本發(fā)明屬于植物多倍體育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種高效創(chuàng)建國蘭有性多倍體的方法。

背景技術(shù)：

國蘭（chinesecymbidium）是指蘭屬植物中一部分產(chǎn)于東亞溫帶至熱帶地區(qū)的地生種類：包括春蘭、蕙蘭、建蘭、墨蘭、寒蘭、蓮瓣蘭、春劍、套葉蘭、莎葉蘭、邱北冬蕙蘭、峨嵋春蕙、兔耳蘭、寬葉蘭、落葉蘭等。國蘭香氣宜人、株型秀美、花色雅致，是中國傳統(tǒng)文化的物質(zhì)載體，素有“花中君子”之稱，在我國已有1000多年的栽培歷史。隨著國蘭產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和人們物質(zhì)文化生活水平的不斷提高，國蘭開始走進(jìn)尋常百姓家，受到越來越多消費(fèi)者的喜愛，其市場前景十分廣闊。

多倍體具有植株粗壯、葉片寬厚、花大而艷麗、內(nèi)含物多、對次生代謝物的積累強(qiáng)以及抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，還能夠克服遠(yuǎn)緣雜交不親和，增加物種的多樣性，大大的提高了花卉的觀賞性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。多倍體育種是蘭花育種的重要方法。目前商業(yè)化的大花蕙蘭、蝴蝶蘭、石斛蘭品種大多數(shù)都是多倍體品種。但目前產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的國蘭品種都是二倍體品種。為了培育國蘭多倍體品種，已有研究者通過秋水仙素處理的方法獲得墨蘭、春蘭、寒蘭、春劍等無性多倍體的報(bào)道。但用秋水仙素誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體存活率低，生長慢、難繁殖，較難在生產(chǎn)上直接利用。

利用2n配子途徑創(chuàng)造多倍體可將植物倍性優(yōu)勢和雜交優(yōu)勢有效結(jié)合，快速育成能適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化要求、突破性的植物新品種。因此，研究通過2n配子途徑創(chuàng)造國蘭多倍體，建立高效創(chuàng)建國蘭有性多倍體技術(shù)體系，對提高我國國蘭產(chǎn)業(yè)的核心競爭力和效益、盡快縮小我國蘭花育種和國外的差距、促進(jìn)花卉產(chǎn)業(yè)高效可持續(xù)發(fā)展具有十分重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高效創(chuàng)建國蘭有性多倍體的方法。

一種高效創(chuàng)建國蘭有性多倍體的方法，包括以下步驟：

s1.親本選擇和雜交組合配置：選擇高效發(fā)生2n配子的雜交蘭或國蘭做親本，配置雜交組合，獲得果實(shí)；

s2.種子培養(yǎng)和中間繁殖體鑒定：對蘭花種子進(jìn)行無菌培養(yǎng)獲得中間繁殖體（一般為根狀莖），將單粒種子形成的中間繁殖體進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，觀察中間繁殖體形態(tài)、生長速度，選擇粗壯、尖端圓鈍、增殖速度較慢的中間繁殖體；

s3.植株再生和試管苗形態(tài)觀察：對選到的中間繁殖體進(jìn)行分化培養(yǎng)和生根壯苗培養(yǎng)，對形成的再生植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，選擇國蘭株型、植株粗壯、葉色深、葉厚、根粗壯、根尖端圓鈍的植株；

s4.細(xì)胞學(xué)鑒定和有性多倍體的獲得：對當(dāng)選的植株進(jìn)行流式細(xì)胞儀測定和根尖染色體數(shù)測定，染色體數(shù)為60條或以上的為多倍體。

優(yōu)選地，s1親本選擇中母本為小香，父本為兔耳蘭。

進(jìn)一步地，s2包括以下步驟：

s21.果實(shí)消毒、接種和初代培養(yǎng)：將雜交后150~270天左右的果實(shí)洗凈，然后用75%乙醇消毒8~10分鐘，無菌水沖洗3~5次，取其內(nèi)部種子接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為溫度26℃左右，暗培養(yǎng)；

s22.中間繁殖體的增殖：將種子萌發(fā)后形成的中間繁殖體分開，將單個(gè)中間繁殖體或?qū)⑵淝谐砷L度2~8mm小段，分別接種于繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為溫度26℃左右，每日光照8~12小時(shí)，光照強(qiáng)度500~1000lux；

s23.中間繁殖體形態(tài)觀察：對中間繁殖體的繁殖速度、形態(tài)特征進(jìn)行觀察，選擇粗壯、尖端圓鈍、增殖速度較慢的中間繁殖體。

更進(jìn)一步地，所述的步驟s21中固體培養(yǎng)基配方1/2ms培養(yǎng)基+0.2～0.5mg/l6-ba+0.1～0.2mg/lnaa+10～20%（v/v）椰子汁+30g/l糖+0.3～2g/l活性炭+7.5g/l卡拉膠；

