本發(fā)明屬于細(xì)胞組織工程領(lǐng)域，特別涉及人體干細(xì)胞的冷凍液及冷凍儲(chǔ)存方法。
背景技術(shù)：
：在過去十年里，多能干細(xì)胞成為多個(gè)領(lǐng)域的實(shí)用工具，用以幫助人們探索發(fā)育生物學(xué)、研究疾病病理和開發(fā)細(xì)胞療法。無(wú)論干細(xì)胞的用途是什么，都離不開低溫保存。低溫保存即冷凍可以保存珍貴的干細(xì)胞資源，但冷凍干細(xì)胞并不像冷凍已分化細(xì)胞那么簡(jiǎn)單，其需要恰當(dāng)?shù)睦鋬鲈噭┖头桨?，否則保存的干細(xì)胞發(fā)生隨機(jī)分化，就會(huì)失去價(jià)值。通常的冷凍方案為，先用蛋白酶來(lái)解離細(xì)胞，再進(jìn)行離心，最后用含有冷凍液的培養(yǎng)基重懸，常用的冷凍液，包括二甲基亞砜(dmso)、蔗糖及甘油等。dmso和甘油屬于滲透性抗凍劑，蔗糖則為非滲透性抗凍劑。dmso和甘油均可有效地幫助細(xì)胞抵御冷凍帶來(lái)的有害影響，但經(jīng)含有大劑量dmso和甘油的冷凍液冷凍的干細(xì)胞并不適合人體，它們極易損傷并且dmso極可能會(huì)有毒副作用。此外，使用普通的冷凍液fbs/dmso/甘油混合物時(shí)，細(xì)胞復(fù)蘇之后的活性往往較差，復(fù)蘇過程中容易導(dǎo)致干細(xì)胞氧化損傷與分化潛能降低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為解決以上問題，本發(fā)明提供一種人體干細(xì)胞的冷凍液及冷凍存儲(chǔ)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供人體干細(xì)胞的冷凍液，其中，每1000ml冷凍液包括以下成份及含量：20-50mg紅景天苷；50～100g羥乙基變性淀粉450kd；10～50g羧化多聚-l-賴氨酸；50～100g蔗糖；20～150g海藻糖；5～20g抗凍蛋白；5～20g糖蛋白；20～50mldmso；60～100ml甘油；200～300ml胎牛血清；余量為緩沖液。其中，人體干細(xì)胞的冷凍液的ph為7.0～7.4。其中，人體干細(xì)胞包括普通體細(xì)胞，自體血液細(xì)胞，自體脂肪細(xì)胞，臍帶血來(lái)源細(xì)胞。其中，緩沖液包括pbs緩沖液或hepes緩沖液中的一種或兩種。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于人體干細(xì)胞的冷凍存儲(chǔ)方法，具體包括以下步驟：(1)將人體干細(xì)胞放入以上所述的冷凍液中，在-20℃冷凍1～4小時(shí)。(2)將步驟(1)液體繼續(xù)在-80℃環(huán)境下冷凍8～12小時(shí)。(3)將步驟(2)處理后的液體放入液氮中儲(chǔ)存。該人體干細(xì)胞的冷凍液中，羧化多聚-l-賴氨酸(polyamino-acidcarboxylatedpoly-l-lysine)，簡(jiǎn)稱cpll，是一種兩性高分子化合物，通過ε-聚-l-賴氨酸水溶液與琥珀酸酐反應(yīng)后，65mol％胺基基團(tuán)被轉(zhuǎn)化為羧基集團(tuán)而合成。羧化多聚-l-賴氨酸具有相近似的防凍功能，經(jīng)過特定配方混合后制成的冷凍液，能夠提升細(xì)胞解凍后的存活率和增殖率。二甲基亞砜(dmso)，是良好的細(xì)胞冷凍劑，在低溫凍存時(shí)，可以長(zhǎng)期保持細(xì)胞的活力與功能，但在室溫下，有較強(qiáng)的細(xì)胞毒副作用，對(duì)細(xì)胞的存活率、生長(zhǎng)增殖能力能夠產(chǎn)生影響。紅景天苷，提取自高山紅景天，分子式為c14h20o7，通過并抑制胱天蛋白酶-3激活，能夠減輕細(xì)胞活性的損失和h(2)o(2)刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,可以保細(xì)胞和組織免受應(yīng)激。胎牛血清，是重要細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)對(duì)細(xì)胞在不同溫度環(huán)境下提供保護(hù)。海藻糖，由兩個(gè)葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用海藻糖對(duì)生物體具有的保護(hù)作用，這是因?yàn)楹Ｔ逄窃诟邷亍⒏吆?