本發(fā)明屬于魚類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種大菱鲆超雌親魚的制種方法。
背景技術(shù)：
作為我國北方重要的養(yǎng)殖魚類，大菱鲆(scophthalmusmaximus)雌雄生長差異顯著，養(yǎng)殖24個月雌魚體重是雄魚的1.8倍(imslandetal.,1997，aquacultureresearch,28:101–114)，養(yǎng)殖全雌苗種成為提高大菱鲆養(yǎng)殖效率的一種重要技術(shù)手段而廣受關(guān)注。
根據(jù)推測，大菱鲆的性別決定機(jī)制為雌性異配的zw型，生產(chǎn)全雌苗種可供選擇的方法包括3種：(1)人工挑選雌性苗種；(2)性別分化期間采用雌激素處理誘導(dǎo)表型全雌的苗種；(3)制備超雌魚親魚(ww雌魚)，利用超雌魚與普通zz雄魚交配，生產(chǎn)基因型和表型都是雌性的全雌苗種。采用人工挑選雌性苗種的方法，需要淘汰一半左右的雄性苗種，會顯著增加苗種生產(chǎn)成本，另外，大菱鲆外表無雌雄差異性特征，性別特異的分子標(biāo)記成本高、準(zhǔn)確率低，也無法大規(guī)模采用，因此人工挑選的方法不可取。雌性激素直接誘導(dǎo)的方法有污染環(huán)境和影響食品安全的可能性，已被許多國家禁用；而制備超雌親魚，利用超雌親魚與普通雄魚交配生產(chǎn)全雌苗種的方法，可以避免上述兩種方法的缺點(diǎn)，成為實現(xiàn)大菱鲆全雌苗種商業(yè)化生產(chǎn)的最佳途徑之一。
迄今為止，對zw型性別遺傳決定的魚類研究較少，ww型超雌魚本身不是一個自然存在的基因型，具備這種人為誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因型魚類是否可以正常發(fā)育和成熟尚未見報道。有關(guān)大菱鲆超雌親魚的制備，baroiller和d'cotta2016年(sexdev10:242-266,2016)提出一條通過激素誘導(dǎo)和測交篩選相結(jié)合的大菱鲆超雌親魚制種技術(shù)路線，也因為制種周期長和成本高，至今還沒有得到完整實施。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明公布了一種制備大菱鲆超雌親魚的方法，以解決目前不能利用超雌魚進(jìn)行全雌苗種生產(chǎn)的難題。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
一種大菱鲆超雌親魚的制種方法，它的步驟如下：(1)采用遺傳失活魚類異源精子誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育的方法獲得大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育卵；(2)對所獲有絲分裂雌核發(fā)育卵進(jìn)行孵化和苗種培育，得到有絲分裂雌核發(fā)育苗種；(3)將所獲得的有絲分裂雌核發(fā)育苗種養(yǎng)殖成為有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚；(4)對有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚進(jìn)行促熟培育和產(chǎn)卵調(diào)控，能夠正常成熟和采卵的雌魚即為超雌親魚，挑選出來直接用于大菱鲆全雌苗種的商業(yè)化生產(chǎn)；
步驟(1)所述遺傳失活魚類異源精子選擇的標(biāo)準(zhǔn)：1)遺傳失活魚類異源精子與大菱鲆卵人工授精的受精率高于70％，以保證有較高的誘導(dǎo)效率；2)雜種仔魚不能成活，保證即使精子的遺傳失活處理失敗，所形成的雜種胚胎也不能培育出苗種，以節(jié)省后續(xù)苗種篩選工序。
進(jìn)一步，步驟(1)所述的遺傳失活魚類異源精子為真鯛冷凍精子。
進(jìn)一步，步驟(1)中遺傳失活魚類異源精子與大菱鲆卵子受精后85-90min，將受精卵置于靜水壓機(jī)的壓力艙中，在75mpa壓力強(qiáng)度下進(jìn)行休克處理，持續(xù)處理6min后泄壓，取出受精卵，置于孵化器中繼續(xù)孵化；壓力處理過程中海水溫度14.5±0.5℃。
進(jìn)一步，步驟(2)所述的苗種培育，在大菱鲆苗種全長20-50mm期間，培育水溫嚴(yán)格控制在18±0.5℃，以抑制ww苗種表型雄性化。
進(jìn)一步，步驟(3)中有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚培育方法為大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育苗種全長達(dá)到100mm后，逐尾采用pit和熒光雙重標(biāo)記后，與普通健康苗種同池混養(yǎng)。上述有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚生長速度慢，人工養(yǎng)殖條件下，普通雌魚3齡就能達(dá)到性成熟，而有絲分裂雌核發(fā)育雌魚成熟年齡比普通雌魚晚1年，至少需要達(dá)到4齡才能達(dá)到性成熟。
