本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種海濱木槿組培再生的方法。

背景技術(shù)：

海濱木槿(hibiscushamabosieb.etzucc.)為錦葵科木槿屬落葉小喬木，原產(chǎn)浙江舟山、寧波等沿海一帶，其樹冠濃密，花金黃色，花形大而色澤艷麗，花期長(zhǎng)，入秋后葉片變紅，季相變化明顯，且枝條富有韌性，耐修剪，是一種十分珍貴的觀花觀葉園林綠化樹種；此外，海濱木槿還具有驚人的抗逆能力，不但能耐鹽堿和海水侵襲，還具有很強(qiáng)的耐旱、耐貧瘠和抗風(fēng)能力，是一種頗具發(fā)展?jié)摿Φ姆雷o(hù)樹種，在環(huán)境治理和鹽堿地改良方面具有十分重要的作用。

近幾十年來(lái)，因圍海造地等多種原因，人為破壞嚴(yán)重，海濱木槿已處于瀕危滅絕境地，被列為浙江珍稀瀕危樹種。目前在生產(chǎn)上，海濱木槿主要采用播種繁殖，但由于海濱木槿種子種殼堅(jiān)硬，吸水困難，導(dǎo)致自然條件下種子萌發(fā)時(shí)間延遲且易腐爛，萌發(fā)率僅在10％左右；此外，利用種子育苗時(shí)還存在性狀分離和遺傳變異等問(wèn)題，很難保持母本株系的優(yōu)良性狀。扦插和嫁接技術(shù)在海濱木槿繁育方面的應(yīng)用雖有報(bào)道，但存在繁育過(guò)程繁瑣，受季節(jié)限制，且繁殖效率低等問(wèn)題。植物組織培養(yǎng)技術(shù)因其具有繁育周期短，繁殖系數(shù)高，所需要的外植體材料少等優(yōu)勢(shì)，在瀕危植物的繁育中起著重要作用。

目前，有關(guān)海濱木槿組培繁育的研究尚屬空白狀態(tài)。為了滿足規(guī)?；N植和品種改良對(duì)海濱木槿優(yōu)質(zhì)種苗的需求，急需開發(fā)一種簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效的海濱木槿組培再生的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效的海濱木槿組培再生的方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種海濱木槿組培再生的方法，包括如下步驟：

(1)以海濱木槿的當(dāng)年生未木質(zhì)化枝條為外植體來(lái)源，經(jīng)表面消毒后，切成適宜大小的切段；

(2)接種于添加有不同種類和濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，于適宜的光照和溫度條件下依次進(jìn)行腋芽的萌發(fā)、增殖、不定芽的伸長(zhǎng)和生根誘導(dǎo)培養(yǎng)；

