本發(fā)明涉及橡膠樹種苗培育，具體是一種高效獲得橡膠樹無(wú)性系品種正常體胚的培育方法。

背景技術(shù)：

1、橡膠樹(hevea?brasiliensis)自根幼態(tài)無(wú)性系(簡(jiǎn)稱體胚植株)與同無(wú)性系品種的老態(tài)芽接苗相比，具有生長(zhǎng)迅速、抗逆性強(qiáng)、林相整齊度及產(chǎn)膠量高等優(yōu)點(diǎn)，被稱為優(yōu)勢(shì)種植材料，應(yīng)用前景十分廣闊，尤其是在老舊、低產(chǎn)低質(zhì)膠園更新改造中具有重大意義。

2、橡膠樹組織培養(yǎng)技術(shù)是繁育其體胚植株的唯一途徑，其中花藥組織培養(yǎng)是主要技術(shù)途徑之一，也是世界公認(rèn)的難題之一。目前僅有少數(shù)無(wú)性系品種如‘熱研73397’及‘熱研72059’的花藥體胚植株可規(guī)?；慨a(chǎn)，推廣利用效果較好，已在海南、云南及廣東三大天然橡膠主產(chǎn)區(qū)推廣種植3萬(wàn)余畝。而‘云研80-1983’、‘云研77-4’、‘云研77-2’及‘云研73-46’等優(yōu)良無(wú)性系品種的花藥組織培養(yǎng)技術(shù)未攻克，尚未建立高效穩(wěn)定的體胚植株再生技術(shù)體系或?qū)崿F(xiàn)零突破。此外，部分優(yōu)良無(wú)性系品種如‘云研73-477’、‘云研614’及‘rrim600’等花藥在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下極易脫分化產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率在90.0％以上，且所得愈傷胚性強(qiáng)，能再分化產(chǎn)生體胚，體胚發(fā)生率為69.66～84.27％，但正常體胚獲得率僅為15.0～30％，這嚴(yán)重制約了這些優(yōu)良無(wú)性系品種體胚植株規(guī)?；瘮U(kuò)繁及推廣應(yīng)用。前人研究表明，橡膠樹體胚發(fā)育完整過(guò)程可分為球形胚→心形胚→魚雷胚→子葉胚4個(gè)階段，且體胚發(fā)生不具同步性，體胚分化培養(yǎng)基中，同一塊胚性愈傷組織中往往存在球形胚、心形胚、魚雷胚及子葉小胚中2種或2種以上不同發(fā)育階段的體細(xì)胞幼胚。過(guò)去，通常采用與分化培養(yǎng)基相同成分的培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行成熟培養(yǎng)，體胚畸形率高，畸形胚不能進(jìn)一步發(fā)育萌發(fā)形成完整植株，致使體胚植株獲得率低下，這一技術(shù)瓶頸嚴(yán)重制約了橡膠樹體胚植株規(guī)?；慨a(chǎn)及推廣應(yīng)用。

3、綜上，目前亟需一種具有較好成熟培養(yǎng)效率、較高正常體胚及體胚植株獲得率、可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)繁的橡膠樹無(wú)性系品種正常體胚的培育方法，可顯著提高體胚植株獲得率，進(jìn)而促進(jìn)體胚植株規(guī)模化量產(chǎn)及推廣應(yīng)用，利于天然橡膠產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定健康發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種橡膠樹無(wú)性系品種正常體胚的培育方法，以至少達(dá)到具有較好成熟培養(yǎng)效率、較高正常體胚及體胚植株獲得率。

2、本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

3、一種橡膠樹無(wú)性系品種正常體胚的培育方法，包括以下步驟：

4、s1：取橡膠樹無(wú)性系品種的花藥初生體細(xì)胞幼胚，挑選出子葉小胚；

5、s2：將所述子葉小胚置于成熟培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到成熟正常體胚；

6、s3：將所述成熟正常體胚轉(zhuǎn)入體胚萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行體胚植株誘導(dǎo)培養(yǎng)。

7、進(jìn)一步的，步驟s2中，所述成熟培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述子葉小胚成熟培養(yǎng)基的制備方法為：改良ms附加6-ba0.50mg/l、naa0.15mg/l、kt?0.25mg/l、蔗糖70g/l、瓊脂粉5.8g/l以及椰子汁50ml/l。

8、進(jìn)一步的，步驟s2中，所述改良ms培養(yǎng)基為大量元素為4/5ms，微量元素為ms的1.2倍，鐵鹽和有機(jī)成分與ms相同。

9、所述大量元素包括：nh4no3、kno3、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、kh2po4；所述微量元素包括ki、h3bo3、mnso4·4h2o、znso4·7h2o、na2moo4·2h2o、cuso4·5h2o、cocl2·6h2o；所述鐵鹽包括：feso4·7h2o、na2-edta·2h2o；所述有機(jī)成分包括：肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素以及甘氨酸。

