本發(fā)明屬于花卉培育技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種野生百合組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
百合在世界觀賞花卉生產(chǎn)中占有重要地位，隨著市場需求量的不斷增加，人們對百合花的品種質(zhì)量要求也越來越高，人們對百合野生品種資源、野生百合的組培繁殖以及試管苗生長發(fā)育做了大量研究，從依靠鱗片扦插由子球培育成母球的傳統(tǒng)的百合種球生產(chǎn)到百合組培快繁。由于百合地下鱗莖數(shù)量多，易于獲得，取材不受季節(jié)限制而成為目前百合組培最主要的外植體材料，但鱗莖生長于地下，帶菌多，使得組培消毒過程中難度加大。
目前百合組培苗的獲得均采用常規(guī)的組織培養(yǎng)方法，但是，在組織培養(yǎng)早期常出現(xiàn)大面積的真菌污染，繼代過程中還會出現(xiàn)內(nèi)生細菌的再次污染，造成了材料的損失，同時浪費了大量的人力物力，故長期以來高污染率是困擾野生百合組織培養(yǎng)的難題。目前，對如何降低野生百合組培過程中的污染率已有相關(guān)研究報道，一方面是對組培過程各環(huán)節(jié)進行嚴格控制，另一方面是使用表面消毒劑對材料進行消毒如抗生素、次氯酸鈉、氯化汞等。但這些消毒劑或達不到很好的污染防控作用，或?qū)Σ牧嫌袀ΣΣ僮魅藛T及環(huán)境有危害。因此，如何尋找一種高效易于操作且污染率小的組織培養(yǎng)技術(shù)，是野生百合組培過程中亟待解決的技術(shù)問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種野生百合組織培養(yǎng)方法。該方法從外植體的選擇和組織培養(yǎng)個階段使用的培養(yǎng)基成分調(diào)整角度出發(fā)，從組織培養(yǎng)的源頭和過程對污染率進行控制，從而減小污染率，且該方法易于操作，簡單易行。
根據(jù)本發(fā)明提供的一種野生百合組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
（1）誘導(dǎo)愈傷組織：取野生百合蒴果，將蒴果切開，選取生長健壯、胚明顯的種子，除去種皮經(jīng)消毒后接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種時控制種子長度的三分之二埋在培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)20-40天后，獲得直徑為0.3-0.5cm的淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織團塊，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)是在完全黑暗、溫度為20-24℃的條件下進行；
所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸0.5-1.3mg/l、α-萘乙酸0.6-1.0mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.1-0.4mg/l、氯化鈉0.1-0.3mg/l、殺菌中草藥粉0.1-2mg/l、葡萄糖20-26g/l、瓊脂6-8g/l，ph值為5.6-5.8；
（2）愈傷組織的繼代培養(yǎng)：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)完成后，接種到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)是在完全黑暗、20-25℃的繼代培養(yǎng)條件下進行；
所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸0.5-1.1mg/l、2，4-d0.6-1.1mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.1-0.3mg/l、氯化鈉0.1-0.2mg/l、殺菌中草藥粉0.1-1.5mg/l、果糖20-25g/l、瓊脂7-9g/l，ph值為5.6-5.8；
（3）愈傷組織的擴增培養(yǎng)：愈傷組織團塊在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4個月后，將愈傷組織團塊分切成0.2-0.5cm的小塊，接種到擴增培養(yǎng)基上，進行弱光培養(yǎng)，弱光培養(yǎng)是指在光照100-700lux、溫度25℃的條件下進行；
所述擴增培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸0.2-1.1mg/l、2，4-d0.3-1.2mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.1-0.3mg/l、氯化鈉0.1-0.3mg/l、殺菌中草藥粉0.1-1.1mg/l、麥芽糖18-27g/l、土豆泥0.2-2g/l、瓊脂6-10g/l，ph值為5.6-5.8。
優(yōu)選地，所述消毒的具體方法為將除去種皮的種子洗凈后置于濃度為5-7%的鹽水中浸洗10-20min，然后用蒸餾水沖洗0.5-1h，再用75％酒精浸泡0.5-2min。
優(yōu)選地，所述中草藥的成分包括金銀花、黃芩、艾草、檳榔、蒲公英。
優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)愈傷組織的操作在超凈工作臺上完成。
優(yōu)選地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)完成后，接種到繼代培養(yǎng)基上之前，在超凈工作臺上用解剖刀切除愈傷組織團塊中褐色部分。
優(yōu)選地，所述愈傷組織的繼代培養(yǎng)過程中，每個裝有繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中接種10-20塊愈傷組織團塊，愈傷組織團塊的直徑為0.2-0.4cm，每4周繼代培養(yǎng)一次。
優(yōu)選地，所述將愈傷組織小塊接種到擴增培養(yǎng)基之前，先接種到含繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，用經(jīng)滅菌后的保錫紙包裹三層后，進行10-20天的低溫處理，低溫處理條件為1-4℃。
優(yōu)選地，所述滅菌是采用紫外線照射進行滅菌。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
