本發(fā)明涉及一種組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，尤其是指嘉定白蒜組培鱗莖快繁方法。

背景技術(shù)：

大蒜曾經(jīng)是我國出口歷史長、出口量大的重要農(nóng)產(chǎn)品。其中，嘉定白蒜聞名遐邇，其在國內(nèi)乃至東南亞市場以其色澤白、蒜頭肥大、肉質(zhì)脆嫩、辛辣味濃、耐久儲存等獨有的特點，曾為當?shù)剞r(nóng)民的增產(chǎn)創(chuàng)收發(fā)揮重要作用。大蒜是百合科蔥屬的一種無性繁殖作物，生產(chǎn)栽培主要用鱗莖作為繁殖材料。這不僅繁殖系數(shù)低，而且繁殖器官也是產(chǎn)品器官，栽培成本高。而且病毒等病原物極易通過種蒜積累和傳播，對大蒜生產(chǎn)構(gòu)成嚴重威脅。近二十年來由于多種因素的制約，大蒜的種子和出口每況愈下。其中除種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，農(nóng)民種植效益驅(qū)動外，品種退化，蒜頭質(zhì)量下降，符合出口標準的蒜頭比例低是根本原因。隨著大蒜種植面積集中，受連作種植留種因素影響，大蒜感染病毒呈現(xiàn)逐代積累趨勢，造成品種急劇退化。顯然傳統(tǒng)留種方式在當前土地資源緊缺的條件下已不足以抵御病毒病危害和持續(xù)發(fā)揮大蒜的品種優(yōu)勢，采用現(xiàn)代生物技術(shù)回復(fù)和改良大蒜的種性刻不容緩。

中國專利公開號cn1238122a公開了一種大蒜脫毒組培苗的培養(yǎng)基，是以b5、ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基輔以高濃度6ba、naa以及ph值5.6-6.0等因素，研究適合玉林大蒜的組培培養(yǎng),其中只涉及出芽數(shù)和出芽率的實驗統(tǒng)計，并未涉及大蒜鱗莖快繁研究。而大蒜組培苗的移栽成活率是大蒜脫毒苗工廠化生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵，組培苗移栽成活率不足40%，但我們培養(yǎng)的組培脫毒鱗莖球移栽成活率高達95%以上，發(fā)明重點在脫毒大蒜組培快繁鱗莖技術(shù)的生產(chǎn)應(yīng)用。中國專利申請?zhí)?5116060.5公開了利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)無病毒種蒜的方法。該方法采用ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基，鱗莖形成要求在4℃溫度下無菌預(yù)處理2個月，制冷成本高，生產(chǎn)操作指導(dǎo)性不強。本發(fā)明重點在ms改良后大量元素、鈣鹽等減量控制、在溫度18-20℃的適宜環(huán)境下，節(jié)約成本、實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：提供一種嘉定白蒜組培鱗莖快繁方法，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對嘉定白蒜進行工廠化離體快繁。

本發(fā)明的再一目的是：提供一種適合嘉定白蒜的培養(yǎng)基。

本發(fā)明目的通過下述方案實現(xiàn)：一種嘉定白蒜組培鱗莖快繁方法，包括：外植體消毒、脫毒無菌苗的建立、試管苗的繁殖、生根培養(yǎng)和移栽，其中：采用鱗莖生根培養(yǎng)，所述的鱗莖生根培養(yǎng)是將試管苗單株按株高3-4cm、莖粗0.2-0.4cm的標準，切除枯萎黃化老葉，轉(zhuǎn)接到鱗莖生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度16℃-22℃，光照強度500-800lux，濕度50%-60%，培養(yǎng)50天至植株葉片部分完全枯萎，得到組培脫毒鱗莖，其球鱗莖內(nèi)部葉片組織消失，鱗莖球長實，大小0.6-0.8cm，形成肉質(zhì)大蒜，根長4-6cm；所述的鱗莖生根培養(yǎng)基（jd-3）為ms+附加6-ba0-1.0mg/l、kt0-0.2mg/l、zt0-0.05mg/l、naa0-0.2mg/l、白砂糖100g/l+瓊脂5.0g/l。

在上述方案基礎(chǔ)上，jd-3為改良ms培養(yǎng)基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,煙酸0.025-0.05mg/l，鹽酸硫胺素0.005-0.01mg/l，鹽酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、kt0-0.2mg/l、zt0-0.05mg/l、naa0-0.2mg/l、白砂糖100g/l+瓊脂5.0g/l，ph值調(diào)至6.5-7.0。

