本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法。

背景技術(shù)：

自從guhas首次報(bào)道毛蔓陀羅花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株以來，關(guān)于花藥培養(yǎng)的研究迅速發(fā)展，包括中國(guó)在內(nèi)的很多國(guó)家相繼進(jìn)行這方面的研究工作，至今已有約200多種作物通過花藥培育獲得了單倍體植株。

在育種領(lǐng)域，花藥培養(yǎng)育種與常規(guī)雜交育種、遠(yuǎn)緣雜交育種、誘變育種以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)成為生物技術(shù)在作物育種中較為廣泛和有效的方法之一，是作物改良和遺傳學(xué)及生理、生化研究的重要方法。到目前為止，我國(guó)已有40多種植物用花藥培養(yǎng)方法獲得了花粉植株，主要有小麥、玉米、水稻、葡萄、柑桔、蘋果、龍眼、橡膠、楊樹及人參等一些藥用植物。已經(jīng)培養(yǎng)出80多個(gè)水稻花粉新品系和新品種，20多個(gè)小麥花粉新品種和新品系。

蓖麻是大戟科蓖麻屬一年生或多年生草本植物，是世界上十大油料作物之一，具有用途廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)，是具有特殊工業(yè)用途的重要工業(yè)油，其籽粒、葉片、莖桿、果殼綜合利用價(jià)值高。目前，還缺乏有競(jìng)爭(zhēng)性的優(yōu)良品種。

長(zhǎng)期以來由于蓖麻主要以雜交、選擇、引種等傳統(tǒng)的方式進(jìn)行育種，在很大程度上限制了其發(fā)展。利用花藥培養(yǎng)可以獲得單倍體植株，再對(duì)其進(jìn)行染色體加倍后，可快速獲得蓖麻育種上廣泛應(yīng)用的純系品種；并且從中選出的優(yōu)良純合系的后代不會(huì)發(fā)生性狀分離，表現(xiàn)整齊一致，可顯著縮短育種年限。但是目前，蓖麻花藥培養(yǎng)還處于起步階段，有關(guān)蓖麻花藥培養(yǎng)的報(bào)道還很少，還存在蓖麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率低和愈傷組織質(zhì)量較差等問題，嚴(yán)重制約了蓖麻花藥離體培養(yǎng)的研究進(jìn)展。因此，建立高效的誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的組培體系，對(duì)加速蓖麻的單倍體育種及進(jìn)一步發(fā)展我國(guó)的蓖麻產(chǎn)業(yè)都具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：

s1.將蓖麻花藥外植體置于15～30mg/l的ba溶液中浸泡10～20min；

s2.將經(jīng)過s1處理的蓖麻花藥外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得愈傷組織；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加了4～16mg/l的snp的ms培養(yǎng)基，或添加了1～2mg/l銅離子的ms培養(yǎng)基，或添加了3～6mg/l谷氨酰胺的ms培養(yǎng)基。

傳統(tǒng)誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法都是選擇將花藥外植體接種在含有各種激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行直接誘導(dǎo)，本發(fā)明的創(chuàng)造性在于先對(duì)花藥外植體進(jìn)行一個(gè)前期的浸泡處理，然后再將外植體接種在含銅離子、snp或谷氨酰胺的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織。對(duì)花藥外植體進(jìn)行前期浸泡處理的好處在于高濃度的ba可以促使花藥外植體以更高的效率脫分化形成更多的愈傷組織，同時(shí)提高了所獲得愈傷組織的質(zhì)量。

優(yōu)選地，將蓖麻花藥外植體置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。

雖然相同的外植體在不同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生過程基本都是一致的，但其愈傷組織質(zhì)量和誘導(dǎo)率則因培養(yǎng)基配方的不同而各異；另外，不同的外植體類型在相同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織的質(zhì)量和誘導(dǎo)率也是各不相同。

