本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種黃石斛種苗組織培養(yǎng)快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

黃石斛（dendrobiumtosaensemakino）屬于蘭科石斛屬，僅產(chǎn)于我國江西、廣東、臺灣地區(qū)及日本等地，常被誤認為鐵皮石斛，在日本和我國臺灣地區(qū)已被作為中藥材廣泛應(yīng)用，產(chǎn)量比鐵皮石斛產(chǎn)量高，具有抗腫瘤、抗衰老、增強人體免疫力及擴張血管等作用；同時，黃石斛花朵黃綠色，具有較高的觀賞價值，可應(yīng)用于盆栽觀賞，具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于黃石斛種源稀缺，嚴重地制約了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前世界上還沒有黃石斛種苗繁殖專利和文獻報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種黃石斛種苗組織培養(yǎng)快速繁殖方法。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種黃石斛種苗組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括下列步驟：

第一步：在超凈工作臺上，將外植體切除葉片后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用無菌水沖洗，接下來再用升汞溶液消毒，然后再用無菌水沖洗；然后接種到外植體培養(yǎng)基上；其中：所述外植體培養(yǎng)基為改良ms培養(yǎng)基，在改良ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加3.0-5.0毫克/升6-芐基腺嘌呤、3.0-5.0毫克/升激動素、1.0-2.0毫克/升萘乙酸以及改進ms培養(yǎng)基質(zhì)量的10-20%的椰子汁，所述改良ms培養(yǎng)基為大量元素減半的ms培養(yǎng)基；

第二步：接種后每隔35-45天更換所述外植體培養(yǎng)基一次，至第5次時開始將所述外植體培養(yǎng)基中的6-芐基腺嘌呤和激動素濃度均降至1.5－2.5毫克/升，培養(yǎng)得到叢生芽；

第三步：將第二步培養(yǎng)得到的叢生芽切割成單個芽，然后接種到生根壯苗培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，得到完整植株；所述生根壯苗培養(yǎng)基為改進ms培養(yǎng)基，在改進ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.5-1.0毫克/升的萘乙酸、0.5-1.0毫克/升的吲哚丁酸、50-150克/升的香蕉汁、0.5-1.0克/升的活性炭，所述改進ms培養(yǎng)基為1/2ms培養(yǎng)基；

第四步：將完整植株轉(zhuǎn)移到具有自然光的溫室中煉苗10-15天，然后洗凈根部的培養(yǎng)基，接下來用苔蘚包裹所述完整植株的根系，然后以苔蘚為基質(zhì)種植進行培養(yǎng)。

優(yōu)選的技術(shù)方案為：所述外植體為黃石斛當年生嫩芽。

優(yōu)選的技術(shù)方案為：所述黃石斛當年生嫩芽在作為外植體之前，先用500-800倍的多菌靈澆灌一次黃石斛，并且用500-800倍的多菌靈噴施葉片；一星期之后再用72%的農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3000-4000倍液澆灌一次黃石斛，并用72%的農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3000-4000倍液噴施葉片，然后兩周內(nèi)重復(fù)一次。

優(yōu)選的技術(shù)方案為：接種前用消過毒的解剖刀切取長度2-4厘米的黃石斛側(cè)芽為外植體。

優(yōu)選的技術(shù)方案為：將外植體用體積濃度為70-80%的酒精浸泡30-60秒。

優(yōu)選的技術(shù)方案為：所述升汞溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.1%。

優(yōu)選的技術(shù)方案為：所述苔蘚使用之前用水浸泡24-48小時。

上述技術(shù)方案中：所述ms培養(yǎng)基是murashige和skoog于1962年為煙草細胞培養(yǎng)設(shè)計的，其特點是無機鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基?；诖耍@種培養(yǎng)基就用他們的名字來命名了。大量元素是指：nh4no3、kno3、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、kh2po4。

由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點是：

本發(fā)明采用一年生嫩芽進行組織培養(yǎng)繁殖，具有繁殖速度快、種苗品質(zhì)優(yōu)良、后代性狀統(tǒng)一等特點，只需要簡單的組織培養(yǎng)設(shè)備就可以完成。

