本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖，尤其是一種提高大和藻蝦胚胎離體培養(yǎng)孵化率的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、大和藻蝦(caridinajaponica(de?man,1892)[caridina])，俗名"takashiamanoshrimp"，"yamato?shrimp"珍珠蝦，大和藻蝦。在眾多觀賞蝦中，大和藻蝦并不太惹人注目，屬于入門(mén)級(jí)蝦類(lèi)，非常好養(yǎng)，市場(chǎng)比較常見(jiàn)，價(jià)格也偏低，和櫻桃蝦一樣，屬于初學(xué)養(yǎng)蝦者的首選品種。原產(chǎn)地為日本，又可稱之為珍珠蝦，因?yàn)槠渖眢w上分布著點(diǎn)點(diǎn)斑狀，故而稱之。

2、大和藻蝦全長(zhǎng)：5cm，細(xì)卵型，大和藻蝦的雌蝦身體上有紅色斑點(diǎn)規(guī)則的線條，雄蝦斑點(diǎn)則表現(xiàn)的不規(guī)則，在水族缸中并不太吸引人，但仔細(xì)觀看還是非常漂亮。

3、大和藻蝦的雄雌相對(duì)容易分辨，身體上紅色斑點(diǎn)規(guī)則的呈線條狀排列的為雌蝦，相反不規(guī)則的則為雄蝦。大和藻蝦由于屬于汽水蝦，在自然界中幼蝦脫殼后隨著水流到達(dá)近海洋的鹽水水域。因而，任何在淡水中繁殖的嘗試都只能以失敗告終。

4、大和藻蝦，學(xué)名caridinajaponica，從名字就知道它產(chǎn)自日本，在我國(guó)的臺(tái)灣也有分布。大和藻蝦最大體長(zhǎng)可達(dá)5厘米。最適合的水溫在22～26攝氏度之間，水質(zhì)要求ph值6.5～7.2之間。

5、它的名字已經(jīng)將它定性為食藻蝦。一般而言，大和藻蝦除了覓食藻類(lèi)外，也進(jìn)食浮游生物、飼料碎片甚至水草。大和藻蝦食欲相當(dāng)旺盛，一天中不停地進(jìn)食，當(dāng)食物不足時(shí)，容易由于營(yíng)養(yǎng)不良引發(fā)疾病造成死亡。這時(shí)，大和藻蝦可能轉(zhuǎn)而攝食水草的嫩葉或腐葉。曾經(jīng)有過(guò)大和藻蝦大量進(jìn)食自然界河內(nèi)水草，危害本土生物的紀(jì)錄。所以，在寄希望它清除的藻類(lèi)的同時(shí)，也要兼顧投放一些飼料，以維持它正常的生活狀態(tài)。

6、它們的繁殖方式非常有趣。雄性在將要產(chǎn)卵的雌性上面挨個(gè)排隊(duì)并集體使其受精。在自然界中幼蝦脫殼后隨著水流到達(dá)近海洋的鹽水水域。因而，任何在淡水中繁殖的嘗試都只能以失敗告終，幼蝦脫殼后會(huì)在淡水中存活6天，然后，死亡。

7、現(xiàn)有的大部分大和藻蝦養(yǎng)殖過(guò)程中，蝦的抱卵和孵化技術(shù)不夠成熟。蝦卵的剝離方式，孵化水配比，及孵化水中菌和寄生蟲(chóng)過(guò)多，容易導(dǎo)致蝦卵死亡，都是技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致現(xiàn)在離體養(yǎng)殖技術(shù)不夠成熟，離體胚胎孵化率低，離體操作后胚胎發(fā)育率幾乎為零。給人們的養(yǎng)殖造成了一定的不便。

