本發(fā)明屬于魚類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種大菱鲆zw全雌苗種的制種方法。
背景技術(shù)：
大菱鲆(scophthalmusmaximus)是世界性鲆鰈類養(yǎng)殖良種，養(yǎng)殖范圍遍及歐、美、亞洲十幾個(gè)沿海國(guó)家，其中，中國(guó)年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到6萬t，占世界養(yǎng)殖產(chǎn)量的80％，苗種的年需求量約為1.2億尾(feap，2016；國(guó)家鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系年度報(bào)告，2015)。與牙鲆和半滑舌鰨等鲆鰈類一樣，大菱鲆雌雄生長(zhǎng)速度差異顯著，全同胞苗種同池養(yǎng)殖2年后雌魚的體重是雄魚的1.8倍(imslandetal.,1997，aquacultureresearch,28:101–114)，與雌雄混群的苗種相比，全雌苗種的養(yǎng)殖可以提高生產(chǎn)效率40％以上，全雌苗種的制備技術(shù)因此成為許多大菱鲆養(yǎng)殖國(guó)家的研究熱點(diǎn)。從20世紀(jì)90年代開始，英國(guó)、法國(guó)、西班牙和我國(guó)等先后立項(xiàng)對(duì)大菱鲆全雌苗種生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行研究，但到目前為止，還沒有成功的報(bào)道。martínez等2014年(frontgenet.2014；5:340.doi:10.3389/fgene.2014.00340)和maribaroiller&d’cotta2016年(sexdev10:242-266,2016)提出一條通過激素誘導(dǎo)和測(cè)交篩選相結(jié)合的方法制備大菱鲆超親魚，然后利用超雌魚與普通雄魚交配規(guī)?；a(chǎn)全雌苗種的技術(shù)路線，也因?yàn)橹品N周期長(zhǎng)和成本高至今還沒有得到完整實(shí)施。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明公布了一種大菱鲆zw全雌苗種的制種方法，以解決目前大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)缺乏全雌苗種的難題。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種大菱鲆zw全雌苗種的制種方法，它包括如下步驟：(1)采用遺傳失活魚類異源精子誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育的方法獲得大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育卵；(2)對(duì)所獲有絲分裂雌核發(fā)育卵進(jìn)行孵化和苗種培育，得到有絲分裂雌核發(fā)育苗種；(3)將所獲有絲分裂雌核發(fā)育苗種養(yǎng)殖成為有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚；(4)對(duì)有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚進(jìn)行促熟培育和產(chǎn)卵調(diào)控，能夠正常成熟和采卵的雌魚即為超雌親魚；(5)對(duì)大菱鲆ww超雌親魚和正常zz雄魚分別進(jìn)行產(chǎn)卵調(diào)控，采集卵子和精液進(jìn)行人工授精，獲得遺傳型全部是zw的受精卵；(6)對(duì)zw受精卵進(jìn)行孵化和苗種培育，獲得規(guī)?；拇罅怫胰泼绶N。選擇步驟(1)所述遺傳失活魚類異源精子的標(biāo)準(zhǔn)：1)遺傳失活后與大菱鲆卵人工授精的受精率高于70％，保證有較高的誘導(dǎo)效率；2)雜種仔魚不能成活，保證即使精子的遺傳失活處理失敗，所形成的雜種胚胎也不能培育出苗種，節(jié)省了后續(xù)苗種篩選工序。
進(jìn)一步，所述的遺傳失活魚類異源精子為真鯛冷凍精子；真鯛冷凍精子遺傳失活處理：將解凍后的真鯛精液用4℃預(yù)冷的hank’s液稀釋至原始精液的20倍，用劑量為6480～7200ergmm-2的紫外線將真鯛精子遺傳物質(zhì)滅活，取滅活后的真鯛精液與大菱鲆卵子按1:20-30比例進(jìn)行授精。
進(jìn)一步，步驟(1)中遺傳失活魚類異源精子與大菱鲆卵子受精后85-90min，將受精卵置于靜水壓機(jī)的壓力艙中，在75mpa壓力強(qiáng)度下進(jìn)行休克處理，持續(xù)處理6min后泄壓，取出受精卵，置于孵化器中繼續(xù)孵化；壓力處理過程中海水溫度14.5±0.5℃。