在上述方案基礎(chǔ)上，所述外植體消毒是把大蒜鱗莖剝?nèi)ゴ笏馄?，用自來水沖洗干凈，再用75%酒精消毒60秒左右，倒出酒精后用無菌水沖洗2-3次，然后再用20%的次氯酸鈉溶液消毒10-20min，最后用無菌水沖洗4-5次，完成外植體消毒。

在上述方案基礎(chǔ)上，所述的脫毒無菌苗的建立是把消毒好的大蒜外植體，將大蒜蒜瓣切去上半部分，剝?nèi)ハ掳氩糠滞鈬拇笏馊赓|(zhì)組織，露出蒜心中部的蒜芽，其帶底盤高度為1.5-2cm，將蒜芽外層包裹的蒜葉一層一層剝除，在解剖鏡下剝生長點，切取0.2mm左右大小的微莖尖，接種在脫毒無菌苗培養(yǎng)基（jd-1）上培養(yǎng)，經(jīng)暗培養(yǎng)5-7天后轉(zhuǎn)光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23-25℃，光照強度1000-2000lux，光照時間14-16小時/天，微莖尖經(jīng)過60天的上述培養(yǎng)獲得脫毒組培苗，培養(yǎng)成活率不小于70%，所述的脫毒無菌苗培養(yǎng)基作為啟動培養(yǎng)基，由ms+6-ba0-1.0mg/l+白砂糖30g/l+瓊脂5.0g/l組成；

在上述方案基礎(chǔ)上，jd-1為改良ms培養(yǎng)基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,煙酸0.025-0.05mg/l，鹽酸硫胺素0.005-0.01mg/l，鹽酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、白砂糖30g/l+瓊脂5.0g/l，ph值調(diào)至6.5-7.0。

所述的試管苗的繁殖是將上述脫毒組培苗按1-2cm株高的單株方式切割接種在試管苗培養(yǎng)基（jd-2）上，以芽繁芽的腋芽繁殖方式進行繼代分化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23-25度，光照強度2000-3000lux，濕度50%-60%，光照時間14-16小時每天培養(yǎng)28天，增殖比例在2.5-3.5之間，得單株，所述的試管苗培養(yǎng)基為：ms+附加6-ba0-1.0mg/l、矮壯素0-0.5mg/l、iba0.02mg/l、白砂糖30g/l+瓊脂5.0g/l；

在上述方案基礎(chǔ)上，jd-2是改良ms培養(yǎng)基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,煙酸0.025-0.05mg/l，鹽酸硫胺素0.005-0.01mg/l，鹽酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、矮壯素0-0.5mg/l、iba0.02mg/l、白砂糖30g/l+瓊脂5.0g/l，ph值調(diào)至6.5-7.0。

所述的移栽采用低溫預(yù)處理移栽，將在鱗莖生根培養(yǎng)基（jd-3）上培養(yǎng)50天形成的組培脫毒鱗莖球出瓶，進行清洗，保存在4-10℃低溫下處理4-6周時間，可移栽到50孔穴盤上進行育苗。

所述的育苗基質(zhì)采用輕基質(zhì)混合有機肥，混合比例9:1，出苗成活率達95%以上。

本發(fā)明的優(yōu)越性在于：本發(fā)明通過大蒜鱗莖莖尖培養(yǎng)可有效脫去大蒜體內(nèi)的病毒，再對脫毒大蒜進行組織培養(yǎng)，可快速繁殖組培鱗莖，實現(xiàn)工廠化規(guī)模育苗，在保持嘉定白蒜優(yōu)良遺傳特性的同時，有效抵御病毒危害，提高地方農(nóng)民種植積極性，以恢復(fù)我國大蒜國際市場競爭地位。出苗成活率可達95%以上。

附圖說明

附圖1，為外植體蒜芽高度約1.5-2cm（帶底盤）照片；

附圖2，為切取0.2mm左右大小的微莖尖照片；

附圖3，啟動培養(yǎng)60天獲得脫毒組培苗；

附圖4，快繁培養(yǎng)28天；

附圖5，單株培養(yǎng)鱗莖；

附圖6，鱗莖內(nèi)部仍清晰可見葉片組織；

圖7，鱗莖內(nèi)部葉片組織消失，鱗莖球長實。

附圖8，培養(yǎng)50天鱗莖形成可移栽。

具體實施方式

一種嘉定白蒜組培鱗莖快繁方法，包括：外植體消毒、脫毒無菌苗的建立、試管苗的繁殖、生根培養(yǎng)和移栽，其中：

所述外植體消毒是把大蒜鱗莖剝?nèi)ゴ笏馄ぃ米詠硭疀_洗干凈，再用75%酒精消毒60秒左右，倒出酒精后用無菌水沖洗2~3次，然后再用20%的次錄酸鈉溶液消毒10-20min，最后用無菌水沖洗4~5次，外植體消毒完畢。

