本發(fā)明涉及植物繁殖，具體地說(shuō)是一種提高極危植物狹葉坡壘頑拗性種子利用率的方法。

背景技術(shù)：

1、狹葉坡壘(hopea?chinensis?hand.-mazz.)又名華南坡壘、窄葉坡壘、隸屬于龍腦香科(dipterocarpaceae)坡壘屬(hopea)，為廣西特有極度瀕危樹(shù)種。常綠喬木，高可達(dá)30m，胸徑50～100cm，生于海拔600m以下的山麓、溝谷、山坡林中，為桂南北熱帶常綠季雨林代表樹(shù)種之一，對(duì)研究熱帶雨林區(qū)系構(gòu)成、地理分布和生態(tài)習(xí)性具有重要價(jià)值。同時(shí)，其木材紋理交錯(cuò)、結(jié)構(gòu)細(xì)致、材質(zhì)堅(jiān)硬，耐腐力極強(qiáng)，埋入土中百年不腐，是優(yōu)良的特種用材樹(shù)種，被稱(chēng)為“萬(wàn)年木”，可作為軍工、機(jī)械和高級(jí)家具等用材；所產(chǎn)樹(shù)脂類(lèi)似達(dá)麻脂，可供噴漆制造等；樹(shù)皮具龍袍狀花紋，因此亦有“龍袍樹(shù)”之稱(chēng)；副產(chǎn)品為芳香油類(lèi)，可作高檔化妝品和名貴中藥材料，價(jià)值極高。

2、狹葉坡壘屬于第三紀(jì)的殘留種，分布在局部地形所形成的“避難所”中，原產(chǎn)于廣西十萬(wàn)大山、大青山地區(qū)，但由于人類(lèi)生產(chǎn)生產(chǎn)活動(dòng)的破壞以及氣候變遷的影響，種群數(shù)量急劇減少。調(diào)查表明，現(xiàn)在大青山的狹葉坡壘種群已經(jīng)滅亡，目前僅在十萬(wàn)大山自然保護(hù)區(qū)及周邊區(qū)域還有少量野生狹葉坡壘分布。近20年來(lái)野生狹葉坡壘個(gè)體數(shù)量急劇減少，瀕臨物種消失的威脅，已被劃為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物，被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(iucn)列為極危(cr)物種。對(duì)其瀕危機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)其結(jié)實(shí)稀少，且存在大小年現(xiàn)象，個(gè)別年份甚至不結(jié)實(shí)，野生種群分布范圍極度萎縮，面臨滅絕的危險(xiǎn)，急需加以保護(hù)。

3、通過(guò)保育措施，擴(kuò)大種群數(shù)量是拯救瀕危植物的最基本條件。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)狹葉坡壘野生種群種子向幼苗的轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低，因?yàn)槠浞N子是典型的頑拗性種子。頑拗性種子一旦遭遇干旱，或是不能掉落在適合生長(zhǎng)土壤環(huán)境中，種子會(huì)快速失水，種子的壽命和活力將大幅降低，甚至完全失活不能萌發(fā)。狹葉坡壘野生植株多生長(zhǎng)在溪水岸邊，種子主要依靠重力傳播，成熟后的種子很多掉落在母株附近的溪水里，掉落溪水中的種子多數(shù)被水浸壞，難以萌發(fā)成苗。而且因其種子的頑拗性特征，至今尚未有成熟的保存技術(shù)，采集的新鮮種子必須即采即播，一旦放入冰箱或是失水便失去活力，如果在種子失活前沒(méi)有適合的育苗條件，便會(huì)徹底無(wú)法萌發(fā)成長(zhǎng)為幼苗，嚴(yán)格地將種子萌發(fā)利用的時(shí)間限制在臨近種子成熟采收的時(shí)間，大大限制了種子利用率。迄今，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有涉及狹葉坡壘種子育苗的相關(guān)報(bào)道。為更好地恢復(fù)其種群，拯救這一極危植物，提高種子利用率，促使其種子更多地轉(zhuǎn)化成幼苗具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是：為解決狹葉坡壘頑拗性種子無(wú)法實(shí)現(xiàn)保存、易失活等導(dǎo)致種子轉(zhuǎn)化成苗少，利用率不高等技術(shù)問(wèn)題，在種子數(shù)量一定的情況下，促使其更多的轉(zhuǎn)化成幼苗，且實(shí)現(xiàn)一定時(shí)間內(nèi)保存種質(zhì)資源，節(jié)省育苗空間，可控育苗條件，提高種子利用率。