進(jìn)一步，步驟(2)和步驟(6)所述的苗種培育，在大菱鲆苗種全長(zhǎng)20-50mm期間，培育水溫嚴(yán)格控制在18±0.5℃，以便抑制苗種性別表型雄性化。
進(jìn)一步，步驟(3)中有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚培育方法為大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育苗種全長(zhǎng)達(dá)到100mm后，逐尾采用pit和熒光雙重標(biāo)記后，與普通健康苗種同池混養(yǎng)。
上述有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚生長(zhǎng)速度慢，人工養(yǎng)殖條件下，普通雌魚3齡就能達(dá)到性成熟，而有絲分裂雌核發(fā)育雌魚成熟年齡比普通雌魚晚1年，至少需要達(dá)到4齡才能達(dá)到性成熟。
進(jìn)一步，步驟(4)所述對(duì)有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚進(jìn)行促熟培育和產(chǎn)卵調(diào)控，具體方法為雌核發(fā)育后備親魚年齡達(dá)到4齡以后，預(yù)定產(chǎn)卵期前3個(gè)月，開始進(jìn)行促熟和產(chǎn)卵調(diào)控，控制條件為光照強(qiáng)度300-500lx，光照周期16h光照：8h黑暗，水溫13±0.5℃。經(jīng)過3個(gè)月的促熟和產(chǎn)卵調(diào)控培育，部分雌核發(fā)育雌魚達(dá)到性成熟，將發(fā)育成熟和可以產(chǎn)卵的雌魚挑選出來，就是超雌親魚，可以直接用于大菱鲆全雌苗種的商業(yè)化生產(chǎn)。
進(jìn)一步，步驟(5)大菱鲆ww超雌親魚和正常zz親魚進(jìn)行產(chǎn)卵調(diào)控的時(shí)候，由于超雌魚的成熟比普通雌魚晚一個(gè)月，因此為保持超雌魚和普通zz雄魚同步成熟，zz普通雄魚開始進(jìn)行繁殖調(diào)控的時(shí)間要比超雌親魚推遲一個(gè)月。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
(1)ww超雌魚不是一個(gè)自然存在的基因型，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)擁有該種性別決定機(jī)制的魚類ww雌魚可以成活和繁殖的報(bào)道。本發(fā)明證明了大菱鲆ww魚可以成活和繁殖，為利用超雌魚進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)全雌苗種奠定了基礎(chǔ)。
(2)本發(fā)明對(duì)有絲分裂雌核發(fā)育苗種與普通健康苗種進(jìn)行同池混養(yǎng)的方法，是因?yàn)閲?yán)重近交，大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育苗種成活率低、體質(zhì)弱，單獨(dú)長(zhǎng)期養(yǎng)殖，會(huì)因苗種數(shù)量較少，養(yǎng)殖水槽面積小了環(huán)境不穩(wěn)定，面積大了會(huì)因密度太小難于管理，標(biāo)記后與普通健康苗種混養(yǎng)，這樣既可以保證養(yǎng)殖環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)又方便了投喂和換水等正常管理，可以提高雌核發(fā)育苗種的養(yǎng)殖成活率。
(3)martínez等2014年、baroiller&d'cotta2016年提出一條通過激素誘導(dǎo)和測(cè)交篩選相結(jié)合的方法制備大菱鲆超親魚，然后利用超雌魚與普通雄魚交配規(guī)模化生產(chǎn)全雌苗種的技術(shù)路線，該技術(shù)路線包括兩代親魚培育和兩次測(cè)交篩選，從開始制種到獲得可以成熟繁殖的超雌親魚，時(shí)間至少需要8年時(shí)間(兩代親魚培育分別需要4年時(shí)間：親魚成熟3年+測(cè)交篩選1年，2代親魚培育和測(cè)交合計(jì)8年)，工作量上制備10尾ww雌魚至少需要建立32個(gè)測(cè)交家系(2個(gè)zw/zz雄魚+30個(gè)zw/ww雌魚)。本發(fā)明提出的超雌魚制種技術(shù)，從相同的起點(diǎn)開始，最多只需5年時(shí)間，而且中間不需要任何激素誘導(dǎo)處理和測(cè)交驗(yàn)證，大幅度地縮短了制種周期和降低了制種成本。