所述的步驟s22中固體培養(yǎng)基配方為1/2ms培養(yǎng)基+0.5～2mg/l6-ba+0.1～0.2mg/lnaa+0.2～0.5g/l活性碳+30g/l糖+7.5g/l卡拉膠。

步驟s3中所述植株再生和試管苗形態(tài)觀察包括如下步驟：

s31.芽分化培養(yǎng)：將繼代培養(yǎng)的中間繁殖體分開，接種于芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度26℃左右，每日光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度1000~2000lux；

s32.生根壯苗培養(yǎng)：將高2~4cm從中間繁殖體上切下，接種到生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度26℃左右，每日光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度1000~2000lux；

s33.試管苗觀察：對試管苗及其形成過程進(jìn)行觀察，生長慢、形成過程時(shí)間長，粗壯、葉片厚，葉色深、根短粗壯、根尖部圓鈍的試管苗為擬似多倍體，以形態(tài)正常的植株做對照；

更進(jìn)一步地，步驟s31中所述的芽分化培養(yǎng)基配方為1/2ms培養(yǎng)基+1.5～2.0mg/l6-ba+0.1～1mg/lnaa+30g/l糖+0～0.3g/l活性炭+7.5g/l卡拉膠。

步驟s33中所述的生根壯苗培養(yǎng)基配方為1/2ms培養(yǎng)基+0.1～0.2mg/l6-ba+0.5～2mg/lnaa+20～40g/l糖+0.2～0.5g/l活性炭+7.5g/l卡拉膠。

步驟s4所述的細(xì)胞學(xué)鑒定和有性多倍體的獲得包括以下步驟：

s41.流式細(xì)胞儀鑒定：以試管苗葉片為材料，根尖細(xì)胞染色體為40的二倍體為對照，采用partec-cyview85流式細(xì)胞儀確定當(dāng)選擬似多倍體植株的倍性。

s42.根尖細(xì)胞染色體鑒定：以幼嫩根尖為材料，采用壓片法鑒定當(dāng)選試管苗根尖細(xì)胞染色體數(shù)，染色體數(shù)為40時(shí)為二倍體，染色體為60或以上時(shí)為多倍體。

s43.有性多倍體的獲得：將確定為多倍體的試管苗進(jìn)行移栽和栽培，即可獲得有性多倍體。

本發(fā)明利用上述方法，在步驟s1中按照母本為小香，父本為兔耳蘭進(jìn)行雜交。結(jié)果顯示多倍體發(fā)生率分別達(dá)到1.85%和3.45%，表明通過本發(fā)明的2n配子途徑和一系列的國蘭有性多倍體技術(shù)體系處理，能夠高效獲得國蘭有性多倍體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

（1）本發(fā)明利用高效發(fā)生2n配子資源，提高了利用2n配子途徑創(chuàng)建國蘭有性多倍體的效率，為利用多倍體育種方法培育多倍體國蘭新品種提供了可行的途徑；（2）獲得有性多倍體集倍性優(yōu)勢和雜交優(yōu)勢于一身，和無性多倍體相比具有生長速度快，生長勢強(qiáng)等特點(diǎn)，可以直接作為新品種推廣，這些新品種具有更強(qiáng)的市場競爭力，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益都將十分明顯。

附圖說明

圖1為本發(fā)明高效創(chuàng)建國蘭有性多倍體的方法流程圖。

圖2為表1中hx-2組合有性多倍體的鑒定，其中，a.四倍體hx-2-21（左）和二倍體hx-2（右）中間繁殖體；b.四倍體hx-2-21（左）和二倍體hx-2（右）試管苗；c.四倍體hx-2-21流式細(xì)胞圖；d.四倍體hx-2-21根尖染色體（2n=4x=80）e.二倍體hx-2流式細(xì)胞圖；f.二倍體hx-2根尖染色體（2n=2x=40）。

圖3為表1中hx-3組合有性多倍體的鑒定，其中，a.三倍體（左和中）和二倍體（右）中間繁殖體；b.三倍體（左和中）和二倍體（右）試管苗；c.三倍體流式細(xì)胞圖；d.三倍體根尖染色體（2n=3x=60）e.二倍體流式細(xì)胞圖；f.二倍體根尖染色體（2n=2x=40）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但具體實(shí)例并不對本發(fā)明做任何的限定。以下實(shí)例中所述培養(yǎng)基、試劑等均為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過購買可以得到。

