本技術(shù)涉及畜牧生物的，具體涉及一種牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑及冷凍保存方法。

背景技術(shù)：

1、隨著畜牧生物技術(shù)的發(fā)展，對牛卵母細(xì)胞的冷凍保存需求日益增加。目前，雖有多種保護(hù)劑和方法被用于細(xì)胞的冷凍保存，但牛卵母細(xì)胞的特殊性使得其在冷凍保存過程中仍然面臨細(xì)胞損傷和存活率低的問題。

2、傳統(tǒng)的冷凍保存方法常常導(dǎo)致牛卵母細(xì)胞在冷凍和解凍過程中，可能受到冰晶形成的損傷，冰晶在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間形成可能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得膜破損、細(xì)胞骨架紊亂等，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損，嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育和受精能力。因此，急需開發(fā)一種牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑及冷凍保存方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本技術(shù)提供一種牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑及冷凍保存方法。

2、第一方面，本技術(shù)提供了一種牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，具體包括以下濃度的組分：賦形劑510-595mg/l、抗氧化劑220-280mg/l、抗生素20-30mg/l、鹽類物質(zhì)120-180mg/l、乙醇320-380mg/l、甘油65-85mg/l、胎牛血清55-68mg/l；

3、所述賦形劑由重量比為10：2-6：0.5-1.5的聚蔗糖、膠原蛋白、雨蛙素混合組成；所述膠原蛋白的規(guī)格為：ii型、來源于牛鼻膜、分子量為3000-4000；

4、所述抗生素由重量比為1-3：1-3的卡那霉素與萘啶酮酸混合組成。

5、本技術(shù)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用賦形劑、抗生素與特定重量份的抗氧化劑、鹽類物質(zhì)、乙醇、甘油、胎牛血清作為牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的原料組分，在冷凍、脫水干燥失水等惡劣環(huán)境條件下，能在牛卵母細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)牛卵母細(xì)胞不發(fā)生變性失活，可以保護(hù)牛卵母細(xì)胞在冷凍干燥過程的完整性和生物活性，且可以保護(hù)卵母細(xì)胞的受精能力和后續(xù)發(fā)育能力。

6、本技術(shù)利用聚蔗糖、膠原蛋白、雨蛙素作為牛卵母細(xì)胞脫水干燥品中的賦形劑，聚蔗糖結(jié)構(gòu)中的羥基，可以取代蛋白質(zhì)和水之間的氫鍵來提供穩(wěn)定的效果；ii型膠原蛋白中絲狀的膠原蛋白纖維與彈性蛋白及多糖蛋白相互交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生一定的機(jī)械強(qiáng)度，避免冷凍過程中牛卵母細(xì)胞在脫水過程中被損壞；雨蛙素多肽物質(zhì)，是一種優(yōu)良的相容性溶質(zhì)，與聚蔗糖、膠原蛋白組合后能夠促使聚蔗糖糖類物質(zhì)快速透入牛卵母細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，能使細(xì)胞內(nèi)的水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，并延緩解凍過程，減少細(xì)胞內(nèi)的冰晶，從而減輕解凍過程對牛卵母細(xì)胞的損傷。即，賦形劑能夠用于穩(wěn)定牛卵母細(xì)胞及其活性，尤其是在脫水干燥過程中可以起到很好的細(xì)胞保護(hù)作用，進(jìn)而減少細(xì)胞損傷，使細(xì)胞始終保持其自身活性。

