本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和生物研究領(lǐng)域，具體涉及一種提高鹵蟲生長和epa含量的營養(yǎng)強化方法。

背景技術(shù)：

鹵蟲(artemiasp.)隸屬于甲殼綱鰓足亞綱無甲目，具有廣泛地理分布和耐鹽耐溫特性。因其具有良好的適口性以及較高的營養(yǎng)價值，鹵蟲幼體和成體被作為水產(chǎn)動物苗種生產(chǎn)中的主要餌料。與鹵蟲卵營養(yǎng)成分不同，孵化后的鹵蟲幼體和成體的蛋白含量和脂肪酸含量隨著發(fā)育的行進發(fā)生變化。該營養(yǎng)成分因個體發(fā)育的自然改變，影響其在水產(chǎn)動物苗種生產(chǎn)中提高存活力和產(chǎn)量的穩(wěn)定性。因此，人們嘗試不同強化餌料以期提高鹵蟲的蛋白質(zhì)和脂肪酸含量。

鹵蟲初孵無節(jié)幼體的蛋白含量在40％以上，脂肪含量在20％以上(干重)，因不同品種和不同的測定方法略有差異。鹵蟲蛋白組成中必須氨基酸約占總氨基酸含量的0.48％，但其中的蛋氨酸含量較少。雖然鹵蟲不飽和脂肪酸含量較高，但孵化后的無節(jié)幼體均含少量的18:3n-3和20:4n-6，并缺乏22:6n-3。與其它餌料動物相比，鹵蟲幼體粗蛋白含量適中，低于短額刺糠蝦，但高于強壯藻鉤蝦等。雖然鹵蟲幼體的總脂肪含量較高，但其中的長鏈不飽和脂肪酸含量遠遠低于其它餌料動物，尤其是epa和dha含量，原因是鹵蟲幼體體內(nèi)易于合成短鏈不飽和脂肪酸。因此，生產(chǎn)中常常采用營養(yǎng)強化方式補充鹵蟲幼體中的蛋白質(zhì)和長鏈不飽和脂肪酸含量。但生化檢測結(jié)果表明，不同餌料的強化飼養(yǎng)，導致鹵蟲幼體體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪(酸)和碳水化合物的含量發(fā)生非均衡性變化。文獻表明，微藻強化投喂后鹵蟲蛋白含量、脂肪酸含量以及碳水化合物含量之間存在負相關(guān)性變化(fábregasj,oteroa,domíngueza,growthrateofthemicroalgatetraselmissuecicachangesthebiochemicalcompositionofartemiaspecies[j].marinebiotechnology(newyork),2001,3(3):256-263)。因此采用合適的餌料有針對性地提高鹵蟲幼體體內(nèi)某一成分是營養(yǎng)強化鹵蟲的根本途徑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明考察了微藻強化投喂對鹵蟲生長和營養(yǎng)價值的影響，選取了三種常用微藻對孵化鹵蟲進行了投喂，并對其生物學長度、蛋白質(zhì)含量、epa(二十碳五烯酸)和dha(二十二碳六烯酸)含量進行了分析，提供了一種提高鹵蟲生長和epa含量的營養(yǎng)強化方法。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種提高鹵蟲生長和epa含量的營養(yǎng)強化方法，在鹵蟲發(fā)育至3齡期間(培養(yǎng)時間72h)，投喂扁藻。所述扁藻優(yōu)選亞心形扁藻platymonassubcordiformis。

優(yōu)選投喂微藻密度：15×10⁴cells/ml。

優(yōu)選微藻餌料初次投喂量：0.5×10⁴cells/ml。

本發(fā)明的另一目的在于提供扁藻在制備提高鹵蟲生長和epa含量的營養(yǎng)強化飼料中的應用。優(yōu)選扁藻為亞心形扁藻platymonassubcordiformis。