8、通過(guò)檢索，發(fā)現(xiàn)如下與本發(fā)明專利申請(qǐng)相關(guān)的期刊與專利公開(kāi)文獻(xiàn)：

9、1、日本米蝦胚胎發(fā)育及離體孵化(分類(lèi)號(hào)：s917.4)，包括：本研究采用自制離體孵化裝置,對(duì)日本米蝦(caridinajaponica)不同發(fā)育期胚胎進(jìn)行離體孵化研究,結(jié)果顯示,水溫為25.5℃時(shí),日本米蝦受精卵孵化大約需要25d,發(fā)育積溫為637.5℃。胚胎發(fā)育歷經(jīng)受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、前無(wú)節(jié)幼體期、后無(wú)幼體期、前溞狀幼體期和膜內(nèi)溞狀幼體期8個(gè)時(shí)期。各期離體胚胎均能孵化出幼體,膜內(nèi)溞狀幼體期離體胚胎孵化率最高,為(80.7±2.4)％,非離體孵化的對(duì)照組為(79.1±4.9)％,二者差異不顯著；卵裂期離體胚胎孵化率最低,為(28.2±2.6)％,與對(duì)照組差異顯著。各組離體胚胎所孵化出的ⅰ期(zⅰ)和ⅱ期溞狀幼體(zⅱ)的變態(tài)率無(wú)顯著差異。溫度對(duì)日本米蝦前溞狀幼體期胚胎離體孵化影響顯著，在15.0℃～32.5℃范圍內(nèi)，隨水溫升高孵化時(shí)間逐漸縮短，15.0℃時(shí)，前溞狀幼體離體孵化時(shí)間為(436.8±124.8)h，32.5℃時(shí)縮短至(228.0±88.8)h，但溫度高于29.0℃時(shí)，孵化出的幼體變態(tài)率開(kāi)始下降。本研究可為日本米蝦繁殖生物學(xué)及甲殼動(dòng)物胚胎離體孵化技術(shù)研究提供參考。

10、2、羅氏沼蝦胚胎發(fā)育的研究:ⅰ.胚胎外部結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生(分類(lèi)號(hào)：q954.4)，包括：羅氏沼蝦的胚胎發(fā)育過(guò)程可準(zhǔn)確地分為卵裂期、囊胚期、原腸期、前無(wú)節(jié)幼體期、后無(wú)節(jié)幼體期、前溞狀幼體期和溞狀幼體期七個(gè)時(shí)期。在28℃水溫條件下,胚胎發(fā)育的全過(guò)程約需480小時(shí)。

11、3、一種澳洲淡水龍蝦離體孵化方法(cn105557590b)，包括：(1)在取得受精卵后，先將受精卵清洗，后放入離體孵化盤(pán)中進(jìn)行人工孵化。(2)離體孵化盤(pán)配備和水體相配的前置過(guò)濾桶、臭氧消毒機(jī)、發(fā)熱管及增氧機(jī)及隔離網(wǎng)，受精卵放在隔離網(wǎng)上，離體孵化盤(pán)底部設(shè)氣泡石制造水流，令受精卵保持微微活動(dòng)，臭氧機(jī)用時(shí)間制控制定期消毒，受精卵經(jīng)過(guò)約40-50天孵化便可孵出仔蝦。采用本發(fā)明所述的離體孵化方法，受精卵的感染率可降至10％以下，孵化的成活率可達(dá)90％以上，大大提高了受精卵孵化的成活率，可以有效提高蝦苗產(chǎn)量，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

12、通過(guò)對(duì)比，本發(fā)明專利申請(qǐng)與上述公開(kāi)文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種提高大和藻蝦胚胎離體培養(yǎng)孵化率的方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種提高大和藻蝦胚胎離體培養(yǎng)孵化率的方法，步驟如下：

4、⑴成蝦養(yǎng)殖水的制備：大和藻蝦為海水蝦，所以普通的大和藻蝦成蝦在配置好的海水中即可放入成蝦飼養(yǎng)；

5、海水配方：蒸餾水和海鹽；海鹽配方：鈣(ca)12-24ppm，鈉(na)28-100ppm，鉀(k)2-42ppm，鎂(mg)10-27ppm，二氧化硅(sio2)41-53ppm，鐵(fe)小于0.02ppm且取值大于0，鋅(zn)0.2-4ppm，碳酸鈣(caco3)小于120ppm且取值大于0，溶劑為蒸餾水；在制備時(shí)，將各個(gè)物質(zhì)逐一溶解，攪拌均勻，進(jìn)行充氧處理，以提高水體的溶解氧濃度，配置好的海水放置24小時(shí)，使水體中任何可能的沉淀物完全溶解或沉降，得到海水；