實(shí)施例1：墨蘭有性多倍體資源的創(chuàng)建

2012年開始我們用本發(fā)明所述的方法進(jìn)行墨蘭有性多倍體資源創(chuàng)建，具體方法如下（流程如圖1所示）：

s1.親本選配和雜交組合配置：選擇2n雄配子發(fā)生率高的06-bs-45-32（2n雄配子發(fā)生率2.67）和06-bs-45-17（2n雄配子發(fā)生率3.92）為親本材料，2012年2月20日分別以06-bs-45-32和06-bs-45-17為母本、06-bs-45-17為父本配制雜交組合，同年10月18日收獲果實(shí)。

其中，2n雄配子發(fā)生率高的06-bs-45-32（2n雄配子發(fā)生率2.67）和06-bs-45-17（2n雄配子發(fā)生率3.92）的獲得方法參見專利201310668763.9公開的內(nèi)容。

s2.種子培養(yǎng)和中間繁殖體鑒定：

s21.果實(shí)消毒、接種和初代培養(yǎng)：將雜交后發(fā)育240天的果實(shí)用用解剖刀去掉果柄，修理果實(shí)頂部，蘸取洗潔精刷洗后用自來水沖洗5～6min，晾干，在超凈工作臺上用75%的酒精浸泡8～10min，無菌水沖洗3～5次后，用無菌解剖刀切開取其內(nèi)部種子接種到1/2ms+6-ba（6-芐基腺膘呤）0.5mg·l^-1+naa（萘乙酸）0.2mg·l^-1+蔗糖30g·l^-1+卡拉膠7.5g·l^-1+cw（椰子汁）100ml·l^-1+ac（活性炭）0.5g·l^-1的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度26℃左右，暗培養(yǎng)。

s22.中間繁殖體的增殖和鑒定：將種子萌發(fā)后形成的中間繁殖體分開，將單個(gè)中間繁殖體或?qū)⑵淝谐芍睆?～3mm小塊，分別接種于1/2ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+蔗糖30g·l-1+卡拉膠7.5g·l-1+ac0.5g·l-1的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度26℃左右，每日光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度1000lux。觀察各種子形成的中間繁殖體形態(tài)、生長速度，發(fā)現(xiàn)在06-bs-45-32×06-bs-45-17組合中有2個(gè)種子萌發(fā)形成的根狀莖粗壯、尖端圓鈍、增殖速度較慢，在06-bs-45-17×06-bs-45-17的組合中有1個(gè)種子萌發(fā)形成的根狀莖粗壯、尖端圓鈍、增殖速度較慢（圖2-a和圖3-a）。

s3.植株再生和試管苗形態(tài)觀察：

s31.分化培養(yǎng)：將中間繁殖體分開，分別接種到1/2ms+6-ba1.5～2.0mg·l^-1+naa0.2～0.5mg·l^-1+30g·l^-1蔗糖+卡拉膠7.5g·l^-1的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行芽分化培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度26℃左右，每日光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度2000lux。

s32.生根壯苗：選取2cm以上的芽或小苗，接種于：1/2ms+6-ba0.1～0.2mg·l^-1+naa0.5～1.0mg·l^-1+蔗糖20-40g·l^-1+卡拉膠7.5g·l^-1+ac0.5g·l^-1，的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度26℃左右，每日光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度2000lux。

s33.試管苗觀察：對試管苗及其形成過程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)粗壯、尖端圓鈍、增殖速度較慢的根狀莖分化形成過程苗的時(shí)間長，其試管苗比其他試管苗更粗壯、葉片厚，葉色深、根短粗壯、根尖部圓鈍，為擬似多倍體（圖2-b和圖3-b）；

s4.細(xì)胞學(xué)鑒定和有性多倍體的獲得：

s41.流式細(xì)胞儀鑒定：以試管苗葉片為材料，按partec-cyview85流式細(xì)胞儀操作步驟和流程測定對照（形態(tài)正常的試管苗）和擬似多倍體的倍性（圖2-c,e和圖3-c,e）。

s42.根尖細(xì)胞染色體鑒定：以試管苗幼嫩根尖為材料，采用壓片法鑒定擬似多倍體試管苗和對照根尖細(xì)胞染色體數(shù)，染色體數(shù)為40時(shí)為二倍體，染色體為60或以上時(shí)為多倍體（圖2-d,f和圖3-d,f）;

s43.有性多倍體的獲得：當(dāng)多倍體小苗長至5～8cm并具有2條以上根時(shí)即可進(jìn)行煉苗。煉苗時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子旋松，放在溫室中10～20d或在室外無直射光的地方放置3～5d后，取出試管苗洗凈，用樹皮和進(jìn)口泥炭混合基質(zhì)種植于育苗杯中，按國蘭種植的管理方法進(jìn)行栽培即可獲得成品多倍體。

表1國蘭有性多倍體發(fā)生率

*：（）內(nèi)數(shù)據(jù)為該株系（品種）的2n雄配子發(fā)生率；06-bs-45-17和06-bs-45-32分別為小香×兔耳蘭的高效發(fā)生2n雄配子雜交后代。