(3)獲得根系健壯的海濱木槿再生植株。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中海濱木槿為取材于野外的具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的多年生海濱木槿植株。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的多年生海濱木槿植株指具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性好中一種或幾種性狀的多年生海濱木槿植株株系。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中表面消毒是指將海濱木槿的當(dāng)年生枝條經(jīng)流水沖洗10-30min，用74-76％無(wú)水乙醇擦拭后，于無(wú)菌操作臺(tái)中用74-76％無(wú)水乙醇消毒15-50s；然后經(jīng)10-20％的過(guò)氧化氫溶液消毒2-8min后，再用0.05-0.15％升汞溶液消毒2-5min，最后用無(wú)菌水沖洗5-6遍。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中切成適宜大小的切段是指將消毒后的海濱木槿莖段切成至少帶有1個(gè)腋芽的長(zhǎng)為0.5-1.0cm大小的切段，備用。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中添加有不同種類和濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基分別為用于莖段腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、用于莖段腋芽增殖的增殖培養(yǎng)基、用于不定芽伸長(zhǎng)的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基及用于不定芽生根的生根培養(yǎng)基。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基具體為添加有0.1-3.0mg/lkt、0.05-0.5mg/lga3、30g/l蔗糖和7.0g/l瓊脂的wpm培養(yǎng)基。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述增殖培養(yǎng)基具體為添加有0.5-2.0mg/lkt、0.1-1.0mg/ltdz、30g/l蔗糖和7.0g/l瓊脂的wpm培養(yǎng)基；所述伸長(zhǎng)培養(yǎng)基具體為添加有0.2-1.0mg/l6-ba、0.1-0.5mg/liba、0.05-0.5mg/lga3、30g/l蔗糖和7.0g/l瓊脂的1/2wpm培養(yǎng)基。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述生根培養(yǎng)基具體為添加有0.5-2.0mg/liaa、0.2-4.0mg/liba、20g/l蔗糖和7.0g/l瓊脂的1/2wpm培養(yǎng)基。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中適宜的光照和溫度條件是指將培養(yǎng)物置于溫度為22-26℃，光照強(qiáng)度為2000-2500lx，光照/黑暗周期為16/10h的恒溫培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：其一，取材方便、材料豐富，且不受季節(jié)限制，滿足海濱木槿規(guī)?；N植的需求；其二，再生效率高，繁殖系數(shù)大，腋芽萌發(fā)率高達(dá)100％，腋芽經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)后，增殖率高達(dá)96.8％，且平均每個(gè)外植體可產(chǎn)生7.4個(gè)不定芽，后期不定芽的生根率高達(dá)100％；其三，以所獲得的組培再生苗的莖段為外植體，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)海濱木槿植株的擴(kuò)大繁殖。因此，本發(fā)明所提供的一種海濱木槿組培再生的方法，不僅為海濱木槿的快速繁殖和規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)支撐，同時(shí)也為后期利用分子生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行遺傳改良提供重要的技術(shù)支持。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中的接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的海濱木槿莖段圖；

圖2是實(shí)施例1中的海濱木槿莖段腋芽萌發(fā)圖；

圖3是實(shí)施例1中的海濱木槿腋芽增殖圖；

圖4是實(shí)施例1中的海濱木槿不定芽伸長(zhǎng)圖；

圖5是實(shí)施例1中的海濱木槿組培苗生根圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的一種海濱木槿組培再生的方法，均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，包括如下步驟：

(1)從野外選取具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀(具備高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性好中一種或幾種性狀)的多年生海濱木槿植株株系，剪取當(dāng)年生未木質(zhì)化枝條作為外植體的來(lái)源；

(2)枝條去葉后，剪切成5cm大小的莖段，進(jìn)行表面消毒；表面消毒后，將莖段兩端壞死部位切除，再將莖段切成至少帶有1個(gè)腋芽的長(zhǎng)為0.7cm大小的切段，備用；其中，表面消毒的方式為：將海濱木槿的當(dāng)年生枝條經(jīng)流水沖洗20min，用75％無(wú)水乙醇擦拭后，于無(wú)菌操作臺(tái)中用75％無(wú)水乙醇消毒30s；然后經(jīng)15％的過(guò)氧化氫溶液消毒4min后，再用0.1％升汞溶液消毒3min，最后用無(wú)菌水沖洗6遍；

(3)將得到的海濱木槿莖段切段豎直接種于wpm+1.5mg/lkt、0.25mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行莖段腋芽的萌發(fā)誘導(dǎo)(圖1)，恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度24℃，光照強(qiáng)度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)2周后，腋芽的萌發(fā)率高達(dá)100％(圖2)；

(4)待腋芽萌發(fā)后，將莖段轉(zhuǎn)接于wpm+1.0mg/lkt+0.5mg/ltdz+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽的增殖培養(yǎng)；恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度24℃，光照強(qiáng)度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周后，腋芽的增殖率高達(dá)96.8％，且平均每個(gè)外植體產(chǎn)生7.4個(gè)不定芽(圖3)；

(5)待不定芽長(zhǎng)至1.0cm，將不定芽轉(zhuǎn)接于1/2wpm+0.6mg/l6-ba+、0.35mg/liba+0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)；恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度24℃，光照強(qiáng)度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)2周后，不定芽伸長(zhǎng)至2.0-3.0cm并伴有2-6片真葉(圖4)；