本發(fā)明提供的一種野生百合組織培養(yǎng)方法，該方法取野生百合的種子作為野生百合組織培養(yǎng)的外植體，并且外植體經(jīng)過消毒，有效解決了愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中易出現(xiàn)真菌、細菌污染的問題，從源頭降低污染率；作為亮點，該方法在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基、擴增培養(yǎng)基中均加入了殺菌中草藥粉成分，殺菌中草藥以金銀花、黃芩、艾草、檳榔、蒲公英進行合理配伍，上述成分均對植物有不同程度的殺菌、抗病作用。由于各培養(yǎng)基中殺菌中草藥的加入，使得百合百合愈傷組織在一個安全、具有抗病的組織培養(yǎng)環(huán)境中擴增、生長，提高了百合愈傷組織的抗感染能力。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
本實施例提供的一種野生百合組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
（1）誘導(dǎo)愈傷組織：取野生百合蒴果，將蒴果切開，選取生長健壯、胚明顯的種子，除去種皮經(jīng)消毒后接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種時控制種子長度的三分之二埋在培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)40天后，獲得直徑為0.3cm的淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織團塊，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)是在完全黑暗、溫度為24℃的條件下進行，其中，所述消毒的具體方法為將除去種皮的種子洗凈后置于濃度為5%的鹽水中浸洗20min，然后用蒸餾水沖洗0.5h，再用75％酒精浸泡2min，
所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸1.3mg/l、α-萘乙酸0.6mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.4mg/l、氯化鈉0.1mg/l、殺菌中草藥粉2mg/l、葡萄糖20g/l、瓊脂8g/l，ph值為5.6；
（2）愈傷組織的繼代培養(yǎng)：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)完成后，接種到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)是在完全黑暗、25℃的繼代培養(yǎng)條件下進行；
所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg/l、2，4-d1.1mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.1mg/l、氯化鈉0.2mg/l、殺菌中草藥粉0.1mg/l、果糖25g/l、瓊脂7g/l，ph值為5.8；
（3）愈傷組織的擴增培養(yǎng)：愈傷組織團塊在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4個月后，將愈傷組織團塊分切成0.5cm的小塊，接種到擴增培養(yǎng)基上，進行弱光培養(yǎng)，弱光培養(yǎng)是指在光照100lux、溫度25℃的條件下進行，
所述擴增培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸1.1mg/l、2，4-d0.3mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.3mg/l、氯化鈉0.1mg/l、殺菌中草藥粉1.1mg/l、麥芽糖18g/l、土豆泥2g/l、瓊脂6g/l，ph值為5.8。
其中，所述中草藥的成分包括金銀花、黃芩、艾草、檳榔、蒲公英。
其中，所述誘導(dǎo)愈傷組織的操作在超凈工作臺上完成。
其中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)完成后，接種到繼代培養(yǎng)基上之前，在超凈工作臺上用解剖刀切除愈傷組織團塊中褐色部分。
其中，所述愈傷組織的繼代培養(yǎng)過程中，每個裝有繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中接種20塊愈傷組織團塊，愈傷組織團塊的直徑為0.2cm，每4周繼代培養(yǎng)一次。
其中，所述將愈傷組織小塊接種到擴增培養(yǎng)基之前，先接種到含繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，用經(jīng)滅菌后的保錫紙包裹三層后，進行20天的低溫處理，低溫處理條件為1℃。所述滅菌是采用紫外線照射進行滅菌。
實施例2
本實施例提供的一種野生百合組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
（1）誘導(dǎo)愈傷組織：取野生百合蒴果，將蒴果切開，選取生長健壯、胚明顯的種子，除去種皮經(jīng)消毒后接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種時控制種子長度的三分之二埋在培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)20天后，獲得直徑為0.5cm的淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織團塊，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)是在完全黑暗、溫度為20℃的條件下進行，其中，所述消毒的具體方法為將除去種皮的種子洗凈后置于濃度為7%的鹽水中浸洗10min，然后用蒸餾水沖洗1h，再用75％酒精浸泡0.5min，
所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg/l、α-萘乙酸1.0mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.1mg/l、氯化鈉0.3mg/l、殺菌中草藥粉0.1mg/l、葡萄糖26g/l、瓊脂6g/l，ph值為5.8；
（2）愈傷組織的繼代培養(yǎng)：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)完成后，接種到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)是在完全黑暗、20℃的繼代培養(yǎng)條件下進行，
