本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及1-甲基環(huán)丙烯在抑制蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蘋果輪紋病為我國(guó)蘋果產(chǎn)區(qū)主要病害，其致病菌為葡萄座腔菌botryosphaeriadothidea。該病菌在世界范圍內(nèi)均有分布，寄主廣泛，包括梨、葡萄、桃、櫻桃、獼猴桃、柿、梅、橡、扁桃、楊樹等。病菌侵染枝條能夠形成枝條能夠引起枝條頂腐病、潰瘍病、粗皮病、干腐病，而在美國(guó)、韓國(guó)等國(guó)，輪紋病菌侵染蘋果果實(shí)能夠造成白腐病(美國(guó)、韓國(guó))、輪紋病(中國(guó))，核果類果樹上的流膠病也與該病菌侵染有關(guān)。

蘋果輪紋病在我國(guó)環(huán)渤海灣蘋果產(chǎn)區(qū)(遼寧、山東、河南、河北)發(fā)病尤為嚴(yán)重，而在陜西、甘肅等原來(lái)發(fā)病較輕的地區(qū)，隨帶菌苗木擴(kuò)散及樹齡老化，輪紋病發(fā)病呈逐年增加趨勢(shì)。該病原菌以侵染枝干和果實(shí)為主。侵染枝條后，形成以皮孔為中心，扁圓形或不規(guī)則的紅褐色病斑，中心呈瘤狀突起，邊緣開(kāi)裂，經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，形成枝干粗皮病，擴(kuò)展至木質(zhì)部，阻斷樹干樹皮上下養(yǎng)分、水分的疏導(dǎo)和運(yùn)輸，嚴(yán)重削弱樹勢(shì)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死樹死枝；侵染果實(shí)后，形成以皮孔為中心，深、淺褐色相間的同心輪紋，向周圍擴(kuò)展，致使果實(shí)迅速腐爛,失去食用價(jià)值。蘋果輪紋病也是果實(shí)儲(chǔ)藏期間的重要病害。

研發(fā)篩選具有殺菌抑菌功能的有效藥劑，探索針對(duì)該病菌的有效防控方法，一直是科研工作者努力的研究方向。在國(guó)內(nèi)，浙江大學(xué)李紅葉教授等很早就篩選對(duì)比了7種殺菌劑對(duì)該病菌的菌絲生長(zhǎng)等抑菌效果，目前，生產(chǎn)上缺乏高效、低毒、安全、環(huán)保、無(wú)污染的有效藥劑來(lái)抑制由該病菌在蘋果果實(shí)上導(dǎo)致的腐爛。

1-甲基環(huán)丙烯(1-mcp，英文名字：1-methylcyclopropene)是果蔬采后儲(chǔ)藏加工過(guò)程中具有重要應(yīng)用的保鮮劑，在保持果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)、延緩衰老延長(zhǎng)貨架期等方面具有重要作用。研究表明，儲(chǔ)前1-mcp處理，能夠降低由蘋果炭疽病菌、灰霉病病菌及青霉菌造成的蘋果果實(shí)腐爛。但是，對(duì)1-mcp在由葡萄座腔菌botryosphaeriadothidea造成的蘋果果實(shí)腐爛中的作用，國(guó)內(nèi)外尚未有研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供1-mcp的用途。

本發(fā)明提供了1-mcp在如下1)-7)中至少一種中的應(yīng)用：

1)防治蘋果果實(shí)輪紋??；

2)抑制由輪紋病誘導(dǎo)的蘋果果實(shí)腐爛；

3)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯合成；

4)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)；

5)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯受體相關(guān)基因的表達(dá)；

6)提高輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)中抗病基因的表達(dá)；

7)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)中與果實(shí)軟化相關(guān)基因的表達(dá)。

上述應(yīng)用中，所述1-mcp在防治或抑制中所用的濃度大于等于1.4μl/l；

具體的，所述1-mcp在防治或抑制中所用的濃度大于等于72.2μl/l。

上述應(yīng)用中，所述蘋果果實(shí)為發(fā)育期果實(shí)或成熟期果實(shí)或儲(chǔ)藏期果實(shí)。

上述應(yīng)用中，所述1-mcp防治蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病是通過(guò)如下至少一種實(shí)現(xiàn)：

1)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯合成；

2)提高輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)中抗病基因的表達(dá)；

3)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)中與果實(shí)軟化相關(guān)基因的表達(dá)。

上述應(yīng)用中，所述抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯合成是通過(guò)如下a)和/或b)體現(xiàn)：

a)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)；

b)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯受體相關(guān)基因的表達(dá)。

上述應(yīng)用中，所述乙烯合成相關(guān)基因?yàn)閙daco1和/或mdacs5b；

所述乙烯受體相關(guān)基因?yàn)閙ders2、mders1和/或mdetr2；

所述抗病基因?yàn)閙dpr4、mdpr5、mdpr8和/或mdchib-1；

所述與果實(shí)軟化相關(guān)基因?yàn)閙dpg1。

上述應(yīng)用中，所述輪紋病的病原菌為葡萄座腔菌botryosphaeriadothidea。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種具有如下1)-7)至少一種功能的產(chǎn)品。

本發(fā)明提供了一種具有如下1)-7)至少一種功能的產(chǎn)品，其活性成分為1-mcp；

1)防治蘋果果實(shí)輪紋??；

2)抑制由輪紋病誘導(dǎo)的蘋果果實(shí)腐爛；

3)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯合成；

4)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)；

5)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)乙烯受體相關(guān)基因的表達(dá)；

6)提高輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)中抗病基因的表達(dá)；

7)抑制輪紋病菌誘導(dǎo)下蘋果果實(shí)中與果實(shí)軟化相關(guān)基因的表達(dá)。

本發(fā)明第3個(gè)目的是提供一種防治蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將1-mcp作用在蘋果果實(shí)所在環(huán)境中，實(shí)現(xiàn)防治蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病。

上述方法中，所述1-mcp在所述環(huán)境的濃度大于等于1.4μl/l；

具體的，所述1-mcp在所述環(huán)境的濃度大于等于72.2μl/l；

或所述蘋果果實(shí)為發(fā)育期果實(shí)或成熟期果實(shí)或儲(chǔ)藏期果實(shí)。

上述果實(shí)發(fā)育期(7月)、成熟期(10月)及采后儲(chǔ)藏期(12月)，蘋果為易感品種富士蘋果果實(shí)。

綜上所述，本發(fā)明以不同發(fā)育時(shí)期，處于不同生理狀態(tài)的蘋果果實(shí)為試材，采用病菌人工接種的方式，

(1)首先發(fā)現(xiàn)1-mcp具有抑制蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病的作用；濃度為34.2ppm及其以上抑制蘋果果實(shí)輪紋病菌侵染造成的腐爛。

(2)進(jìn)一步證明1-mcp是通過(guò)抑制果實(shí)中乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而抑制輪紋病菌侵染造成的蘋果果實(shí)發(fā)??；