6、⑵親蝦飼料的配制：其組成成分及重量份數(shù)如下：

7、海藻粉10-15份，小球藻10-15份，蝦粉10-15份，秘魯魚(yú)粉10-15份，益生菌(lactococcus?lactis)5-10份，發(fā)酵玉米蛋白10-15份，小麥粉10-15份，菠菜10-20份，甲殼素1-2份，菲律賓蛤仔(ruditapesphilippinarum)1-2份，復(fù)合礦物質(zhì)1-2份，花生秧1-2份，復(fù)合維生素1-2份，蠶沙1-2份，豆油，豆油的添加量以確保飼料脂肪總含量控制在6％-10％，豆油應(yīng)均勻混合在飼料中，以確保飼料中的脂肪酸分布均勻，促進(jìn)親蝦攝食和消化；在制備時(shí)，將各種原料超微粉碎后,按照配方稱重并且利用逐級(jí)擴(kuò)大混合,最后添加豆油和水?dāng)嚢杌靹?在制粒機(jī)加工成為直徑為1mm的顆粒飼料，75℃烘干后放置-20℃冰箱中備用；

8、⑶大和藻蝦的養(yǎng)殖：將成蝦按每m3/20尾的數(shù)量放置在養(yǎng)殖缸中，用配制的養(yǎng)殖水養(yǎng)殖，用配制的親蝦飼料喂養(yǎng)成蝦，待母蝦抱卵；

9、⑷胚胎洗脫液的制備：在無(wú)菌環(huán)境下，將20ppm的膠原酶、戊二醛、edta2鈉、吐溫20、1xpbs緩沖液混合，然后加水配成質(zhì)量濃度為1％的水溶液，即得胚胎洗脫液，胚胎洗脫液在4℃冰箱下保存；

10、⑸胚胎的離體方法：用胚胎洗脫液潤(rùn)濕干凈的脫脂棉，將潤(rùn)濕的脫脂棉放在剛剛抱卵即抱卵不超過(guò)10小時(shí)的現(xiàn)有親蝦需要脫卵的部位，停留1分鐘，用孵化水將親蝦身上的卵沖下，低濃度高錳酸鉀溶液消毒10秒，4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫麄€(gè)過(guò)程中使用到的器材均消毒滅菌；配制的洗卵液可以最大程度減少對(duì)親蝦以及所需受精卵的傷害，并且在不傷害親蝦的狀態(tài)下使受精卵分離徹底?？梢越档筒⒎乐顾锖臀⑸锏母腥?。

11、⑹孵化的方式：將保存的受精卵拿出，在體視鏡下觀察細(xì)胞正處于的時(shí)期，拍照記錄；將配好的低濃度高錳酸鉀溶液倒入已滅菌的玻璃皿中，將準(zhǔn)備孵化的受精卵放入玻璃皿的低濃度高錳酸鉀溶液中靜置10～15秒，然后用已消毒的塑料吸管將卵全部吸出，放入已經(jīng)消過(guò)毒的容器中，倒入配制好的孵化水，孵化水的添加量按5-10ml/卵的數(shù)量緩緩加入，在室溫25±1℃下孵化24h后重新消毒換水并定時(shí)剔除壞卵即可。

12、進(jìn)一步地，所述孵化水的制備步驟如下：

13、準(zhǔn)確量取鹽度為13‰的過(guò)濾海水，分別準(zhǔn)確稱取edta、pbs緩沖液、dmem，倒入滅菌后海水中，每1l過(guò)濾海水中加入5g?edta、3ml?pbs緩沖液、2g?dmem，0.22μm濾膜過(guò)濾滅菌，即得孵化水；密封保存，并放置室溫下備用。