10、進(jìn)一步的，所述成熟培養(yǎng)基在使用前還需要調(diào)節(jié)ph至5.8～6.2，然后高溫高壓滅菌。

11、進(jìn)一步的，步驟s2中，所述的成熟培養(yǎng)的溫度為24±0.5℃。

12、進(jìn)一步的，步驟s2中，所述成熟培養(yǎng)為暗培養(yǎng)。

13、進(jìn)一步的，步驟s3中，所述的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基為4/5ms+ga31.0～2.0mg/l+iaa0.25～0.50mg/l+蔗糖50g/l+瓊脂5.8g/l+活性炭1g/l。

14、進(jìn)一步的，步驟s3中，所述體胚植株誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為26±0.5℃。

15、進(jìn)一步的，步驟s3中，所述體胚植株誘導(dǎo)培養(yǎng)為光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，光照時(shí)間為10h/d。

16、進(jìn)一步的，所述橡膠樹無(wú)性系品種為二倍體無(wú)性系品種，包括‘云研73-477’、‘熱墾525’以‘及rrim600’。

17、值得注意的是，完整的體胚發(fā)育過(guò)程是球形胚→心形胚→魚雷胚→子葉胚，申請(qǐng)人在前期研究中發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段體細(xì)胞幼胚經(jīng)成熟培養(yǎng)后的成熟率、正常體胚及體胚植株獲得率具有較大的差異，比較不同發(fā)育階段體細(xì)胞幼胚的成熟培養(yǎng)效率，花藥體細(xì)胞幼胚的成熟培養(yǎng)效應(yīng)隨幼胚發(fā)育程度的增加呈提高趨勢(shì)，子葉小胚的成熟培養(yǎng)效果最好。

18、本發(fā)明的有益效果是：

19、本發(fā)明的橡膠樹無(wú)性系品種正常體胚培育方法具有較好成熟培養(yǎng)效率、較高正常體胚及體胚植株獲得率，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)繁。子葉小胚成熟率高達(dá)82.50％以上，正常體胚獲得率高達(dá)75.0％以上，體胚植株獲得率達(dá)63.0％以上。

技術(shù)特征：

1.一種橡膠樹無(wú)性系品種正常體胚的培育方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育方法，其特征在于：步驟s2中，所述成熟培養(yǎng)基的制備方法為：改良ms附加6-ba0.50mg/l、naa0.15mg/l、kt?0.25mg/l、蔗糖70g/l、瓊脂粉5.8g/l以及椰子汁50ml/l。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培育方法，其特征在于：步驟s2中，所述改良ms培養(yǎng)基為大量元素為4/5ms，微量元素為ms的1.2倍，鐵鹽和有機(jī)成分與ms相同。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培育方法，其特征在于：所述成熟培養(yǎng)基在使用前還需要調(diào)節(jié)ph至5.8～6.2，然后高溫高壓滅菌。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育方法，其特征在于：步驟s2中，所述的成熟培養(yǎng)的溫度為24±0.5℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育方法，其特征在于：步驟s2中，所述成熟培養(yǎng)為暗培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育方法，其特征在于：步驟s3中，所述的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基為4/5ms+ga31.0～2.0mg/l+iaa0.25～0.50mg/l+蔗糖50g/l+瓊脂5.8g/l+活性炭1g/l。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育方法，其特征在于：步驟s3中，所述體胚植株誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為26±0.5℃。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育方法，其特征在于：步驟s3中，所述體胚植株誘導(dǎo)培養(yǎng)為光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，光照時(shí)間為10h/d。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育方法，其特征在于：所述橡膠樹無(wú)性系品種為二倍體無(wú)性系品種，包括云研73-477、熱墾525以及rrim600。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及橡膠樹種苗培育技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種高效獲得橡膠樹無(wú)性系品種正常體胚的培育方法，該培育方法包括以下步驟：S1：取橡膠樹無(wú)性系品種的花藥初生體細(xì)胞幼胚，挑選出子葉小胚；S2：將所述子葉小胚置改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，得到成熟正常體胚；S3：將所述成熟正常體胚轉(zhuǎn)入體胚萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行體胚植株誘導(dǎo)培養(yǎng)。本發(fā)明的橡膠樹無(wú)性系品種正常體胚培育方法具有較好成熟培養(yǎng)效率、較高正常體胚及體胚植株獲得率，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)繁。子葉小胚成熟率高達(dá)82.50％以上，正常體胚獲得率高達(dá)75.0％以上，體胚植株獲得率達(dá)63.0％以上。

技術(shù)研發(fā)人員：桂明春,田海,方芳,邱彥芬,孫小龍,李玲,唐敏,柳覲,梁國(guó)平,繆佳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南省熱帶作物科學(xué)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6