(3)更進(jìn)一步證明，乙烯在輪紋病菌侵染過(guò)程中，第一：在輪紋病菌侵染過(guò)程中，乙烯抑制了蘋果果實(shí)中抗病相關(guān)基因的表達(dá)水平，而且通過(guò)抑制mapk免疫信號(hào)途徑來(lái)抑制蘋果病程相關(guān)基因表達(dá)；第二：乙烯促進(jìn)了細(xì)胞壁降解與崩潰的基因mdpg1表達(dá)，促進(jìn)了果實(shí)腐爛。而1-mcp通過(guò)抑制乙烯提高抗病基因表達(dá)水平以提高蘋果抗性，一方面抑制mdpg1表達(dá)以促進(jìn)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整。

本研究所發(fā)現(xiàn)的1-mcp具有抑制蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病的作用及其原理，在國(guó)內(nèi)外均屬首次報(bào)道。1-mcp這一功能的發(fā)現(xiàn)，不僅為針對(duì)輪紋病引起的蘋果果實(shí)腐爛的有效防治策略的研發(fā)，提供了新的方向與思路，也為應(yīng)用基因工程改造的方法提高果實(shí)及樹體對(duì)輪紋病的抗性提供了切入點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為1-mcp抑制蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病。

圖2為1-mcp抑制由輪紋病菌侵染所誘導(dǎo)的蘋果果實(shí)乙烯合成及其關(guān)鍵基因表達(dá)。

圖3為1-mcp抑制由輪紋病菌侵染所誘導(dǎo)的蘋果果實(shí)乙烯受體相關(guān)基因表達(dá)。

圖4為1-mcp提高由輪紋病菌侵染所誘導(dǎo)的蘋果果實(shí)抗病相關(guān)基因表達(dá)。

圖5為1-mcp抑制由輪紋病菌侵染所誘導(dǎo)的蘋果果實(shí)軟化基因mdpg1表達(dá)。

圖6為外源乙烯促進(jìn)蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病。

圖7為外源乙烯抑制由輪紋病菌侵染所誘導(dǎo)的蘋果抗病相關(guān)基因表達(dá)。

圖8為外源乙烯抑制由輪紋病菌侵染所誘導(dǎo)的蘋果免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑mapk激活。

圖9為外源乙烯提高由輪紋病菌侵染所誘導(dǎo)的蘋果果實(shí)軟化基因mdpg1表達(dá)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

實(shí)施例1、1-mcp在防治蘋果果實(shí)輪紋病中的應(yīng)用

一、葡萄座腔菌botryosphaeriadothidea培養(yǎng)

所使用菌株為葡萄座腔菌botryosphaeriadothideano.040301記載在如下文獻(xiàn)中，張高雷等，蘋果輪紋病病瘤組織研究,植物病理學(xué)報(bào)2011,41(1):98－101。

菌株于4℃保藏于pda培養(yǎng)基上。使用前，將該菌株重新接種于新配制的pda培養(yǎng)板上，28℃，恒溫暗中培養(yǎng)9-10天，備用。

二、待接菌蘋果果實(shí)準(zhǔn)備

本研究選取三個(gè)不同時(shí)期，即發(fā)育期(7月)、成熟期(10月)與儲(chǔ)藏期(12月)的富士蘋果果實(shí)(發(fā)育期、成熟期蘋果果實(shí)采摘自山東省泰安市果園，儲(chǔ)藏期果實(shí)購(gòu)買自山東省泰安市超市冷庫(kù))為研究對(duì)象。

發(fā)育期與成熟期蘋果果實(shí)從果園采摘后，進(jìn)行無(wú)菌水清洗以去除泥漬等果面附著物，經(jīng)0.1％次氯酸鈉消毒、無(wú)菌水沖洗、晾干后，放置8小時(shí)，待接菌；

儲(chǔ)藏期果實(shí)為從商場(chǎng)中購(gòu)買，取自冷庫(kù)中的蘋果果實(shí)，置于室溫下，經(jīng)0.1％次氯酸鈉消毒、無(wú)菌水沖洗、晾干后，放置8小時(shí)，然后進(jìn)行接菌處理。

三、蘋果果實(shí)的輪紋病菌接種和1-mcp聯(lián)合處理

1、接種輪紋病菌的方法

以傷口接種方式將上述1得到的葡萄座腔菌botryosphaeriadothideano.040301接種于蘋果果實(shí)：取一無(wú)菌牙簽，在待接菌蘋果果實(shí)表面扎孔，孔徑大小直徑為1.5mm，將被扎孔蘋果果實(shí)置于28℃恒溫放置8小時(shí)，再將pda培養(yǎng)板上收集的0.02g葡萄座腔菌botryosphaeriadothideano.040301菌絲體置入小孔，然后將接菌的蘋果果實(shí)放入2l玻璃燒杯中，膠帶封口，于28℃恒溫，避光，發(fā)病。

2、1-mcp的計(jì)量

下面1-mcp所使用的計(jì)量單位，1表示1個(gè)濃度單位。

1個(gè)濃度單位定義為：將0.02克固化有1-mcp的環(huán)糊精固體粉末(1-mcp為氣體，固化于環(huán)糊精上，有效成分含量為3.3％)，溶解于2ml水，放置于2l的燒杯中，所釋放的1-mcp氣體的濃度為144.3μl/l。

1表示一個(gè)濃度單位；0.5表示為0.5個(gè)濃度單位；0.1表示為0.1個(gè)濃度單位；0.01表示為0.01個(gè)濃度單位。

1-mcp購(gòu)自山東省營(yíng)養(yǎng)源食品科技有限公司，有效成分含量3.3％。

該產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)為：0.212mg含量為3.3％的1-mcp粉，溶解到10ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的naoh溶液，于200ml頂空瓶中，室溫密閉釋放30分鐘，實(shí)測(cè)1-mcp氣體濃度為15.3μl/l。

3、接菌和1-mcp聯(lián)合處理具體分為如下幾組：

本研究設(shè)置4個(gè)1-mcp濃度梯度，為1、0.5、0.1、0.01濃度單位，1-mcp為氣體，分別對(duì)應(yīng)氣體濃度為：144.3μl/l、72.2μl/l、14.4μl/l、1.4μl/l。