7、同時(shí)，本技術(shù)的申請人還發(fā)現(xiàn)利用重量比為1.2：2.5的卡那霉素與四環(huán)素混合組成抗生素，使用20-30mg/l少量濃度加入至保護(hù)劑中，可以作為保護(hù)劑載體或輔助成分，既能在冷凍過程中保護(hù)細(xì)胞，又能在解凍后發(fā)揮抗生素的作用，防止因冷凍過程中可能引入的或解凍后環(huán)境中的微生物污染，抑制溶液的微生物變化，從而達(dá)到保護(hù)活性組分的目的，進(jìn)而減少細(xì)胞損傷，使細(xì)胞始終保持其自身活性。在試驗(yàn)過程中，申請人發(fā)現(xiàn)使用其他種類的抗生素作為冷凍保護(hù)劑中的原料組分，細(xì)胞的存活率較低，或者受精之后的卵裂率和囊胚率較低；這說明抗生素的種類對于牛卵母細(xì)胞的冷凍具有較大的影響，只有合理地選擇重量比為1.2：2.5的卡那霉素與四環(huán)素混合組成抗生素與其他原料配合使用，才能達(dá)到保護(hù)牛卵母細(xì)胞的目的。

8、此外，冷凍保護(hù)劑中的抗氧化劑物質(zhì)可用作防止牛卵母細(xì)胞在冷凍脫水干燥過程以及儲藏過程中發(fā)生氧化變質(zhì)，有效清除體系中的自由基，抑制牛卵母細(xì)胞氧化損傷。鹽類物質(zhì)能夠在牛卵母細(xì)胞的冷凍脫水過程中調(diào)節(jié)溶液的ph變化，進(jìn)而保護(hù)活性組分的功能。乙醇和甘油作為細(xì)胞冷凍過程中的填充劑和低溫保護(hù)劑，在冷凍過程時(shí)會結(jié)晶，從而為活性組分提供支撐結(jié)構(gòu)，且不與其他活性組分發(fā)生反應(yīng)；同時(shí)可以與賦形劑共同作用提高細(xì)胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，并延緩解凍過程，減少細(xì)胞內(nèi)的冰晶，減輕解凍過程對牛卵母細(xì)胞的損傷。

9、因此，本技術(shù)提供的冷凍保護(hù)劑對牛卵母細(xì)胞脫水干燥具有出乎意料的保護(hù)作用，所得的牛卵母細(xì)胞脫水干燥制劑安全性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、回收率高，冷凍脫水對牛卵母細(xì)胞的影響極小，利于牛卵母細(xì)胞的長期貯存和運(yùn)輸。

10、牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑中各組分濃度與牛卵母細(xì)胞脫水干燥過程中的保護(hù)直接相關(guān)，當(dāng)濃度過小時(shí)，保護(hù)作用較弱；而當(dāng)濃度達(dá)到一定的程度之后，對細(xì)胞的穩(wěn)定作用能力達(dá)到極限，過高濃度反過來會使得脫水干燥過程中細(xì)胞發(fā)生變性，導(dǎo)致細(xì)胞功能損失。因此，本技術(shù)需要合理控制各原料組分的濃度為上述范圍。

11、優(yōu)選地，所述牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑具體包括以下濃度的組分：賦形劑530-560mg/l、抗氧化劑240-260mg/l、抗生素23-28mg/l、鹽類物質(zhì)140-160mg/l、乙醇340-360mg/l、甘油70-80mg/l、胎牛血清60-64mg/l。

12、優(yōu)選地，所述賦形劑由重量比為10：3-5：0.7-1.3的聚蔗糖、膠原蛋白、雨蛙素混合組成。

13、進(jìn)一步地，所述賦形劑由重量比為10：3.5-4.5：0.9-1.1的聚蔗糖、膠原蛋白、雨蛙素混合組成。

14、在一些具體的實(shí)施方案中，所述賦形劑中，聚蔗糖、膠原蛋白、雨蛙素的重量比可以為10：2-3.5：1.5、10：3-4.5：1.3-1.5、10：3.5-4.5：1.1-1.3、10：4-4.5：1、10：4.5：0.9-1.3、10：5：0.7-1.1、10：6：0.5-1.3。

15、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述賦形劑中，聚蔗糖、膠原蛋白、雨蛙素的重量比還可以為10：2：1.5、10：3：1.3、10：3.5：1.1、10：4：1、10：4.5：0.9、10：5：0.7、10：6：0.5。

