝母新鮮鱗莖為外植體，去掉外層腐爛、褐化的鱗片，切除根系；洗凈鱗莖表面，洗衣粉溶液中浸泡4～6min，擦拭鱗莖表面，流水沖洗0.8～1.2h，再用去離子水沖洗4～6次，濾紙吸干，備用；s2、外植體消毒處理：將s1處理后的外植體，浸沒在濃度為0.08～0.12％的氯化汞溶液中，攪拌，于超凈工作臺中，漂洗，干燥，備用；s3、小鱗莖誘導分化：將s2得到的無菌外植體，用滅過菌的鑷子將其鱗片掰開，再用無菌刀片縱切鱗片得2～4mm寬的條狀小塊，將小塊接種于添加了青霉素和多菌靈的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；s4、小鱗莖繼代培養(yǎng)：將s3步驟的誘導分化培養(yǎng)的小鱗莖在相同培養(yǎng)基上，每20天繼代培養(yǎng)一次，共繼代培養(yǎng)3次；s5、小鱗莖增殖培養(yǎng)：將s4得到的生長旺盛的健康小鱗莖，轉移至不添加任何滅菌劑的培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)85～95d。上述控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染的方法，其中s1步驟中所述洗衣粉溶液是由洗衣粉與水按照重量體積比0.8～1.2g:1000ml配置而成。進一步的，上述控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染的方法，其中s1步驟中所述洗衣粉溶液是由洗衣粉與水按照重量體積比1.0g:1000ml配置而成。上述控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染的方法，其中所述s2步驟中攪拌采用磁力攪拌器攪拌，攪拌時間為6～8min，攪拌速度為150～200r/min。上述控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染的方法，其中所述s2步驟中漂洗為用無菌水漂洗3～5次，每次漂洗時間為3～5min；干燥為用無菌濾紙吸干。上述控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染的方法，其中所述s3步驟中培養(yǎng)溫度為18～22℃，相對濕度為75～85％，光照強度為1000～1500lx，光照時間為11～13h。進一步的，上述控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染的方法，其中所述s3步驟中培養(yǎng)溫度為20℃，相對濕度為80％，光照強度為1000～1500lx，光照時間為12h。上述控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染的方法，其中所述培養(yǎng)基的ph值為5.6～5.8；是由ms培養(yǎng)基+3.0～5.0mg/l的6-芐氨基腺嘌呤+0.8～1.2mg/l的α-萘乙酸+4.0～6.0mg/l的青霉素+0.8～1.2g/l的多菌靈+3％蔗糖+9g/l瓊脂組成。進一步的，上述控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染的方法，其中所述誘導培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基+4.0mg/l的6-芐氨基腺嘌呤+1.0mg/l的萘乙酸+5.0mg/l的青霉素+1.0g/l的多菌靈+3％蔗糖+9g/l瓊脂組成。上述控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染的方法，其中s5步驟中所述培養(yǎng)基是由ms基本培養(yǎng)基+3.0～5.0mg/l的6-芐氨基腺嘌呤+0.8～1.2mg/l的萘乙酸+3％蔗糖+9g/l瓊脂組成。本發(fā)明的有益效果是：1、控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染，污染控制率達到96.5％，外植體使用量減少，降低生產(chǎn)成本；2、控制太白貝母組織培養(yǎng)內生菌污染，直接誘導形成小鱗莖多，對農(nóng)戶、企業(yè)生產(chǎn)種植種源緊缺有重大意義；3、污染率得到控制，鱗莖繁殖生長快，為市場提供大量鱗莖藥材，緩解供需矛盾。具體實施方式下面結合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。實施例11、外植體選擇及預處理：采挖3～4月的太白貝母新鮮鱗莖作外植體，去掉外層腐爛、褐化的鱗片，切除根系；洗凈鱗莖表面泥土，在濃度為1g/l的洗衣粉溶液中浸泡5min，用刷子輕輕刷洗表面后流水沖洗1h，再用無菌去離子水沖洗5次,濾紙吸干，備用；2、外植體消毒處理：將處理后的外植體置入廣口瓶中，常溫下，倒入濃度0.1％的氯化汞溶液至淹沒外植體。