(4)大菱鲆是全球性養(yǎng)殖魚類，其中，中國(guó)大菱鲆年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到6萬t，苗種的年求量約為1.2億尾。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了全雌苗種的規(guī)模化生產(chǎn)，可以提高大菱鲆養(yǎng)殖效率40％以上，可以極大地促進(jìn)我國(guó)大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，同時(shí)使我國(guó)的大菱鲆全雌苗種生產(chǎn)研究處于世界領(lǐng)先水平。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的大菱鲆zw全雌苗種制種技術(shù)路線。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合圖1具體說明大菱鲆zw全雌苗種制種方法，具體按以下步驟實(shí)施，其中沒有交代的技術(shù)細(xì)節(jié)為本領(lǐng)域的普通技術(shù)常識(shí)：
實(shí)施例1
(一)采用遺傳失活魚類異源精子誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育的方法獲得大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育卵。
(1)魚卵采集：人工養(yǎng)殖大菱鲆親魚經(jīng)過2個(gè)月左右的光溫調(diào)控促熟培育后，性腺開始發(fā)育成熟，采用擠卵的方法定期對(duì)排卵親魚進(jìn)行人工采卵，從獲得的卵子中選擇卵質(zhì)好、每尾單次排卵量超過250ml的卵，置于干燥潔凈的器皿內(nèi)，于14.5±0.5的室溫下避光保存?zhèn)溆谩?/p>
(2)真鯛冷凍精子遺傳失活處理：裝有真鯛冷凍精液的凍存管從液氮中取出后，采用快速水浴解凍(水溫37-40℃)，解凍過程中輕輕搖動(dòng)冷存管，至冷存管中樣品溶解，取出。用4℃預(yù)冷的hank’s保護(hù)液將解凍后的精液稀釋至原始精液濃度的20倍(原始精液:保護(hù)液＝1:19)。取稀釋后的精液20μl置于干凈的載玻片上，用吸管滴加2滴海水，鏡檢精子活力，取同一視野下快速直線運(yùn)動(dòng)精子比例高于70％的稀釋精液備用。將稀釋的真鯛精液平鋪在直徑12-15cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中(厚度0.4mm)，采用紫外交聯(lián)儀(型號(hào)scientz03-ⅱ，寧波新芝生物科技有限公司)進(jìn)行照射處理，照射劑量為7200erg·mm-2，照射后的精液迅速避光轉(zhuǎn)移至干燥潔凈的黑色玻璃杯中，鏡檢精子活力，并于4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)人工授精：滅活精液與卵子體積比按1:20-30比例混合均勻，添加精卵體積2倍體積的新鮮海水進(jìn)行授精，受精后2min，加入5倍體積的新鮮海水靜置，受精后7-10min，以160目網(wǎng)袋收集上浮卵并用10-20倍體積新鮮海水沖洗受精卵，將網(wǎng)袋置于微流水的孵化缸中孵化。新鮮海水鹽度28‰-32‰，受精和孵化水溫保持在14.5±0.5℃。
(4)靜水壓處理：受精后85-90min，將受精卵置于靜水壓機(jī)的壓力艙中，在75mpa壓力強(qiáng)度下進(jìn)行休克處理，持續(xù)處理6min中后泄壓，取出受精卵，置于孵化器中繼續(xù)孵化。壓力處理過程中海水溫度14.5±0.5℃。
(二)對(duì)所獲有絲分裂雌核發(fā)育卵進(jìn)行孵化和苗種培育，得到有絲分裂雌核發(fā)育苗種。
(1)雌核發(fā)育卵的孵化：靜水壓處理完畢后將魚卵取出放入14.5±0.5℃的海水中流水孵化。
(2)苗種培育：雌核發(fā)育初孵仔魚布池時(shí)水溫與孵化水溫相同(13-15℃)，每天升溫1℃，水溫上升至18℃時(shí)停止，以后整個(gè)苗種培育過程直至苗種全長(zhǎng)達(dá)到50mm以前，苗種培育水溫嚴(yán)格控制在18±0.5℃。苗種培育其他操作為大菱鲆苗種培育常規(guī)操作。
表1為大菱鲆有絲分裂雌核發(fā)育誘導(dǎo)和苗種培育結(jié)果。其中，遺傳失活的真鯛精液與大菱鲆卵的受精率為84.6％，孵化后1-40日齡的成活率為2.46％，40-60日齡的成活率為51.1％。最終獲得150日齡有絲分裂雌核發(fā)育苗種94尾，其中雌魚47尾。
表1大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育誘導(dǎo)和苗種培育結(jié)果
(三)將所獲有絲分裂雌核發(fā)育苗種養(yǎng)殖成為有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚。