進(jìn)一步，步驟(4)所述對有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚進(jìn)行促熟培育和產(chǎn)卵調(diào)控，具體方法為雌核發(fā)育后備親魚年齡達(dá)到4齡以后，預(yù)定產(chǎn)卵期前3個月，開始進(jìn)行促熟和產(chǎn)卵調(diào)控，控制條件為光照強(qiáng)度300-500lx，光照周期16h光照：8h黑暗，水溫13±0.5℃。經(jīng)過3個月的促熟和產(chǎn)卵調(diào)控培育，部分雌核發(fā)育雌魚達(dá)到性成熟，將發(fā)育成熟和可以產(chǎn)卵的雌魚挑選出來，就是超雌親魚，可以直接用于大菱鲆全雌苗種的商業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
(1)本發(fā)明證明大菱鲆ww超雌魚可以成活和繁殖。ww超雌魚不是一個自然存在的基因型，目前盡管對性別決定機(jī)制為雌性異配的zw型魚類研究比較少，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)個別擁有該類型性別決定機(jī)制的魚類，如半滑舌鰨，ww超雌魚苗種不能成活。本發(fā)明證明了大菱鲆ww超雌魚可以成活和繁殖，為利用超雌魚進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)大菱鲆全雌苗種奠定了基礎(chǔ)。
(2)本發(fā)明對有絲分裂雌核發(fā)育苗種與普通健康苗種進(jìn)行同池混養(yǎng)的方法，是因為嚴(yán)重近交，大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育苗種成活率低、體質(zhì)弱，單獨(dú)長期養(yǎng)殖，會因苗種數(shù)量較少，養(yǎng)殖水槽面積小了環(huán)境不穩(wěn)定，面積大了會因密度太小難于管理，標(biāo)記后與普通健康苗種混養(yǎng)，這樣既可以保證養(yǎng)殖環(huán)境的相對穩(wěn)定，同時又方便了投喂和換水等正常管理，可以提高雌核發(fā)育苗種的養(yǎng)殖成活率。
(3)baroiller和d'cotta2016年提出的通過激素誘導(dǎo)和測交篩選相結(jié)合的大菱鲆超雌親魚制備方案，包括兩代親魚培育和兩次測交篩選，從開始制種到獲得可以成熟繁殖的超雌親魚，時間至少需要8年時間(每代親魚培育需要4年時間：親魚成熟3年+測交篩選1年，2代親魚培育和測交合計8年)，工作量上制備10尾ww雌魚至少需要建立32個測交家系(2個zw/zz雄魚+30個zw/ww雌魚)。本發(fā)明提出的超雌魚制種技術(shù)，從相同的起點(diǎn)開始，只需4年時間，而且中間不需要任何激素誘導(dǎo)處理和測交驗證，制備周期縮短了50％以上，成本則只有前者的幾分之一至十幾分之一。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例操作流程圖。
具體實施方式
以下結(jié)合圖1具體說明大菱鲆超雌魚制種方法，具體按以下步驟實施，其中沒有交代的技術(shù)細(xì)節(jié)為本領(lǐng)域的普通技術(shù)常識。
實施例1
一種大菱鲆超雌親魚的制種方法，它包括如下步驟：(1)采用遺傳失活魚類異源精子誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育的方法獲得大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育卵；(2)對所獲有絲分裂雌核發(fā)育卵進(jìn)行孵化和苗種培育，得到有絲分裂雌核發(fā)育苗種；(3)將所獲得的有絲分裂雌核發(fā)育苗種養(yǎng)殖成為有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚；(4)對有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚進(jìn)行促熟培育和產(chǎn)卵調(diào)控，能夠正常成熟和采卵的雌魚即為超雌親魚，挑選出來直接用于大菱鲆全雌苗種的商業(yè)化生產(chǎn)；具體步驟如下：
(一)采用遺傳失活魚類異源精子誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育的方法獲得大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育卵。
(1)魚卵采集：人工養(yǎng)殖大菱鲆親魚經(jīng)過2個月左右的光溫調(diào)控促熟培育后，性腺開始發(fā)育成熟，采用人工擠卵的方法定期對排卵親魚進(jìn)行人工采卵，從獲得的卵子中選擇卵質(zhì)好、每尾單次排卵量超過250ml的卵，置于干燥潔凈的器皿內(nèi)，于14.5±0.5的室溫下避光保存?zhèn)溆谩?/p>