脫毒無菌苗的建立是把消毒好的大蒜外植體，將大蒜蒜瓣切去上半部分，剝?nèi)ハ掳氩糠滞鈬拇笏馊赓|(zhì)組織，露出蒜心中部的蒜芽高度約1.5~2cm（帶底盤），如圖1所示，將蒜芽外層包裹的蒜葉一層一層剝除，在解剖鏡下剝生長點，切取0.2mm左右大小的微莖尖（如圖2所示），接種在jd1上培養(yǎng)，經(jīng)暗培養(yǎng)5~7天后轉(zhuǎn)光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23~25度，光照強度1000~2000lux，光照時間14~16小時每天。微莖尖經(jīng)過60天的上述培養(yǎng)獲得脫毒組培苗（如圖3所示），培養(yǎng)成活率達70%以上。

jd-1是改良ms培養(yǎng)基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,煙酸0.025-0.05mg/l，鹽酸硫胺素0.005-0.01mg/l，鹽酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、白砂糖30g/l+瓊脂5.0g/l，ph值調(diào)至6.5~7.0。

試管苗的繁殖是將在啟動培養(yǎng)jd1培養(yǎng)基上生長出的脫毒組培苗，按1~2cm株高的單株方式切割接種在由ms改良的擴繁培養(yǎng)基jd-2上，以芽繁芽的腋芽繁殖方式進行繼代分化培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度23~25度，光照強度2000~3000lux，濕度50%~60%，光照時間14~16小時每天培養(yǎng)28天（如圖4），增殖比例在2.5~3.5之間。

jd-2是改良ms培養(yǎng)基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,煙酸0.025-0.05mg/l，鹽酸硫胺素0.005-0.01mg/l，鹽酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、矮壯素0~0.5mg/l、iba0.02mg/l、白砂糖30g/l+瓊脂5.0g/l，ph值調(diào)至6.5~7.0。

試管鱗莖生根培養(yǎng)是將在jd-2上培養(yǎng)產(chǎn)生的單株，按株高達到3~4cm，莖粗0.2~0.4cm的標準，切除枯萎黃化老葉，轉(zhuǎn)接到j(luò)d-3培養(yǎng)基上（如圖5），培養(yǎng)溫度16℃~22℃，光照強度500~800lux，濕度50%~60%，培養(yǎng)14天，莖基本開始膨大，外觀可見直徑0.3~0.5cm大小的鱗莖，根原基形成；培養(yǎng)35天，植株葉片部分開始枯萎，營養(yǎng)向基部輸送，鱗莖球膨大至0.5~0.7cm，鱗莖內(nèi)部仍清晰可見葉片組織（如圖6），單株生根3~5根，根長2-4cm；培養(yǎng)50天左右植株葉片部分完全枯萎，鱗莖內(nèi)部葉片組織消失，鱗莖球長實（如圖7），大小0.6~0.8cm，形成肉質(zhì)大蒜，滿足組培鱗莖移栽要求（如圖8）。

jd-3培養(yǎng)基，改良ms培養(yǎng)基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,煙酸0.025-0.05mg/l，鹽酸硫胺素0.005-0.01mg/l，鹽酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、kt0~0.2mg/l、zt0~0.05mg/l、naa0~0.2mg/l、白砂糖100g/l+瓊脂5.0g/l，ph值調(diào)至6.5~7.0。

低溫預(yù)處理移栽，將jd-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)50天形成的組培脫毒鱗莖球出瓶，進行清洗。保存在4~10℃低溫下處理4~6周時間，可移栽到50孔穴盤上進行育苗，育苗基質(zhì)采用輕基質(zhì)混合有機肥混合比例9:1。

本實施例中，輕基質(zhì)由泥炭、珍珠巖、蛭石、椰糠按質(zhì)量比6~9:0~2:0~1:0~1混合；有機肥由豬糞、羊糞按比6~9:1~3混合，出苗成活率達95%以上。