、等環(huán)境條件下在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。羥乙基變性淀粉450kd，為平均分子量為450000的羥乙基變性淀粉，附著于細(xì)胞外部，對(duì)細(xì)胞起到良好的保護(hù)作用。蔗糖，作為細(xì)胞保存液基本成分，使細(xì)胞有平衡穩(wěn)定的環(huán)境?？箖龅鞍?，為一類提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱，現(xiàn)根據(jù)發(fā)現(xiàn)包括五種，抗凍糖蛋白、抗凍蛋白ⅰ、抗凍蛋白ⅱ、抗凍蛋白ⅲ、抗凍蛋白ⅳ，此五種抗凍蛋白均適用于本人體干細(xì)胞的冷凍液。糖蛋白，是分支的寡糖鏈與多肽鏈共價(jià)相連所構(gòu)成的復(fù)合糖，主鏈較短。是細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞間質(zhì)、血漿粘液等的重要組分。綜上，本發(fā)明具有以下有益效果：1.本發(fā)明的人體干細(xì)胞冷凍液，能夠有效地保持干細(xì)胞活力，避免氧化損傷，細(xì)胞復(fù)蘇率高。2.本發(fā)明的人體干細(xì)胞冷凍液，通過添加定量的羧化多聚-l-賴氨酸和二甲基亞砜，將二甲基亞砜的含量由10％以上降至2～5％，細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，不需去除即可直接進(jìn)行培養(yǎng)。具體實(shí)施方式下面將更詳細(xì)地描述本公開的示例性實(shí)施方式。雖然說(shuō)明書中顯示了本公開的示例性實(shí)施方式，然而應(yīng)當(dāng)理解，可以以各種形式實(shí)現(xiàn)本公開而不應(yīng)被這里闡述的實(shí)施方式所限制。相反，提供這些實(shí)施方式是為了能夠更透徹地理解本公開，并且能夠?qū)⒈竟_的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。實(shí)施例1冷凍液x1的配制取25mldmso，85ml甘油，225ml胎牛血清，再加入pbs緩沖液配成1000ml的基礎(chǔ)冷凍液，然后再加入20mg紅景天苷，60g羥乙基變性淀粉450kd，45g羧化多聚-l-賴氨酸，50g蔗糖，80g海藻糖，7g抗凍糖蛋白，7g糖蛋白，制成1000ml人體干細(xì)胞的冷凍液母液，然后分裝10份100ml進(jìn)行凍存。人體干細(xì)胞的冷凍儲(chǔ)存法1：根據(jù)待凍存的干細(xì)胞的細(xì)胞總量，計(jì)算出所需凍存液x1的量，將細(xì)胞放入適量的冷凍液x1中，在-20℃冷凍1小時(shí)，繼續(xù)在-80℃環(huán)境下冷凍12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。實(shí)施例2冷凍液x2的配制取20mldmso，100ml甘油，200ml胎牛血清，再加入hepes緩沖液配成1000ml的基礎(chǔ)冷凍液，然后再加入20mg紅景天苷，100g羥乙基變性淀粉450kd，10g羧化多聚-l-賴氨酸，100g蔗糖，150g海藻糖，5g抗凍蛋白ⅰ，5g糖蛋白，制成1000ml人體干細(xì)胞的冷凍液母液，然后分裝10份100ml進(jìn)行凍存。人體干細(xì)胞的冷凍存儲(chǔ)方法2根據(jù)待凍存的干細(xì)胞的細(xì)胞總量，計(jì)算出所需凍存液x2的量，將細(xì)胞放入適量的冷凍液x2中，在-20℃冷凍1小時(shí)，繼續(xù)在-80℃環(huán)境下冷凍12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。實(shí)施例3冷凍液x3的配制取50mldmso，60ml甘油，300ml胎牛血清，再加入pbs緩沖液配成1000ml的基礎(chǔ)冷凍液，然后再加入50mg紅景天苷，50g羥乙基變性淀粉450kd，50g羧化多聚-l-賴氨酸，50g蔗糖，20g海藻糖，20g抗凍蛋白ⅳ，20g糖蛋白，制成1000ml人體干細(xì)胞的冷凍液母液，然后分裝10份100ml進(jìn)行凍存。