(2)真鯛冷凍精子遺傳失活處理：裝有真鯛冷凍精液的凍存管從液氮中取出后，采用快速水浴解凍(水溫37-40℃)，解凍過程中輕輕搖動冷存管，至冷存管中樣品溶解，取出。用4℃預(yù)冷的hank’s保護(hù)液將解凍后的精液稀釋至原始精液濃度的20倍(原始精液:保護(hù)液＝1:19)。取稀釋后的精液20μl置于干凈的載玻片上，用吸管滴加2滴海水，鏡檢精子活力，取同一視野下快速直線運(yùn)動精子比例高于70％的稀釋精液備用。將稀釋的真鯛精液平鋪在直徑12-15cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中(厚度0.4mm)，采用紫外交聯(lián)儀(型號scientz03-ⅱ，寧波新芝生物科技有限公司)進(jìn)行照射處理，照射劑量為7200erg·mm-2，照射后的精液迅速避光轉(zhuǎn)移至干燥潔凈的黑色玻璃杯中，鏡檢精子活力，并于4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)人工授精：滅活精液與卵子體積比按1:20-30比例混合均勻，添加精卵體積2倍體積的新鮮海水進(jìn)行授精，受精后2min，加入5倍體積的新鮮海水靜置，受精后7-10min，以160目網(wǎng)袋收集上浮卵并用10-20倍體積新鮮海水沖洗受精卵，將網(wǎng)袋置于微流水的孵化缸中孵化。新鮮海水鹽度28‰-32‰，受精和孵化水溫保持在14.5±0.5℃。
(4)靜水壓處理：受精后85-90min，將受精卵置于靜水壓機(jī)的壓力艙中，在75mpa壓力強(qiáng)度下進(jìn)行休克處理，持續(xù)處理6min后泄壓，取出受精卵，置于孵化器中繼續(xù)孵化。壓力處理過程中海水溫度14.5±0.5℃。
(二)對所獲有絲分裂雌核發(fā)育卵進(jìn)行孵化和苗種培育，得到有絲分裂雌核發(fā)育苗種。
(1)雌核發(fā)育卵的孵化：靜水壓處理完畢后將魚卵取出放入14.5±0.5℃的海水中流水孵化。
(2)苗種培育：雌核發(fā)育初孵仔魚布池時水溫與孵化水溫相同(13-15℃)，每天升溫1℃，水溫上升至18℃時停止，本實施例通過研究確定大菱鲆的性別分化時期為20.1-43.0mm，因此在苗種全長達(dá)到50mm以前，苗種培育水溫嚴(yán)格控制在18±0.5℃。苗種培育其他操作為大菱鲆苗種培育常規(guī)操作。
表1為大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育誘導(dǎo)和苗種培育結(jié)果。其中，遺傳失活的真鯛精液與大菱鲆卵的受精率為84.6％，孵化后1-40日齡的成活率為2.46％，40-60日齡的成活率為51.1％。最終獲得150日齡有絲分裂雌核發(fā)育苗種94尾，其中雌魚47尾。培育水溫嚴(yán)格控制在18±0.5℃，以便抑制ww苗種性別表型雄性化。
表1大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育誘導(dǎo)和苗種培育結(jié)果
(三)將所獲得的有絲分裂雌核發(fā)育苗種養(yǎng)殖成為有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚。
雌核發(fā)育苗種全長超過10cm后，分別用熒光和pit雙重標(biāo)記對雌核發(fā)育苗種進(jìn)行標(biāo)記，其中，熒光標(biāo)記選擇紅色熒光，標(biāo)記位置選擇大菱鲆下頜部肌肉，注射劑量10μl/尾，pit標(biāo)記選擇規(guī)格為1.4mm×8mm的小型電子芯片，注射到大菱鲆背鰭最高點(diǎn)下方肌肉，以pit射頻掃碼儀掃描，記錄個體編號。標(biāo)記后的大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育幼魚放入原養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)1周時間，檢查熒光標(biāo)記是否脫落、pit標(biāo)記能否正常讀取，對于熒光標(biāo)記脫落或者pit標(biāo)記無法讀取的個體，重新進(jìn)行標(biāo)記，確保每尾苗種均保有雙重標(biāo)記，這樣，有絲分裂雌核發(fā)育幼魚與普通苗種可通過熒光標(biāo)記直觀的區(qū)分，有絲分裂雌核發(fā)育幼魚個體間則可以通過pit標(biāo)記逐尾區(qū)分。
標(biāo)記后的94尾雌核發(fā)育幼魚與200尾同規(guī)格的普通健康苗種同池養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水槽的面積為16m2，此后按照正常的養(yǎng)殖方法，將雌核發(fā)育幼魚培育成大菱鲆后備親魚，1齡后，隨魚個體增加，將雌核發(fā)育苗種和普通苗種分池培育。
(四)對有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚進(jìn)行促熟培育和產(chǎn)卵調(diào)控，能夠正常成熟和采卵的雌魚即為超雌親魚，挑選出來直接用于大菱鲆全雌苗種的商業(yè)化生產(chǎn)。
有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚達(dá)4齡后進(jìn)行產(chǎn)卵調(diào)控，調(diào)控的條件為光照強(qiáng)度500-800lx，光周期16h光照:8h黑暗，溫度13±0.5℃，經(jīng)3個月光溫調(diào)控，將卵巢發(fā)育成熟且可以進(jìn)行采卵操作的有絲分裂雌核發(fā)育親魚挑選出來，即為大菱鲆超雌親魚，可直接與普通zz雄魚交配，生產(chǎn)大菱鲆全雌苗種。