具體實施方式

以下對本發(fā)明之實施方式做更詳細的說明，使熟悉該項技藝者在閱讀本說明書后能據(jù)以實施。

本文中使用的術(shù)語的目的僅在于說明特別實施例，并不意圖對本發(fā)明做限制。除非上下文明確顯示，否則本文中使用的單數(shù)形式“一”、“一個”、“該”亦旨在包括復(fù)數(shù)形式。

在說明較佳實施例時，可能基于清楚的目的而使用特別的術(shù)語；然而，本說明書所揭露者并不意圖被限制在所選擇的該特別術(shù)語；并且應(yīng)當理解，每一個特定元件包括具有相同功能、以相似方式操作并達成相似效果的所有等效技術(shù)。

實施例1：一種黃石斛種苗組織培養(yǎng)快速繁殖方法

（1）材料選擇和處理

選擇植株生長健壯、生長勢強的黃石斛當年生嫩芽為外植體。在切取外植體28天前，先用500倍的多菌靈澆灌一次并噴施葉片，一星期后再用72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑4000倍澆灌一次并噴施葉片。然后兩周內(nèi)重復(fù)上述步驟。接種前用75%酒精消過毒的解剖刀切取長度2厘米的側(cè)芽為外植體。

（2）外植體消毒

在超凈工作臺上將切下的外植體切除葉片，先用70%酒精中浸泡10秒后，用0.1%升汞溶液消毒5分鐘，無菌水沖洗４次，再用0.1%升汞溶液消毒4分鐘，無菌水沖洗４次。接種到外植體培養(yǎng)基，所述外植體培養(yǎng)基為改良ms培養(yǎng)基，在改良ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加3.0毫克/升6-芐基腺嘌呤、3.0毫克/升激動素、1.0毫克/升萘乙酸（即每升改進ms培養(yǎng)基添加1毫克的萘乙酸）以及改進ms培養(yǎng)基質(zhì)量的10%的椰子汁，所述改良ms培養(yǎng)基為大量元素減半的ms培養(yǎng)基；消毒成功率70%。

（3）不定芽誘導(dǎo)和增殖

接種后培養(yǎng)30天外植體莖節(jié)上形成不定芽。以后每隔45天在和初代培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上繼代一次，至第4代時，增殖系數(shù)可達到4.0倍。第5代開始可將培養(yǎng)基中的6-芐基腺嘌呤（6-ba）和激動素（kt）濃度均降至1.5毫克/升，繼續(xù)增殖，增殖系數(shù)可維持在4.0倍。

（5）生根壯苗培養(yǎng)

叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個芽，接種到生根壯苗培養(yǎng)基上進行生根壯苗培養(yǎng)。40天左右能形成株高4厘米的帶根的完整植株。所述生根壯苗培養(yǎng)基為改進ms培養(yǎng)基，在改進ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.5毫克/升的萘乙酸、0.5毫克/升的吲哚丁酸、50克/升的香蕉汁、0.5克/升的活性炭，所述改進ms培養(yǎng)基為1/2ms培養(yǎng)基（ms培養(yǎng)基均減半）。

（6）試管苗移栽

春季和秋季是試管苗出瓶的適宜時期，將具4厘米高完整植株將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到具自然光的溫室中煉苗10天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入用水浸泡24小時的進口苔蘚為基質(zhì)，種植時將苔蘚的水分擰干，包裹根系基地種植于穴盤中，保持適當通風(fēng)和足夠的濕度，移栽的成活率均可達90%。

基質(zhì)含蔗糖含量20克/升，ph5.6，瓊脂7g/l，在實驗中所采用的培養(yǎng)溫度24℃，光照度1500lx，光照12小時/天。

實施例2:一種黃石斛種苗組織培養(yǎng)快速繁殖方法

（1）材料選擇和處理

選擇植株生長健壯、生長勢強的黃石斛當年生嫩芽為外植體。在切取外植體28天前，先用600倍的多菌靈澆灌一次并噴施葉片，一星期后再用72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑3500倍澆灌一次并噴施葉片。然后兩周內(nèi)重復(fù)上述步驟。接種前用75%酒精消過毒的解剖刀切取長度3厘米的側(cè)芽為外植體。