分為如下6組：

bd+1-mcp0.01組：將上述二得到的待接種蘋果果實(shí)接種輪紋病菌后放入2l的密閉燒杯中，立即放入0.01個(gè)濃度單位的1-mcp(1.4μl/l)，膠帶封口，于28℃恒溫，避光，發(fā)病。

bd+1-mcp0.1組：將上述二得到的待接種蘋果果實(shí)接種輪紋病菌后放入2l的密閉燒杯中，立即放入0.1個(gè)濃度單位的1-mcp(14.4μl/l)，膠帶封口，于28℃恒溫，避光，發(fā)病。

bd+1-mcp0.5組：將上述二得到的待接種蘋果果實(shí)接種輪紋病菌后放入2l的密閉燒杯中，立即放入0.5個(gè)濃度單位的1-mcp(72.2μl/l)，膠帶封口，于28℃恒溫，避光，發(fā)病。

bd+1-mcp1組：將上述二得到的待接種蘋果果實(shí)接種輪紋病菌后放入2l的密閉燒杯中，立即放入1個(gè)濃度單位的1-mcp(144.3μl/l)，膠帶封口，于28℃恒溫，避光，發(fā)病。

bd組(單獨(dú)病菌接種組)：將上述二得到的待接種蘋果果實(shí)接種輪紋病菌后立即放入2l玻璃燒杯中，膠帶封口，于28℃恒溫，避光，發(fā)病。

ctrl組(對(duì)照組)：將上述二得到的待接種蘋果果實(shí)不接菌放入2l的燒杯中，膠帶封口，于28℃恒溫，避光，保存。

以病斑直徑作為果實(shí)輪紋病發(fā)病程度的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)加入和未加入1-mcp處理的蘋果果實(shí)發(fā)病程度。每組病斑測(cè)量數(shù)目為24個(gè)，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。根據(jù)方差分析計(jì)算處理組間病斑大小差異的顯著水平。

接種后不同時(shí)間的果實(shí)輪紋病發(fā)病圖如圖1a所示(i為發(fā)育期，ii為成熟期，iv為儲(chǔ)藏期)，可以看出，與單獨(dú)病菌接種組相比，bd+1-mcp1組的病斑直徑減少，表明，1-mcp顯著抑制蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病。接種后4天的果實(shí)病斑統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1b所示，可以看出，1-mcp抑制蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病具有濃度依賴性。

7月份的蘋果果實(shí)，輪紋病菌單獨(dú)接菌4天后，病斑直徑擴(kuò)展為2.6厘米；而接菌且在分別含有濃度為0.5和11-mcp氣體的密閉燒杯中4天后，病斑直徑分別為1.6厘米、1.3厘米。與單獨(dú)接菌處理相比，差異為極顯著(p<0.01,lsd0.01＝0.57)(圖1.b(i)、圖1.a(i))。1-mcp顯著抑制了輪紋病病斑擴(kuò)展。(病斑大小分別為單獨(dú)接菌處理的61.1％、50.6％)。

10月份蘋果果實(shí)，輪紋病菌單獨(dú)接菌4天后，病斑直徑為3.2厘米；而在接菌且在分別含有濃度為0.5和11-mcp氣體的密閉燒杯中4天后，病斑直徑分別為2.0厘米、1.2厘米，與單獨(dú)接菌處理，差異表現(xiàn)為極顯著(p<0.01,lsd0.01＝0.65)，1-mcp同樣抑制了病菌在成熟果實(shí)上的發(fā)病(圖1.b(ii)、圖1.a(ii))。(病斑大小分別為單獨(dú)接菌處理的62.7％、37.3％)。

儲(chǔ)藏果實(shí)發(fā)病對(duì)1-mcp處理最為敏感(圖1.a)。儲(chǔ)藏果實(shí)中，接菌4天后，病斑直徑達(dá)到4.2厘米；儲(chǔ)藏果實(shí)對(duì)，在接菌且在分別含有濃度為0.011-mcp氣體的密閉燒杯中4天后，病斑大小為2.8厘米，與單獨(dú)接菌相比差異極顯著，隨1-mcp濃度升高，病斑擴(kuò)展進(jìn)一步被抑制，在0.1、0.5、1時(shí)，病斑大小直徑分別為1.9厘米、1.5厘米、1.1厘米(p<0.01,lsd0.01＝0.64)(圖1.a(iii)、圖1.b(iii))。(最小病斑直徑為單獨(dú)接菌處理的36.1％、26.5％)。

上述結(jié)果表明，1-mcp濃度為72.2μl/l以上，能夠顯著抑制蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病，而對(duì)于儲(chǔ)藏期間的果實(shí)而言，1-mcp濃度為1.4μl/l已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)蘋果果實(shí)腐爛的抑制作用。

發(fā)明人還進(jìn)行了1-mcp單獨(dú)對(duì)輪紋病菌葡萄座腔菌botryosphaeriadothideano.040301生長(zhǎng)是否抑制的實(shí)驗(yàn)，方法提供如下：

從培養(yǎng)7天的長(zhǎng)有輪紋病菌葡萄座腔菌botryosphaeriadothideano.040301菌絲的pda培養(yǎng)板上，取長(zhǎng)*寬*高為1cm*1cm*0.5cm大小含有菌絲的瓊脂塊，分別接種于另外兩個(gè)新配置的pda培養(yǎng)板上，一個(gè)培養(yǎng)板上滴加1濃度單位的1-mcp溶液55μl(溶劑為水)(圖1a(iv)，右)(根據(jù)體積計(jì)算，培養(yǎng)皿容積為90cm³，除去培養(yǎng)基35毫升，剩余空間為55cm³，滴加55μl1濃度單位的1-mcp，即得到144.3μl/l的1-mcp氣體)，蓋上培養(yǎng)皿蓋，使用parafilm封口膜密封；另一培養(yǎng)板滴加55μl水做為對(duì)照(圖1a(iv)，左)，蓋上培養(yǎng)皿蓋，使用parafilm膜密封；培養(yǎng)5天后，觀察輪紋病菌菌絲的擴(kuò)展情況。

結(jié)果如圖1a(iv)所示，1-mcp不具有抑制葡萄座腔菌botryosphaeriadothideano.040301的作用，表明，1-mcp防治蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病是通過(guò)其他途徑實(shí)現(xiàn)的。

實(shí)施例2、在輪紋病菌侵染下1-mcp對(duì)蘋果果實(shí)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的影響

本實(shí)施例提供了在輪紋病菌侵染條件下，1-mcp對(duì)蘋果果實(shí)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的影響，其中包括乙烯合成、乙烯合成關(guān)鍵基因及乙烯受體關(guān)鍵基因表達(dá)。

本試驗(yàn)為2年試驗(yàn)的重復(fù)研究結(jié)果(2014年、2015年)。

1、1-mcp對(duì)蘋果果實(shí)乙烯合成的影響

以蘋果果實(shí)乙烯合成速率(納升/克/小時(shí))，計(jì)算接菌對(duì)蘋果果實(shí)乙烯合成的影響。

乙烯釋放速率測(cè)量方法：

應(yīng)用氣相色譜法檢測(cè)對(duì)實(shí)施例1的三的3的6組在接種后不同時(shí)間的密閉燒杯中的乙烯氣體的含量。應(yīng)用氣體密封針，抽取1ml待檢測(cè)氣樣，注入惠普氣相色譜儀(hewlettpackard)，進(jìn)行乙烯含量檢測(cè)，為火焰離子檢測(cè)器。

氣體取樣完畢，去除燒杯密封，進(jìn)行徹底通風(fēng)處理，釋放累積乙烯，再次密封，以備進(jìn)行下一時(shí)間點(diǎn)乙烯含量測(cè)定。

對(duì)接菌與1-mcp聯(lián)合處理組，按照使用濃度，重新加入新的1-mcp固體粉(同s14所述)，密封。

乙烯合成速率計(jì)算公式：

乙烯合成速率(納升/克/小時(shí))＝0.1395*峰面積*0.34/果實(shí)質(zhì)量(克)/時(shí)間(小時(shí))

