本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種植物的繁殖方法，具體來說是一種金紅茵芋的快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

茵芋屬(skimmiathunb)植物為蕓香科常綠花灌木，世界已知7或8種，分布于喜馬拉雅山至日本，我國有3或4種，產(chǎn)西南部至南部，野生于山林、溪谷、路旁等處。喜溫暖氣候和光照充足的地方，也稍耐陰，喜濕潤、肥沃壤土，不耐寒，園林中常作林緣種植，也可作盆景。除此之外，茵芋還是一種傳統(tǒng)中藥，有鎮(zhèn)痛、抗炎活性等藥效，相關(guān)學(xué)者在茵芋屬的成分、藥理、臨床應(yīng)用等方面做了諸多研究。目前茵芋主要依靠籽播、扦插進(jìn)行繁育。

園藝栽培品種金紅茵芋(skimmiajaponica‘rnbella’)，也稱魯貝拉茵芋、金絲香茵，圓錐花序頂生，小花乳白色極芳香，可提取芳香油。漿果，紅色，秋冬季節(jié)紅果，經(jīng)久不落，深受人們喜愛(圖1)，切枝也是插花高級花材，并且種子可榨油。扦插成活率不到20％，后代容易積累病毒，嚴(yán)重影響觀賞品質(zhì)；用種子進(jìn)行繁殖，后代會出現(xiàn)分離，不能保持母株的優(yōu)良特性，從播種至開花周期較長；國外進(jìn)口種苗價格昂貴。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種金紅茵芋的快速繁殖方法，所述的這種金紅茵芋的快速繁殖方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中，金紅茵芋繁殖慢、籽播、扦插后代不能保持母本優(yōu)良特性的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種金紅茵芋的快速繁殖方法，包括如下步驟：

1)一個將金紅茵芋帶腋芽莖段做為外植體，進(jìn)行表面滅菌的步驟，先用自來水流水沖洗1h～3h，后放置于超凈工作臺上，用質(zhì)量百分比濃度為60％～80％的乙醇浸泡20s～40s，再用質(zhì)量百分比濃度為0.1％～0.2％的升汞滅菌8min～12min，最后用無菌水沖洗3～6次；

2)一個將金紅茵芋無菌外植體進(jìn)行初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的步驟，將步驟a)中經(jīng)滅菌的外植體轉(zhuǎn)入初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d獲得試管苗，所述的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+zt0.05～0.5mg/l+iba0.02～0.05mg/l+ga32～10mg/l；

3)一個將金紅茵芋試管苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)的步驟，將步驟2)誘導(dǎo)出的試管苗，待其逐漸長大，挑選0.5cm高度、顏色嫩綠的試管苗，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，所述的增殖培養(yǎng)基是ms+zt0.5～2mg/l+kt0.05～1mg/l+iba0.02～0.2mg/l，培養(yǎng)30d；

4)一個將金紅茵芋外植體進(jìn)行生根培養(yǎng)的步驟，將增殖培養(yǎng)的試管苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基為1/2ms+iba1.0～2.0mg/l，培養(yǎng)30d；

5)待試管苗的根系長至0.4～0.6cm時，選擇根系發(fā)達(dá)、生長健壯的無菌苗，室內(nèi)開瓶煉苗3d，移栽入混合基質(zhì)中，溫室中馴化45d后，移栽室外，給予肥水管理即可。

進(jìn)一步的，升汞濃度可以為0.1％～0.2％區(qū)間的任一濃度；滅菌時間可以為8min～12min區(qū)間的任一時間。其中0.15％升汞浸泡10min為最佳消毒液處理方式。

進(jìn)一步的，初代培養(yǎng)基中，zt可以為0.05～0.5mg/l區(qū)間的任一濃度；iba可以為0.02～0.05mg/l區(qū)間的任一濃度；ga3可以為2～10mg/l區(qū)間的任一濃度。其中最佳初代培養(yǎng)基為ms+zt0.2mg/l+iba0.04mg/l+ga30.5mg/l，誘導(dǎo)率最高達(dá)85％。