14、進(jìn)一步地，每1lpbs緩沖液的制備如下：

15、每稱取8g?nacl、0.2g?kcl、1.44g?na2hpo4和0.24g?kh2po4，溶于800ml鹽度為13‰的過(guò)濾海水中，用hcl調(diào)節(jié)溶液的ph值至7.4，最后加過(guò)濾海水定容至1l。

16、進(jìn)一步地，配置好的孵化液使用期限不超過(guò)一個(gè)月。

17、進(jìn)一步地，所述低濃度高錳酸鉀溶液的配制步驟如下：

18、稱取高錳酸鉀試劑，然后加入蒸餾水，每1l蒸餾水中加入0.0001g高錳酸鉀試劑，混勻，密封保存，即為配置好的低濃度高錳酸鉀溶液。

19、進(jìn)一步地，所述步驟⑷中用胚胎洗脫液和孵化水將親蝦腹部的卵洗脫出。

20、如上所述的提高大和藻蝦胚胎離體培養(yǎng)孵化率的方法在提高大和藻蝦破膜幼體的成活率中的應(yīng)用。

21、本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為：

22、1、本發(fā)明方法將大和藻蝦的受精胚胎進(jìn)行離體孵化，使之前由母蝦直接抱卵孵化帶來(lái)的缺點(diǎn)減低，擺脫了母蝦抱卵孵化的限制，增加了大和藻蝦離體培養(yǎng)的孵化率，本發(fā)明孵化率約為75％左右，比普通的大和藻蝦受精卵的孵化率高約8％，本發(fā)明離體培養(yǎng)技術(shù)可在部分養(yǎng)殖環(huán)境下孵化率高達(dá)100％，且并無(wú)產(chǎn)生離體培養(yǎng)的一些不良狀態(tài)，提高了大和藻蝦破膜幼體的成活率，為產(chǎn)業(yè)上提供了良好的應(yīng)用技術(shù)，為大規(guī)模定向育種提供了有效手段。

23、2、本發(fā)明方法為大和藻蝦離體受精以及胚胎操作提供了技術(shù)平臺(tái)，為經(jīng)濟(jì)類(lèi)甲殼動(dòng)物的基因編輯提供必要的輔助技術(shù)。

24、3、近代生物技術(shù)中，雜交育種已經(jīng)十分成熟，分子育種技術(shù)可以更好地提高動(dòng)物植物的產(chǎn)量與品質(zhì)。水生動(dòng)物中能夠開(kāi)展離體胚胎培養(yǎng)的品種，可以成為甲殼類(lèi)分子育種的備選品種。本發(fā)明方法能為甲殼動(dòng)物不同時(shí)期的胚胎干細(xì)胞獲得提供前期必要技術(shù)。

25、4、本發(fā)明方法能為甲殼動(dòng)物發(fā)育研究中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序蛋白組測(cè)序、代謝組測(cè)序等一些組學(xué)技術(shù)提供前期的必要技術(shù)。

26、5、本發(fā)明所提供的離體胚胎培育方法可以將大和藻蝦的受精胚胎進(jìn)行離體孵化，擺脫了母蝦抱卵孵化的種種限制，從而提高了大和藻蝦胚胎離體的孵化率，縮短了受精卵孵化所需的天數(shù)，也在一定程度上提高了大和藻蝦受精卵破膜后幼體的成活率。

27、6、本發(fā)明方法所使用的親蝦飼料在一定程度上可以使母蝦抱卵的數(shù)量增加、質(zhì)量提高，并使親蝦體質(zhì)有了一定程度的提高。

28、7、本發(fā)明方法所使用的胚胎洗脫液可使親蝦的受精卵在一顆顆被剝離的同時(shí)，免受人工外力影響的同時(shí)并且不損壞受精卵。

29、8、本發(fā)明方法所使用的孵化水可使受精卵在孵化的同時(shí)免受水生微生物的干擾，從而提高了本專利大和藻蝦的離體孵化率。

30、9、本發(fā)明方法的具體胚胎離體培養(yǎng)技術(shù)操作簡(jiǎn)單易上手，沒(méi)有太多的條件限制。