可在鹵蟲發(fā)育至3齡期間，持續(xù)投喂含有扁藻的營養(yǎng)強化飼料。

本發(fā)明優(yōu)點：

本發(fā)明所述方法能夠提高藻類餌料的利用率，提高了鹵蟲的生長質(zhì)量，為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供了優(yōu)質(zhì)的餌料。

附圖說明

圖1為微藻營養(yǎng)強化對鹵蟲體長的影響。

圖2為微藻營養(yǎng)強化對鹵蟲蛋白質(zhì)含量的影響。

圖3為微藻營養(yǎng)強化對鹵蟲epa含量的影響。

具體實施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體實施例并參照數(shù)據(jù)進一步詳細描述本發(fā)明。應理解，該實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。下述實例中所用的材料、試劑、裝置、儀器、設(shè)備等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1

本發(fā)明所用鹵蟲(artemiasp.)由渤海灣鹽田鹵蟲卵孵化。試驗所用湛江叉鞭金藻(dicrateriazhanjiangensis)、亞心形扁藻(platymonassubcordiformis)和小球藻(chlorellapyenoidosa)取自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所。

湛江叉鞭金藻、亞心形扁藻和小球藻培養(yǎng)基參照文獻《生物餌料培養(yǎng)》(陳明耀.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995:27-37)，采用自然光照，水溫24℃-26℃。經(jīng)過4天培養(yǎng)，密度分別達到300×10⁴cells/ml、15×10⁴cells/ml和500×10⁴cells/ml，作為微藻餌料。

鹵蟲孵化

100l孵化桶中加入鹽度30‰的海水。準確稱取鹵蟲卵10g放入孵化桶中充氣孵化，孵化溫度28℃。

鹵蟲接種

鹵蟲孵化后，分離并選出健康的無節(jié)幼體用于營養(yǎng)強化試驗，鹵蟲初始接種密度為1000ind/l，置于40l白色塑料桶內(nèi)進行培育，每天50％換水，實驗過程采取微充氣。

強化投喂

鹵蟲發(fā)育至3齡期(培養(yǎng)時間72h)，采用不同微藻餌料營養(yǎng)強化試驗。試驗設(shè)4種餌料處理，以不投喂餌料組為對照，各設(shè)3個平行組。4種餌料分別為江叉鞭金藻、亞心形扁藻、小球藻、混合藻(湛江叉鞭金藻+亞心形扁藻+小球藻)。微藻餌料初次投喂量湛江叉鞭金藻3-4×10⁴cells/ml；亞心形扁藻0.5×10⁴cells/ml；小球藻8-10×10⁴cells/ml；混合藻按照單種藻的1/3來投喂。定時測定餌料密度，及時補加微藻餌料。

1.鹵蟲的體長測量

每試驗樣品隨機取30只鹵蟲，鏡檢測量幼體體長，計算平均體長。

2.蛋白質(zhì)、epa和dha含量的測定

采收不同時間點的鹵蟲幼體，0.1m的pbs(ph7.4)沖洗3次，-20℃保存，用于后續(xù)檢測。蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法(gb5009.5-2010)。epa、dha含量測定：甲醇(3％濃硫酸)、正己烷與樣品體積比例(10:10:1)加入反應器，70℃冷凝回流反應2h。冷卻，倒入分液漏斗靜置，取正己烷層，60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。用色譜純正己烷定容，過膜進樣。氣相條件：色譜柱：hp-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)。進樣口溫度：250℃，進樣量1.0μl，不分流。載氣：he，流速：1.2ml/min。升溫程序：100℃(保持5min)以4℃/min升至240℃(保持20min)。msd傳輸線250℃。質(zhì)譜條件：電離源，ei離子源，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電離能量70ev，全掃描模式，m/z:50～500。定量方法：峰面積百分比法。