優(yōu)選地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加了8mg/l的snp的ms培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加了2mg/l銅離子的ms培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加了6mg/l谷氨酰胺的ms培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述蓖麻花藥外植體的獲取方法為：獲取無昆蟲食取、飽滿的且花被尚未打開的雄花，利用2%次氯酸鈉對(duì)蓖麻雄花進(jìn)行表面滅菌，并剝離雄花表面的花被，小心獲取其中的蓖麻花藥外植體。

本發(fā)明不同濃度的ba溶液的配置方法為：準(zhǔn)確稱取一定量的6-芐氨基嘌呤（6-ba，簡(jiǎn)稱ba）（sigma，usa）粉末，用1mol/l的naoh溶液充分溶解，再用去離子水定容，配制成濃度分別為0、7.5、15、30、60、120mg/l的ba處理溶液。然后用1mol/l的hcl溶液調(diào)整ba處理溶液的ph至5.8～6.0，使用前用0.22微米的水系濾膜（millipore，usa）對(duì)已配制好的ba處理溶液進(jìn)行過濾滅菌。

所述ms培養(yǎng)基：ms培養(yǎng)基配方的無機(jī)成分（16.5g/l硝酸銨、19g/l硝酸鉀、1.7g/l磷酸二氫鉀、3.7g/l七水硫酸鎂、4.4g/l二水氯化鈣、16.9mg/l一水硫酸錳、8.6mg/l七水硫酸鋅、6.2mg/l硼酸、0.83mg/l碘化鉀、0.25mg/l二水硫酸鉬二鈉、0.025mg/l五水硫酸銅、0.025mg/l六水氯化鈷、37.3mg/l二水乙二胺四乙酸鈉、27.8mg/l七水硫酸亞鐵）+ms培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分（2mg/l甘氨酸、0.1mg/l鹽酸硫胺素、0.5mg/l鹽酸吡哆醇、0.5mg/l煙酸）+100mg/l肌醇+30g/l蔗糖+7g/l瓊脂，用1mg/lnaoh溶液調(diào)整ph至5.8～6.0。培養(yǎng)基在121℃，0.1mpa的條件下滅菌15分鐘。

步驟s2所述的培養(yǎng)條件為：室溫為25℃、光照強(qiáng)度為2000lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明的創(chuàng)新性在于改變了傳統(tǒng)誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，即利用高濃度ba溶液對(duì)花藥外植體進(jìn)行短期浸泡處理，由此促使花藥外植體以更高的效率脫分化形成更多的愈傷組織。同時(shí)提高了所獲得愈傷組織的質(zhì)量，為蓖麻相關(guān)生物技術(shù)育種工作奠定了良好的基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例1

一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：

(1)獲取花藥外植體：選取無昆蟲食取、飽滿且花被尚未打開呈球狀的蓖麻雄花。采取時(shí)間應(yīng)選在溫度低，光照弱的晴天上午10時(shí)左右，此時(shí)蓖麻上的花蕾無霧水可減少污染，光照較弱又可防止花藥水分的喪失。將采集的雄花花蕾用紙巾包裹住，先用蒸餾水潤(rùn)濕，再輕輕擠掉多余的水分，然后裝進(jìn)玻璃瓶中，在4℃的冰箱中處理3天。在超凈工作臺(tái)上先用75%乙醇溶液對(duì)蓖麻雄花先消毒1min，再用2%的naclo溶液消毒20min，無菌水漂洗蓖麻雄花5次。之后用滅過菌的解剖針小心將雄花外層的花被去除，再將其中的花藥小心分離，即可獲得蓖麻花藥外植體。

(2)將蓖麻花藥外植體接種在添加不同濃度ba的ms基本培養(yǎng)基上，在室溫為25℃、光照強(qiáng)度為2000lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)愈傷組織。結(jié)果如表1所示，添加適量的ba對(duì)蓖麻花藥愈傷組織的形成具有促進(jìn)作用，當(dāng)ba的濃度為1mg/l時(shí)，蓖麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)最大值，為10.67%；而隨著ba的濃度的繼續(xù)增加，蓖麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸降低。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，采用傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的過程中，所獲得愈傷組織的誘導(dǎo)效率較低且質(zhì)量較差，體積較小。