人體干細(xì)胞的冷凍存儲(chǔ)方法3根據(jù)待凍存的干細(xì)胞的細(xì)胞總量，計(jì)算出所需凍存液x3的量，將細(xì)胞放入適量的冷凍液x3中，在-20℃冷凍1小時(shí)，繼續(xù)在-80℃環(huán)境下冷凍12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)例不同冷凍液的細(xì)胞復(fù)蘇率比較實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：通過以常用凍存液(90％胎牛血清+10％dmso)作為對(duì)照，驗(yàn)證本發(fā)明的人體干細(xì)胞的冷凍液(x1～x3)對(duì)于經(jīng)4次傳代培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的冷凍保存性能。實(shí)驗(yàn)方法：(1)取甲、乙兩份來(lái)源于北京市海淀區(qū)婦幼保健院的臍血標(biāo)本(2份均獲得產(chǎn)婦同意)，以等量的pbs緩沖液混勻，緩慢滴入到等量的淋巴細(xì)胞分離液；650g離心15min抽取白膜層細(xì)胞，以等量的pbs緩沖液洗滌離心，基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸；接種至100mm培養(yǎng)皿，置于37℃、飽和濕度、5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；第5天首次全量換液，之后每周2次換液，2周后達(dá)60％～80％融合時(shí)，用0.25％胰酶(含0.02％edta)常規(guī)消化傳代至第四代。(2)將傳至第四代的細(xì)胞培養(yǎng)物取出，拍打混勻成單細(xì)胞懸液，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)計(jì)算結(jié)果，將同一供者的細(xì)胞分裝成4份，保證每份細(xì)胞含量為1×107。(3)將分裝出的細(xì)胞懸液依次以800～1000r/min離心5min，去上清液，振開細(xì)胞沉淀，向同一供者的4份細(xì)胞沉淀中分別加入適量的冷凍液x1～x3或?qū)φ諆龃嬉?90％胎牛血清+10％dmso)，輕輕吹打混勻并標(biāo)號(hào)。(4)將共8支凍存管在普通冰箱凍室(-20℃)凍存2小時(shí)，然后移至超低溫冰箱(-80℃)凍存12小時(shí)，轉(zhuǎn)入液氮。(5)凍存細(xì)胞在液氮中保存48h后取出，將凍存管在35℃水域中迅速攪動(dòng)3分鐘，至凍存液完全融化，打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中，加入培養(yǎng)液，1500rp離心5min，棄上清(其中含有x1～x3的凍存管也可不經(jīng)此除雜步驟，直接培養(yǎng)，經(jīng)證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無(wú)明顯差異)，加dmem培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中置于37℃下培養(yǎng)，48小時(shí)后在顯微鏡下觀察并計(jì)算復(fù)蘇率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：凍存管標(biāo)號(hào)凍存細(xì)胞數(shù)量復(fù)蘇細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞復(fù)蘇率甲-x11×1070.91×10791％甲-x21×1070.90×10790％甲-x31×1070.92×10792％甲-對(duì)照1×1070.56×10756％乙-x11×1070.91×10791％乙-x21×1070.94×10794％乙-x31×1070.91×10791％乙-對(duì)照1×1070.59×10759％結(jié)果分析：通過上表可知，經(jīng)本發(fā)明的人體干細(xì)胞的冷凍液x1～x3凍存的甲、乙兩份臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，其復(fù)蘇率均在90％以上，要遠(yuǎn)高于普通凍存液的復(fù)蘇率。以上，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12