結(jié)果如圖2所示，表明：蘋果果實(shí)中乙烯被輪紋病菌侵染誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的乙烯合成受發(fā)育期及生理狀態(tài)影響，1-mcp顯著抑制輪紋病菌誘導(dǎo)的蘋果果實(shí)乙烯合成；

處于發(fā)育期的蘋果果實(shí)(7月)，乙烯本底合成水平為0.0015nl/g/h，接菌第2、4、6天，乙烯合成速率分別為0.24、0.46、1.28nl/g/h，為初始合數(shù)值的161.2倍、311.2倍、859倍(圖2.a(i))。bd+0.011-mcp即表現(xiàn)出顯著抑制作用，第2天、4天、6天乙烯合成速率分別為病菌單獨(dú)接菌處理的25.4％、84.2％、40.1％，bd+0.011-mcp與bd+0.11-mcp在對(duì)乙烯合成的抑制程度上未表現(xiàn)出顯著區(qū)別；隨著濃度進(jìn)一步升高，對(duì)乙烯合成的抑制程度進(jìn)一步加強(qiáng)，在0.5時(shí)候，乙烯合成速率分別為單獨(dú)接菌處理的19.3％、22.6％、26.8％，除第6天外，bd+0.51-mcp與bd+11-mcp在抑制乙烯合成的能力上沒(méi)有表現(xiàn)出顯著區(qū)別(圖2.a(i))。

成熟果實(shí)(10月)乙烯本底合成速率為0.033nl/g/h，為發(fā)育期果實(shí)的22.2倍。接菌第2、4、6天，乙烯合成速率分別為0.082、0.224、0.497nl/g/h，分別為初始值的2.48、6.8、15.0倍(圖2.a(ii))。1-mcp處理，顯著抑制了病菌誘導(dǎo)的蘋果果實(shí)乙烯合成，1-mcp濃度為0.01時(shí)，乙烯合成分別為單獨(dú)接菌處理的51.4％(第2天)、56.6％(第4天)、44.2％(第6天)；而對(duì)乙烯合成的抑制作用，并沒(méi)有隨著1-mcp濃度的升高而進(jìn)一步增強(qiáng)，1-mcp濃度為1時(shí)，乙烯合成速率分別為單獨(dú)接菌處理的55.5％(第2天)、47.9％(第4天)、55.57％(第6天)(圖2.a(ii))。

儲(chǔ)藏期果實(shí)，由冷藏轉(zhuǎn)至常溫，誘導(dǎo)蘋果果實(shí)乙烯大量合成。室溫放置2天后，乙烯的合成速率達(dá)到6.316nl/g/h，病菌接菌處理并沒(méi)有對(duì)乙烯的合成具有顯著影響(圖2.a(iii))。1-mcp顯著抑制了蘋果果實(shí)乙烯合成，在0.01時(shí)，乙烯合成速率分別為對(duì)照組與接菌處理組的0.4％、2.6％、2.9％。而對(duì)乙烯合成的抑制作用，未隨1-mcp濃度升高，而進(jìn)一步增強(qiáng)(圖2.a(iii))。

由上可以看出：(1)輪紋病菌侵染顯著能夠誘導(dǎo)蘋果果實(shí)乙烯合成；(2)病菌對(duì)乙烯合成的誘導(dǎo)作用受果實(shí)發(fā)育期及生理狀態(tài)的影響。處于7月份果實(shí)發(fā)育期的蘋果果實(shí)乙烯合成誘導(dǎo)倍數(shù)最高，10月份的果實(shí)次之，而儲(chǔ)藏期的果實(shí)，對(duì)接菌處理后乙烯的合成與對(duì)照組相比，沒(méi)有顯著區(qū)別。乙烯合成的誘導(dǎo)倍數(shù)與果實(shí)成熟度呈負(fù)相關(guān)；(3)1-mcp能夠抑制蘋果果實(shí)乙烯合成。

2、1-mcp對(duì)蘋果果實(shí)乙烯合成關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量pcr的方法檢測(cè)實(shí)施例1的三的3的ctrl組、單獨(dú)病菌接種組(bd)、bd+1-mcp0.01組和bd+1-mcp1組中目的基因的表達(dá)。

組織取樣：

以各組處理后的蘋果果實(shí)接菌點(diǎn)為圓心，以距圓心第6天病斑半徑大小的位置，分別于接菌后0、2、4、6天，取寬度為0.5cm的一圈果皮(或帶一點(diǎn)果肉)為組織樣本，進(jìn)行qrt檢測(cè)。圖2b所示，兩條環(huán)形虛線之間的部位為組織取樣部位。

模板制備及實(shí)時(shí)定量pcr：

應(yīng)用ctab法從所取組織樣本中提取總rna。取1.5總rna，根據(jù)thermol公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒revertaid^tmfirststrandcdnasynthesiskit的說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cdna。反轉(zhuǎn)錄的總rna的量為1.5μgrna，應(yīng)用20微升反應(yīng)體系，將得到的cdna稀釋5倍，作為實(shí)時(shí)定量pcr模板。

采用10μl反應(yīng)體系，其中，rox(faststartuniversalsybrgreenmaster,roche):5μl；正義引物：0.3μl引物濃度10μm；反義引物：0.3μl引物濃度10μm；無(wú)菌水：3.4μl；

實(shí)時(shí)定量pcr儀為：bio-rad(cfxconnectreal-timesystem)。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃15min，(95℃10s，60℃32s，讀板，共40循環(huán))，65℃-95℃(每升高0.5℃讀板)制備溶解曲線。

應(yīng)用t-檢驗(yàn)的方式，檢驗(yàn)組間基因表達(dá)變化上的差異水平，其中，基因表達(dá)差異小于2倍以內(nèi)視為處于同一基因表達(dá)水平。

檢測(cè)基因包括：mdaco1(ncbiaccessionno.af030859)、mdacs5a(ncbiaccessionno.ab034992)、mdacs5b(ncbiaccessionno.ab034993)。

mdaco1催化1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化形成乙烯，mdacs催化由s-腺苷甲硫氨酸合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸。

qrt引物的序列如下：

mdaco1-f:5’-cagtcggatgggaccagaa-3’

mdaco1-r:5’-gcttggaatttcaggccaga-3’

mdacs5a-f:5’-gcaatggtggtcttttcgtatg-3’

mdacs5a-r:5’-ttcgaacgtctgctccttga-3’

mdacs5b-f:5’-gaattttgagtgttggataccttcttt-3’

mdacs5b-r:5’-gaaccaacatctaaaatcccattgt-3’