表1為ba對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

注：數(shù)據(jù)采用spssstatistics17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數(shù)據(jù)后字母不同表示處理間差異顯著。

實(shí)施例2

一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：

(1)獲取花藥外植體：同實(shí)施例1。

(2)將蓖麻花藥外植體置于15mg/l的ba溶液中浸泡不同時(shí)間（0～80min）；

(3)然后將蓖麻花藥外植體放置在無菌吸水紙上吸去多余液體后，小心的接種至無激素ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，浸泡處理外植體的時(shí)間為10min時(shí)，外植體愈傷組織誘導(dǎo)效率效果最佳，達(dá)41.25%（表2）。繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間，蓖麻花藥外植愈傷組織誘導(dǎo)率將逐漸降低。

表2為處理時(shí)間對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

注：數(shù)據(jù)采用spssstatistics17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數(shù)據(jù)后字母不同表示處理間差異顯著。

實(shí)施例3

一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：

(1)獲取花藥外植體：同實(shí)施例1。

(2)將蓖麻花藥外植體置于不同濃度(0～120mg/l)的ba溶液中浸泡10min。

(3)然后將蓖麻花藥外植體放置在無菌吸水紙上吸去多余液體后，小心的接種至無激素ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著ba溶液濃度的增加，蓖麻花藥外植體愈傷組織誘導(dǎo)效率將逐步提高，當(dāng)浸泡處理外植體的濃度為15mg/l時(shí)，外植體愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最大值，為41.25%（表3）。而繼續(xù)提高ba處理液濃度，蓖麻花藥外植體愈傷組織誘導(dǎo)效率將逐步降低。同時(shí)，在采用短期高濃度ba溶液浸泡處理的方法來誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的過程中，還發(fā)現(xiàn)所獲得愈傷組織質(zhì)量較好，體積較大。

表3為ba溶液濃度對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

注：數(shù)據(jù)采用spssstatistics17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數(shù)據(jù)后字母不同表示處理間差異顯著。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與采用傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織相比，采用高濃度ba溶液浸泡處理蓖麻花藥外植體所誘導(dǎo)形成的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著提高（愈傷組織誘導(dǎo)率提高了30.58%），并且所獲得的愈傷組織的質(zhì)量更好，體積更大。因此，采用15mg/lba溶液對(duì)蓖麻花藥外植體進(jìn)行10min的浸泡處理，可以用來達(dá)到獲得數(shù)量更多、質(zhì)量更好的愈傷組織的目的。

實(shí)施例4

一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：

(1)獲取花藥外植體：同實(shí)施例1。

(2)將蓖麻花藥外植體置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。

(3)然后將蓖麻花藥外植體放置在無菌吸水紙上吸去多余液體后，小心的接種至添加了不同濃度的硝普鈉（snp）（0、2、4、8、16和32mg/l）的ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著snp濃度的提高，蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)率也隨著提高，當(dāng)snp濃度為8mg/l時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最大值，為60.37%，比傳統(tǒng)方法提高了49.70%，比經(jīng)過高濃度ba溶液處理后接種至無激素ms培養(yǎng)基上提高了19.12%；但是繼續(xù)提高snp的濃度時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)將會(huì)被抑制，誘導(dǎo)效率將逐步降低。

表4為snp對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

注：數(shù)據(jù)采用spssstatistics17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數(shù)據(jù)后字母不同表示處理間差異顯著。