（2）外植體消毒

在超凈工作臺上將切下的外植體切除葉片，先用75%酒精中浸泡20秒后，用0.1%升汞溶液消毒7.5分鐘，無菌水沖洗５次，再用0.1%升汞溶液消毒5分鐘，無菌水沖洗5次。接種到外植體培養(yǎng)基，所述外植體培養(yǎng)基為改良ms培養(yǎng)基，在改良ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加4.0毫克/升6-芐基腺嘌呤、4.0毫克/升激動素、1.5毫克/升萘乙酸（即每升改進ms培養(yǎng)基添加1.5毫克的萘乙酸）以及改進ms培養(yǎng)基質(zhì)量的15%的椰子汁，所述改良ms培養(yǎng)基為大量元素減半的ms培養(yǎng)基；消毒成功率80%。

（3）不定芽誘導(dǎo)和增殖

接種后培養(yǎng)28天外植體莖節(jié)上形成不定芽。以后每隔40天在和初代培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上繼代一次，至第4代時，增殖系數(shù)可達到4.5倍。第5代開始可將培養(yǎng)基中的6-ba和kt濃度均降至2.0毫克/升，繼續(xù)增殖，增殖系數(shù)可維持在4.5倍。

（5）生根壯苗培養(yǎng)

叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個芽，接種到生根壯苗培養(yǎng)基上進行生根壯苗培養(yǎng)。40天左右能形成株高5厘米的帶根的完整植株。所述生根壯苗培養(yǎng)基為改進ms培養(yǎng)基，在改進ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.75毫克/升的萘乙酸、0.75毫克/升的吲哚丁酸、100克/升的香蕉汁、0.75克/升的活性炭，所述改進ms培養(yǎng)基為1/2ms培養(yǎng)基（ms培養(yǎng)基均減半）。

（6）試管苗移栽

春季和秋季是試管苗出瓶的適宜時期，將具5厘米高完整植株將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到具自然光的溫室中煉苗13天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入用水浸泡48小時的進口苔蘚為基質(zhì)，種植時將苔蘚的水分擰干，包裹根系基地種植于穴盤中，保持適當通風(fēng)和足夠的濕度，移栽的成活率均可達95%。

基質(zhì)含蔗糖含量25克/升，ph5.8，瓊脂6.5g/l，在實驗中所采用的培養(yǎng)溫度26℃，光照度1800lx，光照14小時/天。

實施例3:一種黃石斛種苗組織培養(yǎng)快速繁殖方法

（1）材料選擇和處理

選擇植株生長健壯、生長勢強的黃石斛當年生嫩芽為外植體。在切取外植體28天前，先用800倍的多菌靈澆灌一次并噴施葉片，一星期后再用72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑4000倍澆灌一次并噴施葉片。然后兩周內(nèi)重復(fù)上述步驟。接種前用75%酒精消過毒的解剖刀切取長度4厘米的側(cè)芽為外植體。

（2）外植體消毒

在超凈工作臺上將切下的外植體切除葉片，先用80%酒精中浸泡30秒后，用0.1%升汞溶液消毒10分鐘，無菌水沖洗6次，再用0.1%升汞溶液消毒6分鐘，無菌水沖洗6次。接種到外植體培養(yǎng)基，所述外植體培養(yǎng)基為改良ms培養(yǎng)基，在改良ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5.0毫克/升6-芐基腺嘌呤、5.0毫克/升激動素、2.0毫克/升萘乙酸（即每升改進ms培養(yǎng)基添加2毫克的萘乙酸）以及改進ms培養(yǎng)基質(zhì)量的20%的椰子汁，所述改良ms培養(yǎng)基為大量元素減半的ms培養(yǎng)基；消毒成功率80%。

（3）不定芽誘導(dǎo)和增殖

接種后培養(yǎng)25天外植體莖節(jié)上形成不定芽。以后每隔35天在和初代培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上繼代一次，至第4代時，增殖系數(shù)可達到5.0倍。第5代開始可將培養(yǎng)基中的6-ba和kt濃度均降至2.5毫克/升，繼續(xù)增殖，增殖系數(shù)可維持在5.0倍。