1-mcp抑制發(fā)育期、成熟期及儲(chǔ)藏期蘋果果實(shí)中mdaco1及mdacs5b的表達(dá)(圖2c)。

在發(fā)育期果實(shí)中，接菌后第2、4、6天，mdaco1的表達(dá)量分別為對(duì)照的172.5、441.5、712.1倍，在0.1單位濃度的1-mcp存在時(shí)，接菌后表達(dá)量在第2、4、6天分別為對(duì)照的0.5、25.2、241.6倍；在1單位濃度1-mcp時(shí)，接菌后表達(dá)量在第2、4、6天分別為對(duì)照的0.1、0.6、78.7倍(圖2c(i))。

在成熟果實(shí)中，病菌侵染對(duì)該基因表達(dá)沒(méi)有影響，加入1單位濃度1-mcp，接菌后基因表達(dá)量在第4、6天分別為對(duì)照的0.1、0.1倍(圖2c(ii))。

在儲(chǔ)藏期果實(shí)中，病菌侵染對(duì)該基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用不明顯，第2、4天該基因的表達(dá)量與對(duì)照相比，沒(méi)有顯著區(qū)別，而在第6天該基因的表達(dá)量為對(duì)照的2.4倍，加入1單位濃度的1-mcp，降低了第2、4天該基因的表達(dá)量，分別為單獨(dú)接菌處理的0.5倍、0.4倍，在第6天，沒(méi)有顯著抑制作用(圖2c(iii))。

1-mcp抑制mdac5b表達(dá)。

在發(fā)育期果實(shí)中，接菌后第2、4、6天mdacs5b的表達(dá)量分別為對(duì)照的3.3、64.7、560.8倍，在0.1單位濃度1-mcp時(shí)，接菌后表達(dá)量在第2、4、6天分別為對(duì)照的3.0、14.7、195.3倍；在1單位濃度1-mcp時(shí)，接菌后表達(dá)量在第2、4、6天分別為對(duì)照的2.9、7.9、11.6倍(圖2c(i))。

在成熟富士中，接菌后該基因的表達(dá)在第4、6天分別為對(duì)照的177.4、959.8倍，在含有1單位濃度的1-mcp時(shí)，該基因的表達(dá)分別為對(duì)照的51.9、95.1倍(圖2c(ii))。

儲(chǔ)藏期果實(shí)中，病菌侵染第2、4、6天，該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.5、10.5、1125.1倍，在含有1單位濃度的1-mcp時(shí)，該基因的表達(dá)量于2、4、6天為對(duì)照的0.5、24.4、107.4倍(圖2c(iii))。1-mcp顯著抑制了第6天mdacs5b的表達(dá)(圖2c(iii))。

1-mcp對(duì)mdacs5a的表達(dá)沒(méi)有抑制作用(圖2c(i、ii、iii))。

1-mcp對(duì)mdaco1以及mdacs5b等乙烯合成中關(guān)鍵基因的抑制作用，部分提供了1-mcp抑制蘋果果實(shí)乙烯合成的有關(guān)分子層面的證據(jù)。

3、1-mcp對(duì)蘋果果實(shí)乙烯受體關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

與上述2方法相同，不同的是檢測(cè)基因包括：mders1(ncbiaccessionno.ay083169)、mders2(ncbiaccessionno.ab213028)、mdetr2(ncbiaccessionno.dq847145)。

mders2、mders1、mdetr2是蘋果中已知的乙烯受體編碼基因。

實(shí)時(shí)定量pcr所使用模板如2中所述。

所使用qrt引物序列如下：

mders1-f:5’-caactagggatatgcgac-3’

mders1-r:5’-cactggcatccaaagacttc-3’

mders2-f:5’-gcttgttaaggttggaagaaatctg-3’

mders2-r:5’-cggcatcgttgagtgttacatt-3’

mdetr2-f:5’-gttgtgacgcggaaaatgc-3’

mdetr2-r:5’-aatccagatgaaacggcagttac-3’

1-mcp抑制了病菌接菌侵染誘導(dǎo)的mders2、mders1、mdetr2的表達(dá)(圖3)。

1-mcp抑制mders2的表達(dá)

發(fā)育期果實(shí)接菌第2、4、6天后，該基因表達(dá)量分別為對(duì)照的10.9、11.6、1.5倍，在0.1單位濃度1-mcp時(shí)，接菌后第2、4、6天該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.6、3.0、0.5倍；在1單位濃度1-mcp時(shí)，該基因的表達(dá)量在接菌后2、4、6天分別為對(duì)照的0.2、0.1、0.2倍。

在成熟期果實(shí)中，接菌后第4、6天，該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的2.8、0.4倍，而在1濃度單位1-mcp存在時(shí)，接菌后該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.02、0.01倍。

在儲(chǔ)藏期果實(shí)中，病菌侵染后第2、4、6天該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.4、1.6、0.3倍，而在1濃度單位1-mcp存在時(shí)，該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.02、0.03、0.02倍。

1-mcp抑制mders1的表達(dá)

在發(fā)育期蘋果中，病菌侵染顯著誘導(dǎo)了mders1表達(dá)，接菌后第2、4、6天該基因表達(dá)量分別為對(duì)照的5.6、3.8、1.0倍，在0.1單位濃度1-mcp時(shí)，接菌后第2、4、6天該基因表達(dá)量分別為對(duì)照的0.6、1.2、0.6倍，在1單位濃度1-mcp時(shí)，該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.8、0.4、3.1倍。1-mcp抑制了第2、4天病菌侵染對(duì)該基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用(圖3(i))。

在成熟期果實(shí)中，接菌后第4、6天，該基因表達(dá)量分別為對(duì)照的2.2、1.2倍，在1濃度單位1-mcp存在時(shí)，接菌后第4、6天該基因表達(dá)量分別為對(duì)照的0.7、1.0倍。1-mcp抑制了病菌侵染第2天對(duì)該基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用(圖3(ii))。

在儲(chǔ)藏期果實(shí)中，病菌侵染抑制了該基因表達(dá)，接菌后第2、4、6天該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.4、0.2、0.02倍，1濃度單位1-mcp沒(méi)有進(jìn)一步抑制該基因的表達(dá)(圖3(iii))。

1-mcp抑制mdetr2的表達(dá)

在發(fā)育期果實(shí)中，病菌侵染顯著誘導(dǎo)了mdetr2表達(dá)，病菌侵染后第2、4、6天該基因表達(dá)量分別為對(duì)照的3.7、2.9、4.5倍，當(dāng)0.1濃度單位的1-mcp存在時(shí)，接菌后第2、4、6天該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.4、1.4、1.2倍，濃度單位為1時(shí)，接菌后該基因表達(dá)量分別為對(duì)照的0.3、0.4、1.3倍(圖3(i))。

在成熟果實(shí)中，接菌后第4、6天該基因的表達(dá)分別為對(duì)照的2.8、1.2倍，而周圍環(huán)境中1濃度單位的1-mcp存在時(shí)，該基因的表達(dá)量在第4、6天分別為對(duì)照的0.3、0.6倍(圖3(ii))。

在儲(chǔ)藏果實(shí)中，接菌后第2、4、6天該基因表達(dá)量分別為對(duì)照的0.7、1.3、0.4倍，在1濃度單位1-mcp存在時(shí)，接菌后第2、4、6天該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.3、0.4、0.3倍。1-mcp顯著降低了接菌后第2、4天該基因的表達(dá)。