(6)將伸長(zhǎng)的不定芽轉(zhuǎn)接于1/2wpm+1.0mg/liaa+2.0mg/liba+20g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的生根誘導(dǎo)；恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度24℃，光照強(qiáng)度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周后，獲得伴有白色健壯根系的海濱木槿完整植株，生根率高達(dá)100％且平均每個(gè)外植體產(chǎn)生6.2條不定根(圖5)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的一種海濱木槿組培再生的方法，均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，包括如下步驟：

(1)從野外選取具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀(具備高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性好中一種或幾種性狀)的多年生海濱木槿植株株系，剪取當(dāng)年生未木質(zhì)化枝條作為外植體的來(lái)源；

(2)枝條去葉后，剪切成5cm大小的莖段，進(jìn)行表面消毒；表面消毒后將莖段切成至少帶有1個(gè)腋芽的長(zhǎng)為0.5cm大小的切段，備用；其中，表面消毒的方式為：將海濱木槿的當(dāng)年生枝條經(jīng)流水沖洗10min，用74％無(wú)水乙醇擦拭后，于無(wú)菌操作臺(tái)中用74％無(wú)水乙醇消毒15s；然后經(jīng)10％的過(guò)氧化氫溶液消毒2min后，再用0.05％升汞溶液消毒2min，最后用無(wú)菌水沖洗5遍；

(3)將得到的海濱木槿莖段切段豎直接種于wpm+0.1mg/lkt、0.05mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并于恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度22℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照/黑暗周期16/10h)1周，進(jìn)行莖段腋芽的萌發(fā)誘導(dǎo)；

(4)待腋芽萌發(fā)后，將莖段轉(zhuǎn)接于wpm+0.5mg/lkt+0.1mg/ltdz+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的增殖培養(yǎng)基中，并于恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度22℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照/黑暗周期16/10h)2周，進(jìn)行腋芽的增殖培養(yǎng)；

(5)待不定芽長(zhǎng)至1.0cm左右，將不定芽轉(zhuǎn)接于1/2wpm+0.2mg/l6-ba+、0.1mg/liba+0.05mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并于恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度22℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照/黑暗周期16/10h)1周，進(jìn)行不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)；

(6)將伸長(zhǎng)的不定芽轉(zhuǎn)接于1/2wpm+0.5mg/liaa+0.2mg/liba+20g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的生根培養(yǎng)基中，并于恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度22℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照/黑暗周期16/10h)2周，進(jìn)行不定芽的生根誘導(dǎo)；最終獲得伴有白色健壯根系的海濱木槿完整植株。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的一種海濱木槿組培再生的方法，均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，包括如下步驟：

(1)從野外選取具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀(具備高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性好中一種或幾種性狀)的多年生海濱木槿植株株系，剪取當(dāng)年生未木質(zhì)化枝條作為外植體的來(lái)源；

(2)枝條去葉后，剪切成5cm大小的莖段，進(jìn)行表面消毒；表面消毒后將莖段切成至少帶有1個(gè)腋芽的長(zhǎng)為1.0cm大小的切段，備用；其中，表面消毒的方式為：將海濱木槿的當(dāng)年生枝條經(jīng)流水沖洗30min，用76％無(wú)水乙醇擦拭后，于無(wú)菌操作臺(tái)中用76％無(wú)水乙醇消毒50s；然后經(jīng)20％的過(guò)氧化氫溶液消毒8min后，再用0.15％升汞溶液消毒5min，最后用無(wú)菌水沖洗6遍；

(3)將得到的海濱木槿莖段切段豎直接種于wpm+3.0mg/lkt、0.5mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并于恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度26℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，進(jìn)行莖段腋芽的萌發(fā)誘導(dǎo)；

(4)待腋芽萌發(fā)后，將莖段轉(zhuǎn)接于wpm+2.0mg/lkt+1.0mg/ltdz+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的增殖培養(yǎng)基中，并于恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度26℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照/黑暗周期16/10h)4周，進(jìn)行腋芽的增殖培養(yǎng)；