（5）生根壯苗培養(yǎng)

叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個芽，接種到生根壯苗培養(yǎng)基上進行生根壯苗培養(yǎng)。40天左右能形成株高6厘米的帶根的完整植株。所述生根壯苗培養(yǎng)基為改進ms培養(yǎng)基，在改進ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1毫克/升的萘乙酸、1毫克/升的吲哚丁酸、150克/升的香蕉汁、1克/升的活性炭，所述改進ms培養(yǎng)基為1/2ms培養(yǎng)基（ms培養(yǎng)基均減半）。

（6）試管苗移栽

春季和秋季是試管苗出瓶的適宜時期，將具6厘米高完整植株將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到具自然光的溫室中煉苗15天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入用水浸泡72小時的進口苔蘚為基質(zhì)，種植時將苔蘚的水分擰干，包裹根系基地種植于穴盤中，保持適當通風(fēng)和足夠的濕度，移栽的成活率均可達98%。

基質(zhì)含蔗糖含量30克/升，ph6.0，瓊脂6g/l，在實驗中所采用的培養(yǎng)溫度28℃，光照度2000lx，光照16小時/天。

實施例4:一種黃石斛種苗組織培養(yǎng)快速繁殖方法

一種黃石斛種苗組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括下列步驟：

第一步：在超凈工作臺上，將外植體切除葉片后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用無菌水沖洗，接下來再用升汞溶液消毒，然后再用無菌水沖洗；然后接種到外植體培養(yǎng)基上；其中：所述外植體培養(yǎng)基為改良ms培養(yǎng)基，在改良ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加4.2毫克/升6-芐基腺嘌呤、3.8毫克/升激動素、1.5毫克/升萘乙酸以及改進ms培養(yǎng)基質(zhì)量的13%的椰子汁，所述改良ms培養(yǎng)基為大量元素減半的ms培養(yǎng)基；

第二步：接種后每隔35天更換所述外植體培養(yǎng)基一次，至第5次時開始將所述外植體培養(yǎng)基中的6-芐基腺嘌呤和激動素濃度均降至1.55毫克/升，培養(yǎng)得到叢生芽；

第三步：將第二步培養(yǎng)得到的叢生芽切割成單個芽，然后接種到生根壯苗培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，得到完整植株；所述生根壯苗培養(yǎng)基為改進ms培養(yǎng)基，在改進ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.7毫克/升的萘乙酸、0.6毫克/升的吲哚丁酸、98克/升的香蕉汁、0.7克/升的活性炭，所述改進ms培養(yǎng)基為1/2ms培養(yǎng)基；

第四步：將完整植株轉(zhuǎn)移到具有自然光的溫室中煉苗10天，然后洗凈根部的培養(yǎng)基，接下來用苔蘚包裹所述完整植株的根系，然后以苔蘚為基質(zhì)種植進行培養(yǎng)。

優(yōu)選的實施方式為：所述外植體為黃石斛當年生嫩芽。

優(yōu)選的實施方式為：所述黃石斛當年生嫩芽在作為外植體之前，先用600倍的多菌靈澆灌一次黃石斛，并且用500倍的多菌靈噴施葉片；一星期之后再用72%的農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3000倍液澆灌一次黃石斛，并用72%的農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3000倍液噴施葉片，然后兩周內(nèi)重復(fù)一次。

優(yōu)選的實施方式為：接種前用消過毒的解剖刀切取長度4厘米的黃石斛側(cè)芽為外植體。

優(yōu)選的實施方式為：將外植體用體積濃度為72%的酒精浸泡38秒。

優(yōu)選的實施方式為：所述升汞溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.1%。

優(yōu)選的實施方式為：所述苔蘚使用之前用水浸泡28小時。

以上所述者僅為用以解釋本發(fā)明之較佳實施例，并非企圖具以對本發(fā)明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之發(fā)明精神下所作有關(guān)本發(fā)明之任何修飾或變更，皆仍應(yīng)包括在本發(fā)明意圖保護之范疇。