本發(fā)明涉及動(dòng)物模型領(lǐng)域，具體涉及一種帕金森病認(rèn)知障礙小鼠模型的構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、帕金森病(pd)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，而認(rèn)知功能障礙是帕金森病較為常見的非運(yùn)動(dòng)癥狀之一，包括帕金森病輕度認(rèn)知障礙(pd-mci)和帕金森病癡呆(pdd)[1]。pd-mci發(fā)病率高，并可在帕金森病早期出現(xiàn)，其每年進(jìn)展為癡呆的幾率為6％～15％，嚴(yán)重影響到患者社會(huì)功能及生活質(zhì)量，給患者和社會(huì)帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)。因此，針對(duì)帕金森病認(rèn)知障礙研究對(duì)發(fā)現(xiàn)認(rèn)知障礙機(jī)制以及改善和治療認(rèn)知障礙具有重要意義。介于倫理限制，動(dòng)物疾病模型被廣泛應(yīng)用于帕金森病的研究，其主要分為神經(jīng)毒素模型和基因模型[2]。然而，以往的模型構(gòu)建主要關(guān)注多巴胺能神經(jīng)元變性、路易小體形成以及運(yùn)動(dòng)缺陷等，缺乏伴有認(rèn)知障礙的帕金森病動(dòng)物模型構(gòu)建方法。

2、snca基因于1997年首次被發(fā)現(xiàn)與帕金森病相關(guān)[3]，其編碼的α-syn是主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前及核周的可溶性蛋白，是帕金森病特征病理標(biāo)志路易小體的重要組成部分。為研究帕金森病疾病進(jìn)展，大量研究集中于α-syn轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，目前已鑒定出三種完全外顯的常染色體顯性snca點(diǎn)突變，a53t、a30p和e46k[4,5]，這些突變會(huì)導(dǎo)致α-syn表達(dá)異常并在神經(jīng)元內(nèi)聚集形成路易小體，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙死亡。研究者們期望通過(guò)培育攜帶這些突變的轉(zhuǎn)基因小鼠模擬帕金森病，其中，a53t突變小鼠品系體內(nèi)包涵體的組成和位置與人類神經(jīng)元α-syn聚集有一定相似性，且病理變化以及行為學(xué)異常具有進(jìn)展性，與人類帕金森病發(fā)病過(guò)程更為相似，故a53t轉(zhuǎn)基因鼠被廣泛用作帕金森病模型小鼠[6]。但現(xiàn)在未有同時(shí)具有帕金森病病理特征和認(rèn)知障礙癥狀的帕金森病小鼠模型，因此有必要研究一種能夠更全面模擬帕金森病的模型。

3、參考文獻(xiàn)

4、[1]baiano?c,barone?p,trojano?l,et?al.prevalence?and?clinical?aspectsof?mild?cognitive?impairment?in?parkinson's?disease:a?meta-analysis.movdisord.2020；35(1):45-54.

5、[2]stoker?tb,greenland?jc.parkinson’s?disease:pathogenesis?andclinical?aspects.brisbane(au):codon?publications；2018dec?21.

6、[3]spillantini?mg,schmidt?ml,lee?vm,et?al.alpha-synuclein?in?lewybodies.nature.1997；388(6645):839-40

7、[4]ferese?r,modugno?n,campopiano?r,et?al.four?copies?of?sncaresponsible?for?autosomal?dominant?parkinson's?disease?in?two?italiansiblings.parkinsons?dis.2015；2015:546462.

8、[5]seo?sh,bacolla?a,yoo?d,et?al.replication-based?rearrangements?area?common?mechanism?for?snca?duplication?in?parkinson's?disease.movdisord.2020；35(5):868-876.

9、[6]giasson?bi,duda?je,quinn?sm,zhang?b,trojanowski?jq,lee?vm.neuronalalpha-synucleinopathy?with?severe?movement?disorder?in?mice?expressing?a53thuman?alpha-synuclein.neuron.2002；34(4):521-33.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的在于提供一種帕金森病認(rèn)知障礙小鼠模型的構(gòu)建方法。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供上述帕金森病認(rèn)知障礙小鼠模型的構(gòu)建方法的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

4、一種帕金森病認(rèn)知障礙小鼠模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：在a53tα-syn小鼠的基礎(chǔ)上再將trem2基因失活，得到具有海馬α-syn病理性沉積、并伴有明顯的認(rèn)知障礙特征的帕金森病認(rèn)知障礙小鼠模型。

5、所述的失活是通過(guò)基因編輯方法敲除trem2基因?qū)崿F(xiàn)失活；優(yōu)選為敲除trem2基因的外顯子2和外顯子3片段。

6、所述的在a53tα-syn小鼠的基礎(chǔ)上再將trem2基因失活是通過(guò)如下步驟進(jìn)行：通過(guò)基因編輯方法敲除野生型小鼠的trem2基因，敲除成功得到的小鼠再和野生型小鼠交配，得到trem2+/-雜合子；再將trem2+/-雜合子與a53tα-syn小鼠交配，選取trem2+/-/a53tα-syn小鼠多輪次交配，得到具有海馬α-syn病理性沉積、并伴有明顯的認(rèn)知障礙特征的帕金森病認(rèn)知障礙小鼠模型trem2-/-a53tα-syn。

7、所述的基因編輯靶向的基因片段優(yōu)選為trem2基因的外顯子2和3。

8、所述的基因編輯中的sgrna序列優(yōu)選如下：

9、trem2-l4：5’-caagaacagagacacgagagg-3’；

10、trem2-r5：5’-atgtggaagagctcatcgggg-3’。

11、所述的基因編輯的具體操作步驟優(yōu)選如下：將sgrna與加帽cas9?mrna通過(guò)顯微注射法注射到野生型小鼠受精卵中，再轉(zhuǎn)移到假孕母鼠體內(nèi)，然后對(duì)出生后的小鼠篩選，得到敲除成功的小鼠。

12、所述的sgrna的濃度優(yōu)選為5～30ng/μl；更優(yōu)選為15ng/μl。

13、所述的加帽cas9?mrna的濃度優(yōu)選為50～100ng/μl；更優(yōu)選為75ng/μl。

14、所述的sgrna和所述的cas9?mrna優(yōu)選按濃度比1：5～10配比；更優(yōu)選按濃度比1：5配比。

15、所述的野生型小鼠優(yōu)選為c57bl/6系小鼠；更優(yōu)選為c57bl/6j小鼠。

16、所述的成年a53tα-syn小鼠采用的是人突變型a53tα-syn帕金森病轉(zhuǎn)基因小鼠。

17、上述帕金森病認(rèn)知障礙小鼠模型的構(gòu)建方法在研究帕金森病認(rèn)知障礙的作用機(jī)制和/或治療靶點(diǎn)中的應(yīng)用，具有重要作用。

18、本發(fā)明的有益效果：

19、本發(fā)明利用基因編輯技術(shù)敲除野生型小鼠trem2基因，通過(guò)與a53tα-syn小鼠交配、篩選，得到帕金森病認(rèn)知障礙小鼠模型(基因型為trem2-/-/a53tα-syn)。本發(fā)明通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)多個(gè)指標(biāo)共同驗(yàn)證該模型小鼠認(rèn)知障礙的發(fā)生，可重復(fù)性強(qiáng)，遺傳穩(wěn)定，為帕金森病認(rèn)知障礙模型的構(gòu)建提供了一種可靠的方法，為探究帕金森病認(rèn)知障礙的作用機(jī)制以及治療策略提供了重要依據(jù)，為臨床緩解帕金森病認(rèn)知障礙癥狀和藥物研發(fā)建立基礎(chǔ)。