將測得的數(shù)據(jù)進行方差分析，并進行多重比較(p<0.01表示差異極顯著，p<0.05表示差異顯著)。

實施例2鹵蟲幼體不同發(fā)育時期體長化

鹵蟲的發(fā)育分期多以齡(instar)表示，性成熟前每蛻皮一次即為1齡，孵化鹵蟲在3齡期消化道才具備生理功能開始攝食。在鹵蟲發(fā)育一齡早期(培養(yǎng)24h)、一齡后期(培養(yǎng)34h)、三齡早期(培養(yǎng)54h)、三齡后期(培養(yǎng)72h)、培養(yǎng)96h、培養(yǎng)120h等6個時間點，測量幼體平均體長。結(jié)果表明，幼體在培養(yǎng)前3天體長增加較快，由0.432mm增加到0.808mm，平均日增長0.125mm；4天后增長幅度減小，達到體長平臺期，結(jié)果如表1所示。

表1鹵蟲幼體不同時期體長

實施例3微藻營養(yǎng)強化對鹵蟲體長的影響

鹵蟲孵化發(fā)育至3齡期，采用湛江叉鞭金藻、亞心形扁藻和小球藻強化投喂鹵蟲24h和48h。保持餌料密度分別為3-4×10⁴、0.5×10⁴和8-10×10⁴cells/ml。強化投喂24h后，鹵蟲幼體體長與對照組相比(未投喂組)略有增加，但沒有顯著差異(p>0.05)；投喂48h后，鹵蟲幼體生長速度明顯加快，體長顯著增加，各投喂組體長極顯著大于對照(p<0.01)，在3種強化藻類中，投喂扁藻對鹵蟲幼體生長的促進作用最為明顯，平均體長達到0.935mm；其次是小球藻，為0.882mm結(jié)果如表2和圖1所示。結(jié)果提示，扁藻強化投喂對鹵蟲幼體生長促進作用最好。

表2微藻營養(yǎng)強化對鹵蟲體長的影響

實施例4微藻營養(yǎng)強化對鹵蟲蛋白質(zhì)含量的影響

采用同樣方法微藻強化投喂鹵蟲24h后，除扁藻組外，其他各組鹵蟲幼體中的蛋白含量略有下降，金藻組下降最為顯著(p<0.05)，而小球藻組和混合組則沒有顯著差異；投喂48h后，各組鹵蟲幼體中蛋白質(zhì)含量除扁藻組外，下降均較為顯著(p<0.05)，結(jié)果如表3和圖2所示。

表3微藻營養(yǎng)強化對鹵蟲蛋白質(zhì)含量的影響

實施例5微藻營養(yǎng)強化對鹵蟲epa和dha含量的影響

不同微藻餌料投喂鹵蟲24h后，鹵蟲幼體中epa含量發(fā)生變化，小球藻組鹵蟲幼體中epa含量顯著高于對照(p<0.05)，而扁藻組顯著低于對照(p<0.05)，混合藻組極顯著低于對照(p<0.01)；微藻餌料投喂48h后，鹵蟲幼體中epa含量顯著增加，各投喂組epa含量均極顯著高于對照(p<0.01)，其中扁藻組含量最高，為3.46％，其次是小球藻組，為3.36％，而混合藻組epa含量升高幅度較低，為2.86％，結(jié)果如表4和圖3所示。結(jié)果提示扁藻微藻營養(yǎng)強化有利于促進鹵蟲幼體epa含量的增加。

表4微藻營養(yǎng)強化對鹵蟲epa含量的影響

本發(fā)明研究表明，在促進鹵蟲幼體生長方面，效果為扁藻組>小球藻組>混合藻組>金藻組(48h)；在提高epa含量方面，扁藻組>小球藻組>金藻組>混合藻組(48h)。投喂上述餌料均會導致鹵蟲粗蛋白含量的降低。因此，在微藻營養(yǎng)強化鹵蟲幼體過程中，可適量補充高蛋白含量的其它餌料。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，對鹵蟲的需求量不斷增加，本發(fā)明一種提高鹵蟲生長和epa含量的營養(yǎng)強化方法。