雌核發(fā)育苗種全長(zhǎng)超過100mm后，分別用熒光和pit雙重標(biāo)記對(duì)雌核發(fā)育苗種進(jìn)行標(biāo)記，其中，熒光標(biāo)記選擇紅色熒光，標(biāo)記位置選擇大菱鲆下頜部肌肉，注射劑量10μl/尾，pit標(biāo)記選擇規(guī)格為1.4mm×8mm的小型電子芯片，注射到大菱鲆背鰭最高點(diǎn)下方肌肉中，以pit射頻掃碼儀掃描，記錄個(gè)體編號(hào)。標(biāo)記后的大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育幼魚放入原養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)1周時(shí)間，檢查熒光標(biāo)記是否脫落、pit標(biāo)記能否正常讀取，對(duì)于熒光標(biāo)記脫落或者pit標(biāo)記無法讀取的個(gè)體，重新進(jìn)行標(biāo)記，確保每尾苗種均保有雙重標(biāo)記，這樣，有絲分裂雌核發(fā)育幼魚與普通苗種可通過熒光標(biāo)記直觀的區(qū)分，有絲分裂雌核發(fā)育幼魚個(gè)體間則可以通過pit標(biāo)記逐尾區(qū)分。
標(biāo)記后的94尾雌核發(fā)育幼魚與200尾同規(guī)格的普通健康苗種同池養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水槽的面積為16m2，此后按照正常的養(yǎng)殖方法，將雌核發(fā)育幼魚培育成大菱鲆后備親魚，1齡后，隨魚個(gè)體增加，將雌核發(fā)育苗種和普通苗種分池培育。
(四)對(duì)有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚進(jìn)行促熟培育和產(chǎn)卵調(diào)控，能夠正常成熟和采卵的雌魚即為超雌親魚。
有絲分裂雌核發(fā)育后備親魚達(dá)4齡后進(jìn)行產(chǎn)卵調(diào)控，調(diào)控的條件為光照強(qiáng)度500-800lx，光周期16h光照:8h黑暗，溫度13±0.5℃，經(jīng)3個(gè)月光溫調(diào)控，將卵巢發(fā)育成熟且可以進(jìn)行采卵操作的有絲分裂雌核發(fā)育親魚挑選出來，即為大菱鲆超雌親魚，可直接與普通zz雄魚交配，生產(chǎn)大菱鲆全雌苗種。
(五)對(duì)大菱鲆ww超雌親魚和正常zz雄魚分別進(jìn)行產(chǎn)卵調(diào)控，采集卵子和精液進(jìn)行人工授精，獲得遺傳型全部是zw的受精卵；
(1)普通zz雄魚繁殖調(diào)控：有絲分裂雌核發(fā)育親魚啟動(dòng)產(chǎn)卵調(diào)控一個(gè)月后，對(duì)用于受精的普通雄魚開始進(jìn)行繁殖調(diào)控，調(diào)控的條件為光照強(qiáng)度500-800lx，光周期16h光照:8h黑暗，溫度13±0.5℃，經(jīng)2個(gè)月光溫調(diào)控后，普通zz雄魚發(fā)育成熟并可以采集精液。
(2)超雌親魚卵的人工授精和孵化：超雌親魚卵和普通雄魚的精液采用干法人工授精，授精時(shí)每尾超雌親魚的卵加入2尾普通雄魚的精液，以羽毛或玻璃棒攪拌均勻后加入2倍卵量體積的新鮮海水，靜止5分鐘后將受精卵收集起來，用新鮮海水沖洗干凈，置于孵化網(wǎng)箱中流水孵化，孵化水溫13～15℃。
(六)對(duì)zw受精卵進(jìn)行孵化和苗種培育，獲得規(guī)?；拇罅怫胰泼绶N。
zw受精卵孵化后初孵仔魚布池時(shí)水溫與孵化水溫相同(13～15℃)，5d內(nèi)將水溫緩慢升至18℃，苗種規(guī)格達(dá)到20～50mm期間，苗種培育水溫嚴(yán)格控制水溫在18±0.5℃。
(七)對(duì)照組構(gòu)建：選取性腺發(fā)育成熟的普通雌魚與雄魚，按照zw苗種的培育方法，建立對(duì)照組家系。
(八)對(duì)照組和zw苗種的性別鑒定：對(duì)照組和zw苗種規(guī)格達(dá)到150mm以上，隨機(jī)選取60尾苗種，麻醉后通過解剖和肉眼觀察的方法鑒定苗種性別。此時(shí)，大菱鲆幼魚卵巢為左右對(duì)稱的囊狀結(jié)構(gòu)，呈倒戟狀且中部向后突出；精巢位于膀胱表面，左右兩側(cè)各有1條白色細(xì)帶狀結(jié)構(gòu)，很容易用肉眼區(qū)分。
重復(fù)上述方法，本實(shí)施例重復(fù)構(gòu)建3個(gè)zw苗種和2個(gè)對(duì)照組家系，并跟蹤檢測(cè)各家系苗種性別比例。結(jié)果表明，對(duì)照組2個(gè)家系的雌性比例分別為65％和40％，3個(gè)zw全雌苗種家系的雌性比例均為100％，結(jié)果如表2所示。
表2大菱鲆全雌苗種生產(chǎn)結(jié)果
至此建立了大菱鲆zw全雌苗種的制種技術(shù)。