所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸1.1mg/l、2，4-d0.6mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.3mg/l、氯化鈉0.1mg/l、殺菌中草藥粉1.5mg/l、果糖20g/l、瓊脂9g/l，ph值為5.6；
（3）愈傷組織的擴增培養(yǎng)：愈傷組織團塊在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4個月后，將愈傷組織團塊分切成0.2cm的小塊，接種到擴增培養(yǎng)基上，進行弱光培養(yǎng)，弱光培養(yǎng)是指在光照700lux、溫度25℃的條件下進行；
所述擴增培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸0.2mg/l、2，4-d1.2mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.1mg/l、氯化鈉0.3mg/l、殺菌中草藥粉0.1mg/l、麥芽糖27g/l、土豆泥0.2g/l、瓊脂10g/l，ph值為5.6。
其中，所述中草藥的成分包括金銀花、黃芩、艾草、檳榔、蒲公英。
其中，所述誘導(dǎo)愈傷組織的操作在超凈工作臺上完成。
其中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)完成后，接種到繼代培養(yǎng)基上之前，在超凈工作臺上用解剖刀切除愈傷組織團塊中褐色部分。
其中，所述愈傷組織的繼代培養(yǎng)過程中，每個裝有繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中接種10塊愈傷組織團塊，愈傷組織團塊的直徑為0.4cm，每4周繼代培養(yǎng)一次。
其中，所述將愈傷組織小塊接種到擴增培養(yǎng)基之前，先接種到含繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，用經(jīng)滅菌后的保錫紙包裹三層后，進行10天的低溫處理，低溫處理條件為4℃。所述滅菌是采用紫外線照射進行滅菌。
實施例3
本實施例提供的一種野生百合組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
（1）誘導(dǎo)愈傷組織：取野生百合蒴果，將蒴果切開，選取生長健壯、胚明顯的種子，除去種皮經(jīng)消毒后接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種時控制種子長度的三分之二埋在培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)30天后，獲得直徑為0.4cm的淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織團塊，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)是在完全黑暗、溫度為22℃的條件下進行，其中，所述消毒的具體方法為將除去種皮的種子洗凈后置于濃度為6%的鹽水中浸洗15min，然后用蒸餾水沖洗0.8h，再用75％酒精浸泡1.0min，
所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸0.9mg/l、α-萘乙酸0.8mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.3mg/l、氯化鈉0.2mg/l、殺菌中草藥粉0.8mg/l、葡萄糖26g/l、瓊脂7g/l，ph值為5.7；
（2）愈傷組織的繼代培養(yǎng)：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)完成后，接種到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)是在完全黑暗、21℃的繼代培養(yǎng)條件下進行；
所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸0.5-1.1mg/l、2，4-d0.9mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.2mg/l、氯化鈉0.2mg/l、殺菌中草藥粉1.1mg/l、果糖21g/l、瓊脂8g/l，ph值為5.6；
（3）愈傷組織的擴增培養(yǎng)：愈傷組織團塊在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4個月后，將愈傷組織團塊分切成0.4cm的小塊，接種到擴增培養(yǎng)基上，進行弱光培養(yǎng)，弱光培養(yǎng)是指在光照600lux、溫度25℃的條件下進行，
所述擴增培養(yǎng)基配方為：1/2ms、2，4-二氯苯氧乙酸1.1mg/l、2，4-d1.2mg/l、6-芐氨基腺嘌呤0.3mg/l、氯化鈉0.3mg/l、殺菌中草藥粉1.1mg/l、麥芽糖27g/l、土豆泥2g/l、瓊脂7g/l，ph值為5.8。
其中，所述中草藥的成分包括金銀花、黃芩、艾草、檳榔、蒲公英。
其中，所述誘導(dǎo)愈傷組織的操作在超凈工作臺上完成。
其中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)完成后，接種到繼代培養(yǎng)基上之前，在超凈工作臺上用解剖刀切除愈傷組織團塊中褐色部分。
其中，所述愈傷組織的繼代培養(yǎng)過程中，每個裝有繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中接種10-20塊愈傷組織團塊，愈傷組織團塊的直徑為0.3cm，每4周繼代培養(yǎng)一次。
其中，所述將愈傷組織小塊接種到擴增培養(yǎng)基之前，先接種到含繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，用經(jīng)滅菌后的保錫紙包裹三層后，進行12天的低溫處理，低溫處理條件為2℃。所述滅菌是采用紫外線照射進行滅菌。
實驗測試：
實驗材料：選擇長勢相當(dāng)?shù)纳L健壯的野生百合蒴果；
實驗處理：將野生百合蒴果分成均等分的4組，其中，第1組、第2組、第3組，采用本實施例1-3的方法進行組織培養(yǎng)，第4組采用常規(guī)的方法進行組織培養(yǎng)，統(tǒng)計污染情況；
結(jié)果顯示：其中，第1組、第2組、第3組無污染，第4組的污染率為10%。由此可見，本發(fā)明的野生百合組織培養(yǎng)方法，降低了污染率。
以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。