2、本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、一種提高極危植物狹葉坡壘頑拗性種子利用率的方法，包括種子收集、種子預(yù)處理、種子滅菌、誘導(dǎo)萌發(fā)、成苗培養(yǎng)、煉苗移栽和種質(zhì)保存。具體操作步驟如下：

4、(1)種子收集：

5、在狹葉坡壘自然種群分布區(qū)收集無(wú)病蟲(chóng)害的新鮮種子；

6、(2)種子預(yù)處理：

7、將狹葉坡壘種子兩側(cè)種翅剝除，清水洗凈種子表面的雜物后，用清潔液攪拌浸洗5min，純水洗掉清潔液，用紗布包裹種子和滅過(guò)菌的細(xì)沙，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的澳洲茶樹(shù)精油水溶液浸泡20min，滅菌水?dāng)嚢杞?～5min，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)；

8、(3)種子滅菌：

9、打開(kāi)超凈工作臺(tái)，在超凈工作臺(tái)上，用75％酒精浸洗1min，酒精燈火焰灼燒滅菌5s，打開(kāi)紗布，將種子清洗掉細(xì)沙后，放入裝有滅菌濾紙的接種盤(pán)中，打開(kāi)超凈臺(tái)紫外燈照射30min，將種子放入滅菌液的中攪拌浸泡10～15min，重復(fù)一次，再用35～40℃滅菌水浸洗3～5次，用解剖刀剝除種皮，得到滅菌種胚；

10、(4)誘導(dǎo)萌發(fā)：

11、將滅菌后的種胚按照成熟度分類(lèi)接種于誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基中，未成熟和半成熟種胚接種到誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基①中，成熟種胚接種到誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基②中，每瓶接種1粒。培養(yǎng)條件為溫度25±3℃，黑暗培養(yǎng)；

12、(5)成苗培養(yǎng)：狹葉坡壘種胚在誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～15d后，將其轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為溫度25±3℃，將培養(yǎng)瓶置于光照時(shí)間為12～15h/d，光照強(qiáng)度為1500～3000lx；

13、(6)煉苗移栽

14、將成苗培養(yǎng)后的組培苗搬至室外，自然光下煉苗5～7d后打開(kāi)瓶蓋，繼續(xù)煉苗1～3d，取出小苗，洗掉培養(yǎng)基，移栽至育苗基質(zhì)中，移栽后7d內(nèi)蓋上遮蔭度為75～85％的遮陰網(wǎng)，之后進(jìn)行常規(guī)育苗管理；

15、(7)種質(zhì)保存

16、將誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)后的組培苗轉(zhuǎn)入保存培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝入直徑70mm×高度110mm密封蓋的270ml的pc塑料瓶，每瓶接種5株，瓶口用保鮮膜包裹兩圈，期間每30～40d更換至新的保存培養(yǎng)基；待需啟用時(shí)，將其轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)25d后可直接煉苗移栽；

17、以上步驟(1)所述種子收集包括采集樹(shù)上的種子和拾取掉落的種子；所述新鮮種子包括尚未失水的未成熟、半成熟和成熟種子，其中未成熟種子種皮和種翅全都呈綠色；半成熟種子的種皮部分成黃綠色，種翅顏色變深黃色；成熟種子種皮全部呈黃綠色，種翅顏色為深黃色或褐色。

18、以上步驟(2)所述清潔液為1000ml清水中加入5g面粉。

19、以上步驟(3)所述接種盤(pán)中的滅菌濾紙上需倒入1cm深的滅菌水；所述滅菌液由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的hgcl2溶液和1滴吐溫20混合而成。

20、以上步驟(4)所述誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基①配方ms+ba?0.25mg/l+naa?0.25～0.5mg/l+ga30.5～0.8mg/l+30g/l蔗糖+3.8g/l瓊脂粉，ph?5.8～6.0；誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基②配方為ms+ba?0.5mg/l+naa?0.4～0.8mg/l+30g/l蔗糖+3.8g/l瓊脂粉，ph?5.8～6.0。

21、以上步驟(5)所述成苗培養(yǎng)基配方為1/2ms+iaa?1.5～2.0mg/l+iba?1.5～2.0mg/l+15g/l蔗糖3.8g/l瓊脂粉，ph?5.8～6.0。

22、以上步驟(6)所述育苗基質(zhì)由泥炭土∶紅心土∶菇渣按照體積比為4:4:2混合而成。

23、以上步驟(7)所述保存培養(yǎng)基配方為2/3ms+ba?0.1～0.2mg/l+iaa?0.5mg/l+30g/l蔗糖+3.8g/l瓊脂粉，ph?5.8～6.0。