16、經(jīng)過試驗(yàn)分析可知，本技術(shù)利用上述重量比的聚蔗糖、膠原蛋白、雨蛙素混合組成賦形劑，可以進(jìn)一步提高牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用效果。

17、優(yōu)選地，所述抗生素中，所述卡那霉素的用量少于所述萘啶酮酸的用量。

18、優(yōu)選地，所述抗生素由重量比為1-1.5：2-3的卡那霉素與萘啶酮酸混合組成。

19、在一些具體的實(shí)施方案中，所述抗生素中，卡那霉素與萘啶酮酸的重量比可以為1-1.2：1、1-1.2：2、1-1.2：2.5、1-1.2：3、1.2-1.5：1、1.2-1.5：2、1.2-1.5：2.5、1.2-1.5：3、1.5：1-2、1.5：2、1.5-2：2.5、1.5：2-3、2：1-2、2：2.5-3、2：2-3、3：1-2、3：2-3、2：2.5-3。

20、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述抗生素中，卡那霉素與萘啶酮酸的重量比還可以為1：1、1：2、1：2.5、1：3、1.2：1、1.2：2、1.2：2.5、1.2：3、1.5：1、1.5：2、1.5：2.5、1.5：3、2：1、2：2.5、2：3、3：1、3：2、2：2.5。

21、經(jīng)過試驗(yàn)分析可知，本技術(shù)利用上述重量比的卡那霉素與萘啶酮酸作為抗生素，可以進(jìn)一步提高牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用效果。

22、優(yōu)選地，所述抗氧化劑選自維生素e、谷胱甘肽中的任意一種或多種。

23、優(yōu)選地，所述鹽類物質(zhì)選自氯化鈉、氯化鉀、n-乙酰色氨酸鈉、辛酸鈉、碳酸氫鈉中的一種或多種。

24、優(yōu)選地，所述牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑中，溶劑為hepes緩沖液，ph為6.6-7.4。

25、本技術(shù)提供的冷凍保護(hù)劑以hepes緩沖液作為緩沖體系，可以有效穩(wěn)定牛卵母細(xì)胞在冷凍過程中所處環(huán)境的ph，在干燥和儲藏過程中，能將牛卵母細(xì)胞干燥制品的ph調(diào)整到活性物質(zhì)的最穩(wěn)定區(qū)域，進(jìn)而保護(hù)牛卵母細(xì)胞的完整性和生物活性。

26、第二方面，本技術(shù)提供了一種牛卵母細(xì)胞冷凍保存方法，利用上述牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存。

27、優(yōu)選地，所述牛卵母細(xì)胞冷凍保存方法具體包括以下步驟：將牛卵母細(xì)胞移入處理液中平衡30-60s后，移入所述冷凍保護(hù)劑中平衡25-45s，然后經(jīng)過液氮冷凍保存；所述預(yù)處理液由eg、dmso、fbs、dpbs按1：1：2：6的體積比配制得到。

28、綜上所述，本技術(shù)的技術(shù)方案具有以下效果：

29、本技術(shù)利用賦形劑、抗生素與特定重量份的抗氧化劑、鹽類物質(zhì)、乙醇、甘油、胎牛血清作為牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的原料組分，在冷凍、脫水干燥失水環(huán)境條件下，能有效地保護(hù)牛卵母細(xì)胞不發(fā)生變性失活，可以保護(hù)牛卵母細(xì)胞在冷凍干燥過程的完整性和生物活性，且可以保護(hù)卵母細(xì)胞的受精能力和后續(xù)發(fā)育能力。

30、本技術(shù)研發(fā)的高效的牛卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑及冷凍保存方法，以便在長期保存和運(yùn)輸過程中保持其活性和穩(wěn)定性，可滿足后續(xù)研究或?qū)嶋H應(yīng)用需求，有助于牛種的保護(hù)和利用。