實(shí)施例5

一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：

(1)獲取花藥外植體：同實(shí)施例1。

(2)將蓖麻花藥外植體置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。

(3)然后將蓖麻花藥外植體放置在無菌吸水紙上吸去多余液體后，小心的接種至添加了不同濃度的銅離子（無水硫酸銅）（0、0.5、1、2、4和8mg/l）的ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著銅離子濃度的提高，蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)率也隨著提高，當(dāng)銅離子濃度為2mg/l時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最大值，為68.36%，比傳統(tǒng)方法提高了57.69%，比經(jīng)過高濃度ba溶液處理后接種至無激素ms培養(yǎng)基上提高了27.11%；；但是繼續(xù)提高銅離子的濃度時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)將會(huì)被抑制，誘導(dǎo)效率將逐步降低。

表5為銅離子對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

注：數(shù)據(jù)采用spssstatistics17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數(shù)據(jù)后字母不同表示處理間差異顯著。

實(shí)施例6

一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：

(1)獲取花藥外植體：同實(shí)施例1。

(2)將蓖麻花藥外植體置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。

(3)然后將蓖麻花藥外植體放置在無菌吸水紙上吸去多余液體后，小心的接種至添加了不同濃度的谷氨酰胺（0、1.5、3、6、12和24mg/l）的ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著gln濃度的提高，蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)率也隨著提高，當(dāng)谷氨酰胺濃度為6mg/l時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最大值，為54.63%，比傳統(tǒng)方法提高了43.96%，比經(jīng)過高濃度ba溶液處理后接種至無激素ms培養(yǎng)基上提高了13.38%；但是繼續(xù)提高谷氨酰胺的濃度時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)將會(huì)被抑制，誘導(dǎo)效率將逐步降低。

表6為谷氨酰胺對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

注：數(shù)據(jù)采用spssstatistics17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數(shù)據(jù)后字母不同表示處理間差異顯著。

實(shí)施例7

一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，步驟(1)和(3)同實(shí)施例2，與實(shí)施例2唯一不同的地方在于步驟(2)采用不同的激素進(jìn)行浸泡，本實(shí)施例包括如下4個(gè)不同的并列處理：處理1為使用15mg/l的tdz溶液浸泡花藥外植體10min；處理2為使用15mg/l的naa溶液浸泡花藥外植體10min；處理3為使用15mg/l的iba溶液浸泡花藥外植體10min；處理4為使用15mg/l的iaa溶液浸泡花藥外植體10min。四種不同處理后的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表7。

表7為不同激素浸泡對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

實(shí)施例8

一種誘導(dǎo)蓖麻花藥外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：

(1)獲取花藥外植體：同實(shí)施例1。

(2)將蓖麻花藥外植體接種在添加不同激素的ms基本培養(yǎng)基上，在室溫為25℃、光照強(qiáng)度為2000lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)愈傷組織。本實(shí)施例包括如下2個(gè)不同的并列處理：處理1使用添加3mg/l的ba+0.2mg/l的naa的ms培養(yǎng)基作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；處理2使用添加2mg/l的ba+2mg/l的2,4-d的ms培養(yǎng)基作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；結(jié)果見表8。

表8為不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

實(shí)施例9

(1)獲取花藥外植體：同實(shí)施例1。

(2)將蓖麻花藥外植體置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。

(3)然后將蓖麻花藥外植體放置在無菌吸水紙上吸去多余液體后，小心的接種至添加不同激素的ms基本培養(yǎng)基上，在室溫為25℃、光照強(qiáng)度為2000lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)愈傷組織。本實(shí)施例包括如下4個(gè)不同的并列處理：處理1為使用添加8mg/l的snp+2mg/l銅離子的ms培養(yǎng)基作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；處理2為使用添加2mg/l銅離子+6mg/l谷氨酰胺的ms培養(yǎng)基作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；處理3為使用添加8mg/l的snp+6mg/l谷氨酰胺的ms培養(yǎng)基作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；處理4為使用添加8mg/l的snp+加2mg/l銅離子+6mg/l谷氨酰胺的ms培養(yǎng)基作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；結(jié)果見表9。

表9為不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

以上實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

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<110>廣東杰士農(nóng)業(yè)科技有限公司

<120>一株植物固氮細(xì)菌djg211及其在提高土壤和植物活力中的應(yīng)用

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