24、本發(fā)明對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

25、1、本發(fā)明提出的技術(shù)方案，不同類(lèi)別種子收集處理后進(jìn)行離體培養(yǎng)，降低了病蟲(chóng)害的危害，通過(guò)優(yōu)化各階段培養(yǎng)基配方，可使種胚萌芽率達(dá)到85.88～92.21％，成苗率達(dá)到81.20～84.59％，培育的苗木健壯，煉苗移栽成活率可達(dá)82.57～89.33％，種子離體保存90.24～93.31d后經(jīng)過(guò)恢復(fù)成苗培養(yǎng)和煉苗移栽成活率可達(dá)75.41～80.18％，取得了良好的技術(shù)效果。

26、2、本發(fā)明針對(duì)不同成熟度的種子設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)基配方，顯著提高了種胚萌芽率和成苗率；采集不成熟的種子能夠在種子成熟過(guò)程中遭遇極端天氣或其他意外之前將種子利用起來(lái)；收集掉落的種子，包括掉在溪水邊或溪水里的那部分種子，避免了一些種子成熟后脫落失活或被蟲(chóng)鳥(niǎo)取食的風(fēng)險(xiǎn)，最大限度地利用了自然條件下不能萌發(fā)成苗的種子，顯著地提高了種子的利用率，在種子數(shù)量一定的條件下，促進(jìn)了種子更多地轉(zhuǎn)化成苗，為該物種的保護(hù)生物學(xué)、恢復(fù)生態(tài)學(xué)以及資源的開(kāi)發(fā)利用等方面研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

27、3、本發(fā)明建立了狹葉坡壘以種胚為外植體的無(wú)菌體系，可為狹葉坡壘組織培養(yǎng)繁殖提供無(wú)菌材料，從而為通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)長(zhǎng)期保存種質(zhì)資源和規(guī)?；庇於嘶A(chǔ)。

28、4、本發(fā)明采用一系列創(chuàng)新性的組合措施進(jìn)行種子預(yù)處理和滅菌，顯著提高了滅菌成功率和啟動(dòng)率。在種子滅菌前用1000ml清水中加入5g面粉配制的清潔液對(duì)其清洗，面粉顆粒物較細(xì)微，具有一定的吸附力同時(shí)面粉水溶液具有一定粘性，可將粘附在種皮表面污物洗凈；采用紗布包裹細(xì)沙的方式進(jìn)行，一方面增加了對(duì)種皮的摩擦力，促進(jìn)萌發(fā)，另一方面有利于進(jìn)行滅菌處理還可避免酒精對(duì)種子的直接接觸損傷活力；種子滅菌時(shí)75％酒精浸泡后采用火焰短暫灼燒的方式進(jìn)行，可以避免表面的酒精殘留，同時(shí)短暫的熱處理可以使部分細(xì)菌失活；種子經(jīng)過(guò)滅菌液浸泡之后采用35～40℃滅菌水浸泡，提高一定溫度的滅菌水在洗去滅菌液的同時(shí)還可達(dá)到激活種子活力的效果，進(jìn)一步促進(jìn)萌發(fā)。

29、5、本發(fā)明通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基、成苗培養(yǎng)基和保存培養(yǎng)基的優(yōu)化，可有效提高種胚萌發(fā)成功率，轉(zhuǎn)入保存培養(yǎng)后，可延緩成苗，恢復(fù)培養(yǎng)后可迅速成苗，可實(shí)現(xiàn)短暫保存，可將種子利用時(shí)間延長(zhǎng)60～90d，打破了種子萌發(fā)利用必須在種子成熟采收時(shí)節(jié)的局限性，有效地緩解了因客觀因素導(dǎo)致采集種子無(wú)法立刻播種，從而導(dǎo)致種子失活無(wú)法成苗的狀況，而且不受土地與育苗空間的限制，對(duì)于拯救這一瀕危樹(shù)種具有重要的科學(xué)意義。

30、6、本發(fā)明采用的移栽育苗基質(zhì)采用的是泥炭土∶黃心土∶菇渣積比為4:4:2，選用泥炭土和紅心土可以保證充足的保水保肥能力，菇渣就是種植食用菌以后的廢菌糠，廢棄物，它能夠改變土壤有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)含量，提高土壤肥力，此育苗基質(zhì)配比簡(jiǎn)單，配比合理，容易配制，能夠?yàn)楠M葉坡壘幼苗提供充足的營(yíng)養(yǎng)，能夠顯著提高狹葉坡壘的幼苗移栽成活率至82.57～89.33％。