進(jìn)一步的，增殖培養(yǎng)基中，zt可以為0.5～2mg/l區(qū)間的任一濃度；kt可以為0.05～1mg/l區(qū)間的任一濃度；iba可以為0.02～0.2mg/l區(qū)間的任一濃度。其中最佳增殖培養(yǎng)基是ms+zt1.0mg/l+kt0.5mg/l+iba0.1mg/l，培養(yǎng)30d，增殖率最高為3.6，試管苗高度達(dá)2.0cm。

進(jìn)一步的，生根培養(yǎng)基中，iba可以為1.0～2.0mg/l區(qū)間的任一濃度。其中最佳生根培養(yǎng)基為1/2ms+iba1.0mg/l，生根率最高達(dá)90％。

進(jìn)一步的，混合基質(zhì)由泥炭:蛭石:珍珠巖:有機肥組成。其中最佳配比為6:2:1:1(v/v)，移栽成活率可達(dá)80％以上。

本發(fā)明探索了組織培養(yǎng)方式繁殖金紅茵芋，歷時兩年探索，建立了完善的生產(chǎn)技術(shù)體系。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)效果是積極和明顯的。本發(fā)明實現(xiàn)了以下技術(shù)指標(biāo)：(1)繁殖系數(shù)2.5～3.6；(2)生根率85％以上；(3)移栽成活率75％以上。(4)無變異植株。目前已經(jīng)試驗生產(chǎn)了金紅茵芋5000株，株性一致。本發(fā)明建立的繁殖體系，繁育系數(shù)高，不受季節(jié)氣候限制，可周年生產(chǎn)，隨時滿足生產(chǎn)用苗。

附圖說明

圖1是金紅茵芋冬季植株的照片。

圖2是金紅茵芋初代培養(yǎng)的照片。

圖3是金紅茵芋增殖培養(yǎng)的照片。

圖4是金紅茵芋增殖培養(yǎng)的照片。

圖5是金紅茵芋生根種苗的照片。

圖6是金紅茵芋穴盤移栽的照片。

具體實施方式

試驗材料：

金紅茵芋，健壯無病蟲害植株，取帶腋芽莖段做外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件：

除特別說明外，無菌苗于光照條件下培養(yǎng)，光照強度為1500lx～2500lx，光周期10h/d～14h/d，溫度23℃～26℃。

各種培養(yǎng)基的ph調(diào)為5.6～5.9，蔗糖3％～5％，瓊脂0.6～0.8％，分裝后在高壓滅菌鍋中121℃條件下保持16min～20min。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計：

統(tǒng)計數(shù)據(jù)時，每種處理調(diào)查20個，重復(fù)3次，統(tǒng)計誘導(dǎo)率、芽增殖率、生根率和移栽成活率。采用excel2007和spss18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(one-wayanova)和duncan法進(jìn)行多重比較(α＝0.05)。

誘導(dǎo)率＝(出芽外植體數(shù)/接種數(shù))×100％；增殖系數(shù)＝增殖株數(shù)/接種數(shù)；

生根率＝(生根株數(shù)/接種數(shù))×100％；移栽成活率＝(成活數(shù)/移栽數(shù))×100％。

實施例1表面滅菌

1.1取樣

3～5月份，晴朗午后取樣，去枝葉，將莖段剪成2cm長，每節(jié)帶一個腋芽或頂芽。用自來水流水沖洗1h～2h，于超凈工作臺上，先用60％～80％的乙醇浸泡30s～60s，再用不同滅菌劑浸泡不同時間，最后用無菌水沖洗5～6次。篩選最佳滅菌劑和滅菌時間。

1.2不同滅菌時間對外植體存活率的影響

設(shè)定0.15％(質(zhì)量體積比，下同)升汞5個不同滅菌時間6min、8min、10min、12min、15min，比較對外植體成活率的影響，重復(fù)3次。存活率＝存活數(shù)/接種數(shù)×100％。

結(jié)果顯示，使用濃度為0.15％的升汞滅菌，滅菌時間為6min時，外植體全部污染或死亡；12min時雖然有存活的無菌外植體，但由于滅菌時間過長，存活率極低僅為5％。存活率最高的滅菌時間是10min，與其它處理相比，顯著提高到15％(表1)，篩選最佳滅菌時間為10min。