1-mcp對(duì)mders2表達(dá)的抑制作用呈典型濃度梯度依賴型(圖3，mders2)。而對(duì)mders1表達(dá)的抑制則不具有濃度梯度依賴性，1-mcp對(duì)mdetr2表達(dá)的抑制作用除在未成熟果實(shí)第4天具有濃度梯度依賴性外，在其他時(shí)間均未表現(xiàn)出濃度梯度依賴性，而且，當(dāng)輪紋病菌侵染抑制mders1、mdetr2時(shí)，1-mcp不能進(jìn)一步抑制該基因表達(dá)(圖3)。

這種對(duì)1-mcp不同的響應(yīng)模式，可能反映出不同乙烯受體編碼基因的不同表達(dá)調(diào)控模式及對(duì)乙烯不同的敏感性，同時(shí)，乙烯受體基因存在非乙烯依賴性調(diào)控模式。

1-mcp對(duì)乙烯合成、乙烯合成關(guān)鍵基因及乙烯受體編碼基因的抑制作用，可能下調(diào)了蘋果果實(shí)中乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的水平。

實(shí)施例3、1-mcp對(duì)蘋果病程相關(guān)基因表達(dá)、果實(shí)細(xì)胞壁崩潰與果實(shí)軟化相關(guān)基因表達(dá)的影響

本實(shí)施例提供了在輪紋病菌侵染條件下，1-mcp對(duì)蘋果病程相關(guān)基因表達(dá)、果實(shí)細(xì)胞壁崩潰與果實(shí)軟化相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1、1-mcp對(duì)蘋果果實(shí)中病程相關(guān)蛋白編碼基因表達(dá)的影響

與實(shí)施例2的2相同，不同的是檢測(cè)基因包括：mdpr4(ncbiaccessionno.jq342967)、mdpr5(ncbiaccessionno.dq318213)、mdpr8(ncbiaccessionno.dq318214)、mdchib-1(gdrdatabasemdp0000224397)。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量pcr方法檢測(cè)蘋果果實(shí)抗病相關(guān)基因的表達(dá)。

mdpr4、mdpr5、mdpr8分別編碼核酸內(nèi)切酶、滲透蛋白、幾丁質(zhì)酶，為蘋果3個(gè)病程相關(guān)蛋白編碼基因。mdchib-1編碼堿性幾丁質(zhì)酶。

實(shí)時(shí)定量pcr所使用模板如實(shí)施例2的2中所述。

所使用qrt引物序列如下：

mdpr4-f:5’-ataccacctctacaatccaca-3’

mdpr4-r:5’-gtccaagtccaatcctcc-3’

mdpr5-f:5’-ctcaccttggccatcctctt-3’

mdpr5-r:5’-ttggatgctagttcgaagc-3’

mdpr8-f:5’-caaaacggcaacgaaggaac-3’

mdpr8-r:5’-aagtaccactagcggggtt-3’

mdchib-1-f:5’-tgctgctcggtcttttaatg-3’

mdchib-1-r:5’-ccatgcatatggaccatctg-3’

1-mcp提高發(fā)育期果實(shí)接菌后mdpr4及mdchib-1的表達(dá)；成熟期果實(shí)及儲(chǔ)藏果實(shí)接菌后mdpr4、mdpr5、mdpr8、mdchib-1的表達(dá)(圖4)。

在發(fā)育期果實(shí)中，接菌后第2、4天基因mdpr4的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.7、33.1倍，在1濃度單位的1-mcp存在的條件下，接菌后第2、4天該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的82.8、120.2倍(圖4(i))。

接菌后第2、4、6天mdchib-1的表達(dá)量分別為對(duì)照的1.0、0.7、0.9倍，在0.1濃度單位1-mcp存在時(shí)，該基因的表達(dá)在接菌后第2、4、6天分別為對(duì)照的3.6、1.5、6.5倍，在1濃度單位1-mcp時(shí)，該基因的表達(dá)量在接菌后分別為對(duì)照的23.9、48.0、238.5倍(圖4(i))。

1-mcp提高了成熟果實(shí)中mdpr4、mdpr5、mdpr8、mdchib-1基因的表達(dá)

在成熟果實(shí)中，病菌接菌后第4、6天，mdpr4的基因表達(dá)量分別為對(duì)照的1.9、91.6倍，而在濃度單位的1-mcp存在時(shí)，接菌后第4、6天，該基因的表達(dá)分別為對(duì)照的14.5、192.7倍(圖4(ii))。

接菌后第4、6天，mdpr5的基因表達(dá)量分別為對(duì)照的1.3、48.2倍，而在濃度單位的1-mcp存在時(shí)，接菌后第4、6天，該基因的表達(dá)分別為對(duì)照的22.2、181.3倍(圖4(ii))。

接菌后第4、6天，mdpr8的基因表達(dá)量分別為對(duì)照的3.2、31.3倍，而在濃度單位的1-mcp存在時(shí)，接菌后第4、6天，該基因的表達(dá)分別為對(duì)照的28.1、123.5倍(圖4(ii))。

接菌后第4、6天，mdchib-1的基因表達(dá)量分別為對(duì)照的2.2、10.7倍，而在濃度單位的1-mcp存在時(shí)，接菌后第4、6天，該基因的表達(dá)分別為對(duì)照的52.2、213.8倍(圖4(ii))。

1-mcp提高了儲(chǔ)藏果實(shí)中mdpr4、mdpr5、mdpr8、mdchib-1基因的表達(dá)量

在儲(chǔ)藏果實(shí)中，接菌后第2、4、6天，mdpr4的表達(dá)量分別為對(duì)照的1.5、0.06、2.6倍，而在1濃度單位的1-mcp存在時(shí)，接菌后該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的2.1、0.5、4.7倍(圖4(iii))。

接菌后第2、4、6天，mdpr5的表達(dá)量分別為對(duì)照的1.0、0.08、0.3倍，而在1濃度單位的1-mcp存在時(shí)，接菌后該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的1.6、0.7、1.6倍(圖4(iii))。

接菌后第2、4、6天，mdpr8的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.4、0.2、0.2倍，而在1濃度單位的1-mcp存在時(shí)，接菌后該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.7、0.6、0.8倍(圖4(iii))。

在儲(chǔ)藏果實(shí)中，病菌侵染抑制mdchib-1的表達(dá)，接菌后第2、4、6天，該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的0.2、0.05、0.05倍，而在周圍環(huán)境中存在1濃度單位1-mcp時(shí)，該基因表達(dá)量在接菌2、4、6天后，分別為對(duì)照的0.5、0.4、0.4倍(圖4(iii))。

