本發(fā)明屬于基因編輯育種，具體涉及一種基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法。

背景技術：

1、燕麥是禾本科燕麥屬一年生草本植物，主要分布于我國內蒙古、河北、甘肅等地區(qū)。作為糧飼兼用型作物，燕麥具有產草量高，耐旱、抗寒、耐貧瘠等優(yōu)良特性，還具有營養(yǎng)成分含量高、適口性好、消化率高、適宜于青飼或調制干草等優(yōu)點。同時，燕麥在保障國家糧食安全、保護生態(tài)環(huán)境、促進農業(yè)增效等方面具有重要作用。因此，燕麥是一種極具開發(fā)價值的草種。

2、組織培養(yǎng)技術，是利用植物的全能性理論的無性繁殖技術，通過分離出植物組織中胚芽尖為外植體，然后放置于不同培養(yǎng)基進行無菌培養(yǎng)。組織培養(yǎng)技術具有繁殖速度快、生產效率高、保持原有品種的固有形狀和特性、節(jié)約土地和節(jié)約繁殖材料等顯著優(yōu)點。

3、合適外植體的選擇是組織培養(yǎng)技術建立的首要步驟，它直接關系到后續(xù)培養(yǎng)的成功與否。然而，在燕麥胚芽尖的愈傷組織誘導及再生體系建立過程中，仍存在效率低、再生能力差的問題，因此，探索新的方法和策略，如引入具有生物活性的小肽，以優(yōu)化培養(yǎng)條件、提高誘導效率和再生能力，對于推動燕麥作物遺傳改良和現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展具有重要意義。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述背景技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

3、基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，該方法包括以下步驟：

4、(1)將去皮燕麥種子進行消毒處理，之后用無菌水浸泡；

5、(2)浸泡后的燕麥種子用無菌水多次沖洗，然后將燕麥種子置于1/2ms培養(yǎng)基中，在恒溫26±1℃下黑暗培養(yǎng)2d；所述1/2ms培養(yǎng)基為：ms?base?salts?2.17g/l+蔗糖30g/l+瓊脂7g/l，ph＝5.8；

6、(3)待燕麥種子發(fā)芽長度為0.1～0.3cm，取胚芽尖放于添加有小肽的誘導培養(yǎng)基中，在恒溫26±1℃下黑暗培養(yǎng)29～31d；所述誘導培養(yǎng)基為：l3?base?salts4.49g/l+鹽酸硫胺素10mg/l+l-谷氨酰胺420mg/l+2,4-d?2mg/l+水解酪蛋白0.25g/l+mes1.95g/l+麥芽糖30g/l+植物凝膠3.5g/l+小肽1nm，ph＝5.8；

7、(4)轉入添加有小肽的分化和增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至苗長為2～3cm；所述分化和增殖培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+6-ba?2mg/l+naa?0.5mg/l+小肽1nm，ph＝5.7；

8、(5)轉入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至待分化苗的根長為5～7cm；所述生根培養(yǎng)基采用基礎培養(yǎng)基；

9、(6)將苗移出，開瓶煉苗，然后洗凈根部，使用滅菌后的蛭石培養(yǎng)，獲得完整的再生植株。

10、優(yōu)選地，步驟(1)中，所述消毒處理為：將燕麥種子先用75％c2h5oh浸泡1min，之后用超純水清洗燕麥種子4～6次；再用5％?naclo浸泡7min，之后用無菌超純水清洗燕麥種子5～7次，清洗后加入無菌超純水，沒過燕麥種子。

11、優(yōu)選地，步驟(2)中，所述1/2ms培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：放置于恒溫26±1℃條件下黑暗培養(yǎng)2d。

12、優(yōu)選地，步驟(3)中，所述誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：放置于恒溫26±1℃條件下黑暗培養(yǎng)30d。

13、優(yōu)選地，步驟(4)中，所述分化和增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng)，光照強度為4300～4800lux，培養(yǎng)時長為14h·d-1，培養(yǎng)溫度為26±1℃。

14、優(yōu)選地，步驟(5)中，所述生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng)，光照強度為4300～4800lux，光照時長為14h·d-1，培養(yǎng)溫度為26±1℃。

15、優(yōu)選地，步驟(4)～(5)中，所述基礎培養(yǎng)基為：ms?base?salts4.33?g/l+麥芽糖30g/l+植物凝膠3.5g/l，ph＝5.7。

16、相比于現(xiàn)有技術的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：

17、(1)本發(fā)明在燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立過程中，所采用的誘導培養(yǎng)基及分化和增殖培養(yǎng)基中均添加了具有生物活性的小肽，其能夠調控植物局部傷口響應與再生能力，增強燕麥胚芽在體外培養(yǎng)中誘導愈傷組織的能力，優(yōu)化了愈傷組織的再生條件，從而構建了一個高效、穩(wěn)定的燕麥再生體系。

18、(2)本發(fā)明提供的基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，具有繁殖速度快、生產效率高、保持原有品種固有形狀和特性等優(yōu)點，為順利開展基因編輯以及燕麥種質創(chuàng)新工作的順利推進提供重要研究依據(jù)。

技術特征：

1.基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權利要求1所述的基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，其特征在于，步驟(1)中，所述消毒處理為：將燕麥種子先用75％c2h5oh浸泡1min，之后用超純水清洗燕麥種子4～6次；再用5％naclo浸泡7min，之后用無菌超純水清洗燕麥種子5～7次，清洗后加入無菌超純水，沒過燕麥種子。

3.如權利要求1所述的基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，其特征在于，步驟(2)中，所述1/2ms培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：放置于恒溫26±1℃條件下黑暗培養(yǎng)2d。

4.如權利要求1所述的基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，其特征在于，步驟(3)中，所述誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：放置于恒溫26±1℃條件下黑暗培養(yǎng)30d。

5.如權利要求1所述的基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，其特征在于，步驟(4)中，所述分化和增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng)，光照強度為4300～4800lux，培養(yǎng)時長為14h·d-1，培養(yǎng)溫度為26±1℃。

6.如權利要求1所述的基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，其特征在于，步驟(5)中，所述生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng)，光照強度為4300～4800lux，光照時長為14h·d-1，培養(yǎng)溫度為26±1℃。

7.如權利要求1所述的基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，其特征在于，步驟(4)～(5)中，所述基礎培養(yǎng)基為：ms?base?salts4.33?g/l+麥芽糖30g/l+植物凝膠3.5g/l，ph＝5.7。

技術總結
本發(fā)明公開了一種基于小肽的燕麥胚芽尖愈傷組織誘導及高效再生體系的建立方法，首先將預處理的燕麥種子置于1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)；待種子發(fā)芽一定長度時取胚芽尖部放于添加小肽的誘導培養(yǎng)基中進行誘導，然后轉至添加小肽的分化和增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，再轉入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至一定根長的分化苗；最后移出苗、煉苗、蛭石培養(yǎng)，獲得完整的再生植株。本發(fā)明選擇燕麥胚芽為外植體進行植物組織再生培養(yǎng)，材料低廉易得，操作簡單，通過引入能夠調控植物局部傷口響應與再生能力的小肽，增強了燕麥胚芽尖部在體外培養(yǎng)中誘導愈傷組織的能力，優(yōu)化了愈傷組織的再生條件，從而構建了一個高效、穩(wěn)定的燕麥再生體系，為基因編輯以及燕麥種質創(chuàng)新提供重要依據(jù)。

技術研發(fā)人員：胡濤,朱夢馨,王惠萍,龐蕓蕓,李展鵬,楊晨悅
受保護的技術使用者：蘭州大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/30