本發(fā)明涉及一種巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，屬于基因工程和遺傳修飾。

背景技術(shù)：

1、巨噬細(xì)胞（macrophages）是機(jī)體中一種具有吞噬作用的免疫細(xì)胞，實(shí)質(zhì)上為一種位于組織內(nèi)的白血球，在脊椎動(dòng)物體內(nèi)參與非特異性防衛(wèi)（先天性免疫）和特異性防衛(wèi)（細(xì)胞免疫）。它們的主要功能是以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式，清除機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞殘片以及吞噬入侵的病原體，并激活淋巴細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞，令其對(duì)病原體作出反應(yīng)。巨噬細(xì)胞屬于免疫細(xì)胞，具有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分析免疫學(xué)的重要對(duì)象。

2、但是，巨噬細(xì)胞是一種極具異質(zhì)性的細(xì)胞群體，在體內(nèi)不同組織和器官以及復(fù)雜的微環(huán)境中，表現(xiàn)出獨(dú)特的表型和功能，例如：小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（cns）中駐留的巨噬細(xì)胞，在組織損傷以及疾病狀態(tài)下能快速的啟動(dòng)免疫應(yīng)答，主要是通過呈遞抗原、分泌促炎或抑炎的細(xì)胞因子、趨化因子以及吞噬病原菌或凋亡的細(xì)胞起作用；肝臟中最主要的巨噬細(xì)胞是肝臟駐留巨噬細(xì)胞（kupffer?cells，kcs），kcs細(xì)胞具有先天性免疫功能，可以維持免疫耐受、清除病原微生物，在受到不同信號(hào)刺激時(shí)能進(jìn)行功能分化，并隨后活化促炎反應(yīng)；脾臟中最主要的巨噬細(xì)胞群是紅髓巨噬細(xì)胞（red?pulp?macrophages，rpms），其定位于脾臟的紅髓，主要功能是清除衰老的紅細(xì)胞，并在控制感染以及誘導(dǎo)先天性和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用。因此，為了進(jìn)一步研究不同組織和器官中巨噬細(xì)胞的功能，并實(shí)現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤，構(gòu)建巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠遺傳模型十分必要，其對(duì)巨噬細(xì)胞功能研究具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，為現(xiàn)有技術(shù)提供一種能夠?qū)π∈蟠竽X中的小膠質(zhì)細(xì)胞和脾臟中的巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行示蹤的小鼠模型。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法的技術(shù)方案是：

3、一種巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：通過crispr/cas9基因組編輯技術(shù)，將cre-p2a-mcherry元件定點(diǎn)插入小鼠c1qc基因位點(diǎn)中，獲得巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型。

4、上述技術(shù)方案的有益效果在于：一種巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法為開拓型發(fā)明。本發(fā)明首次通過crispr/cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)c1qc基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯后獲得了一種全新的c1qc-crechy基因敲入小鼠模型（即巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型），實(shí)現(xiàn)了cre和mcherry的表達(dá)直接受c1qc啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)，并通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了mcherry僅在小鼠大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞和脾臟中的巨噬細(xì)胞中具有很高的表達(dá)量，而其它免疫細(xì)胞中均未檢測(cè)到mcherry表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)這兩種巨噬細(xì)胞進(jìn)行示蹤，用于研究其功能。本發(fā)明為研究巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性提供了一種可使用的動(dòng)物模型，而且對(duì)研究機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的免疫功能提供一種新的動(dòng)物模型。

5、進(jìn)一步地，可利用本發(fā)明制備的小鼠模型制作在巨噬細(xì)胞中條件性敲除基因的小鼠模型，為研究體內(nèi)復(fù)雜的免疫功能和免疫變化奠定基礎(chǔ)。

6、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述小鼠c1qc基因位點(diǎn)的靶序列為：

7、c1qc-sgrna：5’-tgggtccaacgaccatcctgagg-3’（seq?id?no.1所示）。

8、上述技術(shù)方案的有益效果在于：利用上述sgrna能實(shí)現(xiàn)基因原件的穩(wěn)定、成功、高效地敲入，為成功構(gòu)建小鼠模型奠定基礎(chǔ)。

9、進(jìn)一步地，本發(fā)明將cre-p2a-mcherry元件直接插入c1qc基因起始密碼子之后和1號(hào)外顯子之前，與傳統(tǒng)的將表達(dá)元件直接插入終止密碼子前面相比，在不破壞內(nèi)部基因c1qc表達(dá)的同時(shí)，也可以保證cre和mcherry具有更高的表達(dá)量，使cre具有更好的活性，mcherry具有更高的熒光亮度。

10、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述cre-p2a-mcherry元件還包括5’同源臂序列和3’同源臂序列。

11、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述cre-p2a-mcherry元件的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

12、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，定點(diǎn)插入時(shí)，將cas9?mrna、sgrna和cre-p2a-mcherry元件dna混合注入小鼠受精卵中，進(jìn)一步將存活的受精卵細(xì)胞移植入假孕小鼠輸卵管，獲得founder小鼠。

13、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述構(gòu)建方法包括對(duì)founder小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)，篩選出基因組中cre-p2a-mcherry元件序列插入而且插入位點(diǎn)正確的小鼠個(gè)體，獲得巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型。

技術(shù)特征：

1.一種巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：通過crispr/cas9基因組編輯技術(shù)，將cre-p2a-mcherry元件定點(diǎn)插入小鼠c1qc基因位點(diǎn)中，獲得巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述小鼠c1qc基因位點(diǎn)的靶序列為：

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述cre-p2a-mcherry元件還包括5’同源臂序列和3’同源臂序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述cre-p2a-mcherry元件的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于：定點(diǎn)插入時(shí)，將cas9?mrna、sgrna和cre-p2a-mcherry元件dna混合注入小鼠受精卵中，進(jìn)一步將存活的受精卵細(xì)胞移植入假孕小鼠輸卵管，獲得founder小鼠。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述構(gòu)建方法包括對(duì)founder小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)，篩選出基因組中cre-p2a-mcherry元件序列插入而且插入位點(diǎn)正確的小鼠個(gè)體，獲得巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種巨噬細(xì)胞特異性熒光報(bào)告小鼠模型的構(gòu)建方法，屬于基因工程和遺傳修飾技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)C1qc基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯后獲得了一種全新的C1qc?CreChy基因敲入小鼠模型，實(shí)現(xiàn)了Cre和mCherry的表達(dá)直接受C1qc啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)，并通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了mCherry僅在小鼠大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞和脾臟中的巨噬細(xì)胞中具有很高的表達(dá)量，而其它免疫細(xì)胞中均未檢測(cè)到mCherry表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)這兩種巨噬細(xì)胞進(jìn)行示蹤，用于研究其功能。本發(fā)明為研究巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性提供了一種可使用的動(dòng)物模型，而且對(duì)研究機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的免疫功能提供一種新的動(dòng)物模型。

技術(shù)研發(fā)人員：梁銀明,張黎琛,葛金文,徐琳本,彭麗霞,杜青,郭學(xué)俊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：湖南省中醫(yī)藥研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2