表1升汞的不同滅菌時間對外植體存活率的影響

*表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n＝3)，同列數(shù)字后不同的字母表示0.05水平差異顯著性(p﹤0.05)，以下同。

1.3不同滅菌劑對外植體存活率的影響

用升汞和次氯酸鈉配制6種滅菌劑，分別為0.10％升汞、0.15％升汞、0.20％升汞、5％次氯酸鈉溶液、10％次氯酸鈉溶液和15％次氯酸鈉溶液。滅菌時間均為10min，重復(fù)3次，存活率計算同上。

表2不同滅菌劑對外植體存活率的影響

結(jié)果顯示，當(dāng)升汞濃度為0.10％時，外植體污染嚴(yán)重沒有得到無菌苗；而當(dāng)升汞濃度為0.20％時，外植體又受消毒液毒害全部死亡。與升汞處理效果比較，次氯酸鈉溶液的滅菌效果顯著降低(表2)，最高僅為5％。篩選0.15％升汞為最佳滅菌劑，外植體存活率最高為15％，后期能夠萌發(fā)出無菌苗。

實施例2初代誘導(dǎo)

初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)階段采用ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同激素種類及其不同濃度，具體詳見表4、表5。

初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，zt設(shè)0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/l計6種濃度；iba設(shè)0.01、0.02、0.04、0.05、0.1mg/l計5種濃度梯度；ga3設(shè)0.5、1、2、4、5、6、8、10、12mg/l計8種濃度。

無菌外植體初代培養(yǎng)30d后，結(jié)果顯示，當(dāng)zt濃度為0.05mg/l～0.5mg/l時，外植體都可以萌發(fā)生長，其中濃度為0.2mg/l時，外植體萌發(fā)誘導(dǎo)率達(dá)到60％，并且沒有出現(xiàn)分化現(xiàn)象，有利于后期增殖培養(yǎng)的統(tǒng)計分析；當(dāng)濃度為0.5mg/l及以上時，誘導(dǎo)率雖然達(dá)65％，但培養(yǎng)后期出現(xiàn)分化現(xiàn)象，不利于增殖培養(yǎng)的統(tǒng)計分析。篩選zt0.2mg/l為最佳濃度，與低于此濃度的其它處理比較，差異顯著(表3)。

表3不同zt水平對初代誘導(dǎo)的影響

在培養(yǎng)基ms+zt0.2mg/l的基礎(chǔ)上，添加不同濃度的iba，發(fā)現(xiàn)添加iba對于外植體誘導(dǎo)率沒有明顯影響，但對于外植體的伸長培養(yǎng)影響顯著。培養(yǎng)一個月后，在0.02mg/l～0.05mg/l范圍內(nèi)，伸長明顯，在iba0.04mg/l的培養(yǎng)基中，外植體生長至1cm，基部沒有生根現(xiàn)象；當(dāng)iba濃度到達(dá)0.05mg/l及以上時候，外植體雖然也有伸長，但基部出現(xiàn)生根現(xiàn)象，不利于后期的增殖培養(yǎng)。篩選0.04mg/l為iba的最佳濃度，與低于此濃度的其它處理組比較，伸長情況差異顯著(表4)。

表4不同iba水平對初代誘導(dǎo)的影響

在培養(yǎng)基ms+zt0.2mg/l+iba0.04mg/l的基礎(chǔ)上，添加不同濃度的ga3，發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)外植體的萌發(fā)，利于試管苗的生長。當(dāng)ga3濃度在2mg/l～10mg/l范圍時，誘導(dǎo)率在65％～85％；其中濃度為5mg/l時，誘導(dǎo)率達(dá)到最高為85％(圖2)，與低于此濃度的其它處理比較，差異顯著(表5)，篩選5mg/l為ga3最佳濃度。由此確定ms+zt0.2mg/l+iba0.04mg/l+ga35mg/l為金紅茵芋最佳初代培養(yǎng)基。

表5不同ga3濃度水平對初代誘導(dǎo)的影響

實施例3增殖培養(yǎng)

增殖階段，zt設(shè)為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mg/l計5種濃度；kt設(shè)為0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mg/l計6種濃度；iba設(shè)0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3mg/l計6種濃度；同時添加ga35mg/l。