輪紋病菌侵染誘導(dǎo)了mdpr4表達(dá)，病菌侵染第2天，該基因表達(dá)水平與對(duì)照相比，無(wú)顯著差異，而在第4天，為同期對(duì)照的33.1倍，初始值的49.7倍；在0.11-mcp處理的條件下，第2天該基因的表達(dá)已顯著升高，為同期對(duì)照的2.6倍，為初始值的7.4倍，為輪紋病菌單獨(dú)接菌處理的3.5倍；在11-mcp處理的條件下，第2天該基因的表達(dá)即達(dá)到初始值237.9倍，為同期對(duì)照的82.8倍，是單獨(dú)接菌處理的111.1倍；在第4天，表達(dá)量為初始值的180.3倍，同期對(duì)照的120.2倍，是單獨(dú)接菌處理的3.6倍(圖4)。由此看出，1-mcp顯著提高了果實(shí)接菌后第2、4天mdpr4的表達(dá)。

mdchib-1編碼堿性幾丁質(zhì)酶，該基因受輪紋病菌侵染的誘導(dǎo)作用甚為微弱，在整個(gè)侵染階段，該基因表達(dá)變化的倍數(shù)與對(duì)照相比，基本沒(méi)有顯著差異(圖4)。但是，在0.11-mcp處理的條件下，第2、6天該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的3.6倍、6.5倍；1-mcp為1時(shí)，在2、4、6天，該基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的23.9、48.0、238.5倍(圖4)。1-mcp顯著提高了幾丁質(zhì)酶編碼基因的表達(dá)。

在成熟果實(shí)中，1-mcp處理顯著性一致地提高了病菌侵染的果實(shí)中mdpr4、mdpr5、mdpr8、mdchib-1的表達(dá)量(圖4，ii)。而在儲(chǔ)藏富士中，病菌侵染抑制了該類基因的表達(dá)，而1-mcp處理則阻止了病菌侵染對(duì)該基因表達(dá)的抑制作用，其中mdchib-1尤為典型(圖4，iii)。

有證據(jù)顯示：mdpr4具有抗病蛋白功能。mdchib-1蛋白在離體條件下，也表現(xiàn)出抑菌能力。

因此，在1-mcp處理?xiàng)l件下，具有抗病功能的病程相關(guān)基因表達(dá)量提高，可能增強(qiáng)了蘋果果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性。

2、1-mcp對(duì)蘋果果實(shí)細(xì)胞壁果膠質(zhì)降解與果實(shí)軟化基因mdpg1表達(dá)的影響

mdpg1在genebank中的編號(hào)為no.l27743。mdpg1編碼多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶，能夠斷裂細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的α-(1-4)糖苷鍵，控制參與果實(shí)細(xì)胞壁解聚，在成熟過(guò)程中與果實(shí)軟化密切相關(guān)。

wakasay.etal.lowexpressionofanendppolygalacturonasegeneinapplefruitwithlong-termstoragepotential.postharvestbiologyandtechnology,2006,39:193–198.

與實(shí)施例2的2相同，不同的是檢測(cè)基因?yàn)閙dpg1。

實(shí)時(shí)定量pcr所使用模板如實(shí)施例2的2中所述。

qrt引物序列如下：

mdpg1-f:5’-cgcacaacaaatccatgtcatat-3’

mdpg1-r:5’-accgtgagacaggaagcttga-3’

輪紋病菌侵染顯著誘導(dǎo)了mdpg1表達(dá)，該基因表達(dá)量在第4天達(dá)到最高，為同時(shí)期對(duì)照的45.8倍，初始值的52.2倍；0.11-mcp完全抑制了病菌對(duì)該基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用，11-mcp時(shí)，mdpg1的表達(dá)量在接菌后的2、4、6天分別為對(duì)照的11.2％、9.2％、22.4％(圖5)。mdpg1基因的表達(dá)同時(shí)也受發(fā)病程度的影響，即呈現(xiàn)一個(gè)先升高后下降的趨勢(shì)。

在成熟富士果實(shí)中，mdpg1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化與發(fā)育期果實(shí)中一致，即，先升高，后降低，在第4、6天，該基因表達(dá)量分別為對(duì)照的14.0倍、5.3倍，11-mcp將該基因的表達(dá)量降至對(duì)照的11.5％、16.0％(圖5)；在儲(chǔ)藏果實(shí)中，輪紋病菌沒(méi)有誘導(dǎo)該基因表達(dá)，而1-mcp則顯著抑制了該基因的表達(dá)(圖5)。

果膠質(zhì)對(duì)保持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性非常重要，因此，輪紋病菌侵染能夠促進(jìn)mdpg1的表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞壁果膠結(jié)構(gòu)的斷裂，有利于細(xì)胞壁崩潰，而1-mcp在輪紋病菌侵染條件下，對(duì)該基因表達(dá)的抑制作用，增強(qiáng)了果實(shí)細(xì)胞壁保持完整性的能力，抑制果實(shí)腐爛。

另外，mdpg1的表達(dá)水平在果實(shí)成熟期(10月)與果實(shí)發(fā)育期(7月)變化不大。

本實(shí)施例研究結(jié)果說(shuō)明，1-mcp可能通過(guò)兩方面的作用抑制了蘋果果實(shí)腐爛：(1)1-mcp提高蘋果果實(shí)中抗病相關(guān)基因表達(dá)，提高對(duì)輪紋病菌的抗性；(2)1-mcp降低細(xì)胞壁果膠質(zhì)降解基因mdpg1的表達(dá)水平，抑制在輪紋病菌侵染過(guò)程中，由mdpg1基因表達(dá)造成的蘋果果實(shí)細(xì)胞壁解體。

實(shí)施例4、乙烯對(duì)人工接種輪紋病菌引起的蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病的影響

本實(shí)施例提供了外源提供乙烯對(duì)人工接種輪紋病菌引起的蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病的影響。

乙烯氣體購(gòu)買自山東省迎春氣體公司，儲(chǔ)存于高壓鋼瓶中，氣壓為4.5mpa，氣體純度為100％。使用前，打開(kāi)高壓閥門，首先將氣體釋放于氣囊中，然后，使用氣密針根據(jù)使用濃度，抽取一定量乙烯，將乙烯注入含有接菌果實(shí)的密閉容器中，研究乙烯對(duì)蘋果果實(shí)發(fā)病的影響。

發(fā)病程度統(tǒng)計(jì)見(jiàn)前面所述。

結(jié)果處理接種病斑數(shù)為8，獨(dú)立試驗(yàn)重復(fù)3次。

本實(shí)施例研究?jī)?nèi)容為2項(xiàng)，第一項(xiàng)為采用濃度為10ppm、100ppm、1000ppm、10000ppm的乙烯處理蘋果果實(shí)，研究對(duì)蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病的影響。研究表明，外源提供乙烯顯著促進(jìn)了輪紋病發(fā)病。乙烯濃度為0ppm、10ppm、100ppm、1000ppm、10000ppm，接種病菌36小時(shí)后，病斑大小分別為：0.31cm、0.82cm、0.53cm、0.69cm、0.60cm；t檢驗(yàn)顯示差異為極顯著(p<0.01)(圖6a)。外源乙烯顯著促進(jìn)輪紋病菌在蘋果果實(shí)上造成的腐爛。