用磁力攪拌器低速攪拌外植體6～8min，75％酒精擦拭廣口瓶表面后放入超凈工作臺中，無菌條件下，用無菌水漂洗鱗莖3～5次，每次3～5min，最后用滅菌濾紙吸干，備用；3、小鱗莖的誘導分化：無菌條件下，用鑷子將太白貝母鱗片掰開，用無菌刀片將肉質鱗片縱向切成約3mm寬的小塊，接種于小鱗莖誘導培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為：ms基本培養(yǎng)基+6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)4.0mg/l+naa(α-萘乙酸)1.0mg/l+青霉素5.0mg/l+多菌靈1.0g/l+蔗糖3％+9g/l瓊脂1.0％，ph為5.6～5.8。接種后，置于溫度20℃，相對濕度80％，光照12h，強度為1000～1500lx條件下進行培養(yǎng)；4、繼代培養(yǎng)：在相同培養(yǎng)基上，對誘導分化后的小鱗莖進行每20天繼代培養(yǎng)一次，共繼代培養(yǎng)3次；5、小鱗莖增殖培養(yǎng)：將老化的和生長不良的鱗莖去掉，選擇生長旺盛的健康的小鱗莖,切下，去掉基部殘留物，轉移到培養(yǎng)基ms+6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)4.0mg/l+naa(α-萘乙酸)1.0mg/l+蔗糖3％+9g/l瓊脂1.0％，ph為5.6～5.8進行繼代增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)90d后統(tǒng)計小鱗莖成活率。為了減少太白貝母鱗莖組培過程中內生菌污染，提高鱗莖的增殖率和成活率。試驗設計在培養(yǎng)基ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l中添加多菌靈和青霉素兩種滅菌劑，對其內生菌污染進行控制。濃度見表1。二因素完全隨機，各處理見表2。以培養(yǎng)基：ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l為對照。無菌條件下，用無菌刀片將肉質鱗片縱向切成約3mm寬的小塊，接種于各處理培養(yǎng)基中，5重復/處理，5瓶/重復，3塊鱗莖/瓶。其他條件一致。7d內如有污染鱗片直接去除，不統(tǒng)計。7d后，每天監(jiān)測內生菌污染情況，如污染，即時轉移未污染的鱗片，污染鱗片繼續(xù)觀察。并觀察記錄小鱗莖誘導分化情況。60d統(tǒng)計內生菌污染率。表1試驗因素和濃度表2控制太白貝母鱗莖組培過程中內生菌生長的各處理培養(yǎng)基處理培養(yǎng)基1ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l+青霉素5.0mg/l+多菌靈0.5g/l2ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l+青霉素5.0mg/l+多菌靈1.0g/l3ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l+青霉素5.0mg/l+多菌靈1.5g/l4ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l+青霉素10.0mg/l+多菌靈0.5g/l5ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l+青霉素10.0mg/l+多菌靈1.0g/l6ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l+青霉素10.0mg/l+多菌靈1.5g/l7ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l+青霉素20.0mg/l+多菌靈0.5g/l8ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l+青霉素20.0mg/l+多菌靈1.0g/l9ms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l+青霉素20.0mg/l+多菌靈1.5g/lckms+6-ba4.0mg/l+naa1.0mg/l表3太白貝母鱗莖組培內生菌污染調查表注：結果：1、沒添加青霉素和多菌靈的培養(yǎng)基(ck)，內生菌污染嚴重，污染率達72.3％；2、青霉素和多菌靈濃度過低(處理1)，污染率較高(23.2％)，分化形成小鱗莖，后期生長較好；3、隨青霉素和多菌靈濃度增高，內生菌污染降低，但鱗片不分化沒有誘導出小鱗莖。綜合比較，處理2青霉素和多菌靈濃度配比最合適，污染率低(2.5％)，鱗片分化形成的小鱗莖多，且生長旺盛。與對照相比，內生菌污染控制率達到96.5％。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應在本發(fā)明所附權利要求的保護范圍內。當前第1頁12