初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的試管苗，待其逐漸長大，獲得一定量試管苗時，挑選0.5cm高度、顏色嫩綠的試管苗，同批次轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，篩選適宜增殖培養(yǎng)基。結(jié)果顯示，當(dāng)zt濃度為0.5～2mg/l時，增殖系數(shù)都達(dá)到了2以上，其中濃度為1mg/l時，增殖系數(shù)達(dá)到最高為2.4，與其它處理比較，差異顯著(表6)。

表6不同zt濃度對芽增殖的影響

在ms+zt1.0mg/l+iba0.01mg/l培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加不同濃度的kt，觀察不同濃度的kt對試管苗增殖的影響，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計。結(jié)果顯示，在0.05mg/l～1mg/l的范圍內(nèi)，增殖系數(shù)都可以達(dá)到3以上；其中當(dāng)kt濃度為0.5mg/l時，增殖系數(shù)最高達(dá)到3.4，與其它處理比較，差異顯著(表7)；當(dāng)kt濃度達(dá)到1mg/l時，試管苗基部出現(xiàn)愈傷組織，不利于后期生根。

表7不同kt濃度對芽增殖的影響

在ms+zt1.0mg/l+kt0.5mg/l培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加不同濃度的iba，觀察iba濃度對試管苗增殖的影響，培養(yǎng)一個月后統(tǒng)計。結(jié)果顯示，iba對增殖培養(yǎng)沒有明顯影響，但對試管苗的伸長生長影響顯著。在0.02mg/l～0.2mg/l濃度范圍內(nèi)，試管苗高度可以達(dá)到1.1～2.0cm，其中當(dāng)iba濃度為0.1mg/l時，試管苗高度可以達(dá)到2cm，健壯整齊(圖3、4)，與其它處理組比較，伸長生長情況，差異顯著(表8)；當(dāng)濃度達(dá)到0.3mg/l時，試管苗出現(xiàn)生根現(xiàn)象，不利于后期統(tǒng)一生根培養(yǎng)。篩選ms+zt1.0mg/l+kt0.5mg/l+iba0.1mg/l為金紅茵芋試管苗增殖的最佳培養(yǎng)基。

表8不同iba濃度對芽增殖的影響

實施例4生根培養(yǎng)

生根階段，采用1/2ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，iba分別設(shè)0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0mg/l計6種濃度。附加的生長素iba濃度低于2.0mg/l時，生根率隨濃度的增加而增加，產(chǎn)生不定根的時間隨濃度的增加而縮短，當(dāng)超過這一域值時，生根率開始下降，同時產(chǎn)生少量愈傷組織。在1.0mg/l～2.0mg/l濃度范圍內(nèi)，培養(yǎng)15d左右幼苗基部分化出根原基，30d后可以長至2cm～4cm，生根率達(dá)85％以上，葉色濃綠舒展，形成了完整的試管苗；當(dāng)iba濃度為1.0mg/l時，生根率達(dá)到最高90％(圖5)，與其它處理相比較，差異顯著(表9)。切割不定芽進(jìn)行誘根培養(yǎng)時，基部要切除干凈，切口平整，保留2對葉片。

表9不同iba水平對生根的影響

實施例5試管苗移栽

根系長至0.5cm左右時，選擇根系發(fā)達(dá)生長健壯的無菌苗，室內(nèi)開瓶煉苗3d，取出后洗凈根部瓊脂，移栽入混合基質(zhì)中?；旌匣|(zhì)配方為泥炭:蛭石:珍珠巖:有機肥＝6:2:1:1(v/v)，該混合基質(zhì)質(zhì)地輕，透水性和透氣性良好，持水率強，全氮量也較高，營養(yǎng)充足。試管苗在溫室中馴化45d后，即可移栽室外，給予肥水管理。在4月份或者10月份移栽，成活率最高可達(dá)80％(圖6)。

結(jié)論：

本發(fā)明篩選表現(xiàn)優(yōu)良的金紅茵芋品種，進(jìn)行了開發(fā)研究，克服常綠芳香木本離體培養(yǎng)時，啟動困難，分化率低，周期長等諸多問題，建立了完善的快速繁殖技術(shù)，并開始進(jìn)行試驗生產(chǎn)。