為進(jìn)一步探索不同濃度乙烯對(duì)蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病的影響，在10ppm基礎(chǔ)上，將乙烯濃度進(jìn)一步降低，最低為0.01ppm，共設(shè)置0ppm、0.01ppm、0.1ppm、1ppm、10ppm、100ppm6個(gè)濃度梯度。0.1ppm-100ppm的乙烯都能夠在輪紋病菌接菌2天后，顯著促進(jìn)蘋果果實(shí)發(fā)??；而隨乙烯濃度進(jìn)一步升高，并沒(méi)有體現(xiàn)出乙烯濃度的依賴性，說(shuō)明0.01-0.1ppm的乙烯具有飽和效應(yīng)，低至0.01ppm的乙烯對(duì)輪紋病菌擴(kuò)展具有顯著的促進(jìn)作用(圖6b)。

本實(shí)施例的研究結(jié)果為1-mcp通過(guò)抑制乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)抑制蘋果果實(shí)腐爛提供了證據(jù)。

實(shí)施例5、乙烯對(duì)蘋果果實(shí)病程相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞壁降解與崩潰關(guān)鍵基因表達(dá)，以及蘋果果實(shí)細(xì)胞免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的影響

本實(shí)施例提供了在輪紋病菌侵染條件下，外部提供乙烯對(duì)蘋果果實(shí)病程相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞壁降解與崩潰關(guān)鍵基因表達(dá)，以及蘋果果實(shí)細(xì)胞免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的影響。

1、外部提供乙烯對(duì)蘋果果實(shí)病程相關(guān)基因表達(dá)的影響

在本部分研究目的為探討外源乙烯在輪紋病菌侵染條件下，對(duì)蘋果果實(shí)病程相關(guān)基因表達(dá)的影響。根據(jù)本研究目的，分別取濃度為0ppm、100ppm、1000ppm、10000ppm的乙烯處理未接菌果實(shí)，及接菌蘋果果實(shí)。

組織取樣：接菌第4天，緊靠并環(huán)繞病斑，取一寬度為0.5cm的環(huán)形果實(shí)組織。應(yīng)用實(shí)

時(shí)定量pcr方法，檢測(cè)目的病程相關(guān)基因表達(dá)。

檢測(cè)基因包括：mdpr4、mdpr5、mdpr8、mdchib-1。

qrt引物的序列同前。

mdchib-2(mdp0000430546)為蘋果中已知的受乙烯正向調(diào)控的基因，在我們的研究中，同時(shí)也檢測(cè)了外源添加乙烯對(duì)該基因表達(dá)的影響，所使用引物為：

mdchib-2-f:5’-gtcactcaggcattcttcg-3’

mdchib-2-r:5’-catgggtgacatgagcaaa-3’

結(jié)果表明，在輪紋病菌侵染過(guò)程中，外源添加乙烯，降低了所檢測(cè)病程相關(guān)基因的表達(dá)，其中為mdpr4、mdpr5、mdpr8、mdchib-1(圖7a)。

但，應(yīng)用乙烯與輪紋病菌接菌共同處理，進(jìn)一步增強(qiáng)了mdchib-2基因的表達(dá)(圖7a)，說(shuō)明，在蘋果果實(shí)中，并不是所有的病程相關(guān)基因都能夠被乙烯所抑制。存在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)正調(diào)控的基因，也存在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控的基因。

2、外部提供乙烯對(duì)蘋果果實(shí)細(xì)胞免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的影響

mapk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是植物中重要的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在植物免疫抗病中處于較為核心的位置。mapk磷酸化，代表植物免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活水平。

在本研究中，應(yīng)用western雜交的方式，檢測(cè)蘋果果實(shí)中mapk被磷酸化水平(sunetal，2013)。sunetal,structuralbasisforflg22-inducedactivationofthearabidopsisfls2-bak1immunecomplex.science,2013,1:624–628.

所使用抗體為pmapk抗體(cellsignaling#910)，該抗體能夠特異性識(shí)別mapk激酶中被磷酸化的位點(diǎn)。接菌0h、4h、8h后，取接菌部位果實(shí)細(xì)胞2g，在液氮中速凍，研磨，在研磨過(guò)程中加入200-500μl蛋白提取緩沖液(150mmnacl，50mmtris-hcl,ph7.5，5mmedta,1％triton，proteaseinhibitor)。樣品研磨均勻后，對(duì)蛋白樣品采用渦旋充分混勻，經(jīng)6000rpm離心10分鐘，取上清為蛋白提取液。將20μl蛋白提取液與7μl4ⅹsdsloadingbuffer混合，95℃度加熱10分鐘變性。然后，應(yīng)用western雜交的方式檢測(cè)蘋果果實(shí)中mapk3、mapk6的活性。

研究結(jié)果表明，輪紋病菌侵染激活了mapk活性，在第4小時(shí)，即有顯著的mapk激活的活性信號(hào)，乙烯處理同樣也有微弱的信號(hào)，但是，在乙烯存在的條件下，輪紋病菌侵染未能激活mapk活性(圖8a、b)，在第8小時(shí)，mpk3、mpk6的信號(hào)水平在乙烯與輪紋病菌聯(lián)合處理中，也顯著低于病原菌單獨(dú)接菌(圖8a、b)。因此，在輪紋病菌侵染條件下，乙烯抑制了mapk3、mapk6激活。

以蘋果愈傷組織細(xì)胞接種輪紋病菌，同樣表明，輪紋病菌與乙烯聯(lián)合處理蘋果果實(shí)細(xì)胞，抑制了蘋果細(xì)胞mapk(圖8c)。

而與此同時(shí)，在外加乙烯的情況下，mapk免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的轉(zhuǎn)錄因子mdwrky33-1、mdwrky33-2、mdwrky33-3的基因表達(dá)也被顯著抑制(圖7c)。因此，在輪紋病菌侵染條件下，外加乙烯處理，顯著抑制了蘋果果實(shí)中mapk-wrky轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá)這一整個(gè)鏈條的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化水平。

而乙烯有可能通過(guò)抑制蘋果果實(shí)細(xì)胞中免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，而降低病程相關(guān)基因的表達(dá)。

3、外部提供乙烯對(duì)蘋果果實(shí)細(xì)胞壁崩潰相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量pcr方法，檢測(cè)目的病程相關(guān)基因表達(dá)。

組織取樣同前。

檢測(cè)基因：mdpg1。

qrt引物的序列同前。

病菌侵染促進(jìn)了mdpg1的表達(dá)，但是，乙烯則進(jìn)一步增強(qiáng)了mdpg1的表達(dá)。因此，乙烯具有進(jìn)一步促進(jìn)輪紋病菌侵染誘導(dǎo)的mdpg1表達(dá)的作用(圖9)。

盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。

序列表

<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>1-甲基環(huán)丙烯在抑制蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病中的應(yīng)用

<130>1

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cagtcggatgggaccagaa19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gcttggaatttcaggccaga20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gcaatggtggtcttttcgtatg22

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ttcgaacgtctgctccttga20

<210>5

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gaattttgagtgttggataccttcttt27

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gaaccaacatctaaaatcccattgt25