(5)待不定芽長(zhǎng)至1.0cm左右，將不定芽轉(zhuǎn)接于1/2wpm+1.0mg/l6-ba+、0.5mg/liba+0.5mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并于恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度26℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，進(jìn)行不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)；

(6)將伸長(zhǎng)的不定芽轉(zhuǎn)接于1/2wpm+2.0mg/liaa+4.0mg/liba+20g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的生根培養(yǎng)基中，并于恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度26℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照/黑暗周期16/10h)4周，進(jìn)行不定芽的生根誘導(dǎo)；最終獲得伴有白色健壯根系的海濱木槿完整植株。

實(shí)施例4

本實(shí)施例測(cè)試了莖段生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)海濱木槿腋芽萌發(fā)及增殖的影響，具體步驟如下：

(1)從野外選取具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀(具備高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性好中一種或幾種性狀)的多年生海濱木槿植株株系，分別剪取當(dāng)年的未木質(zhì)化、半木質(zhì)化和木質(zhì)化的枝條作為外植體的來(lái)源；

(2)枝條去葉后，剪切成5cm大小的莖段，進(jìn)行表面消毒；表面消毒后，將莖段兩端壞死部位切除，再將莖段切成至少帶有1個(gè)腋芽的長(zhǎng)為0.7cm大小的切段，備用；其中，表面消毒的方式為：將海濱木槿的當(dāng)年生枝條經(jīng)流水沖洗10min，用75％無(wú)水乙醇擦拭后，于無(wú)菌操作臺(tái)中用75％無(wú)水乙醇消毒15s；然后經(jīng)10％的過(guò)氧化氫溶液消毒2min后，再用0.1％升汞溶液消毒2min，最后用無(wú)菌水沖洗5遍；

(3)將得到的海濱木槿莖段切段豎直接種于wpm+1.5mg/lkt、0.25mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度24℃，光照強(qiáng)度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，進(jìn)行莖段腋芽的萌發(fā)誘導(dǎo)；

(4)待腋芽萌發(fā)后，將莖段轉(zhuǎn)接于wpm+1.0mg/lkt+0.5mg/ltdz+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的增殖培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度24℃，光照強(qiáng)度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，進(jìn)行腋芽的增殖培養(yǎng)；

(5)待不定芽長(zhǎng)至1.0cm，將不定芽轉(zhuǎn)接于1/2wpm+0.6mg/l6-ba+、0.35mg/liba+0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度24℃，光照強(qiáng)度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，進(jìn)行不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)；

(6)將伸長(zhǎng)的不定芽轉(zhuǎn)接于1/2wpm+1.0mg/liaa+2.0mg/liba+20g/l蔗糖+7.0g/l瓊脂的生根培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)(溫度24℃，光照強(qiáng)度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，進(jìn)行不定芽的生根誘導(dǎo)。

統(tǒng)計(jì)莖段不同生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)海濱木槿腋芽萌發(fā)和增殖的影響，結(jié)果如表1所示。

表1莖段生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)海濱木槿腋芽萌發(fā)和增殖的影響

注：數(shù)據(jù)為平均值，每個(gè)處理包含120個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)三次。

表1研究表明：莖段不同生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)海濱木槿腋芽萌發(fā)無(wú)影響，但對(duì)腋芽的增殖具有一定影響。以木質(zhì)化的莖段為外植體，腋芽的增殖效果最差，增殖率僅為43.4％，且平均每個(gè)外植體僅可產(chǎn)生1.5個(gè)不定芽。而以處于未木質(zhì)化和半木質(zhì)化的海濱木槿莖段為外植體，腋芽的增殖效果較好，且無(wú)明顯差異。其中以處于未木質(zhì)化狀態(tài)的莖段為外植體，腋芽的增殖率高達(dá)90.5％，且平均每個(gè)外植體可產(chǎn)生4.7個(gè)不定芽。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。