本發(fā)明涉及蘋(píng)果再生，尤其涉及一種國(guó)光蘋(píng)果離體再生的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、蘋(píng)果(malus?domestica)，薔薇科蘋(píng)果屬植物，是世界上重要的果樹(shù)樹(shù)種之一?！畤?guó)光’蘋(píng)果是重要的蘋(píng)果品種之一，起源于17世紀(jì)末期，由“caleb?ralls”和“edmund?charlesgenet”在美國(guó)弗吉尼亞州果園里選育，英文名“ralls?genet”由此而來(lái)，又名“ralls”或者“rallsjenet”?！畤?guó)光’蘋(píng)果的果個(gè)小，果皮黃綠色帶有紅暈，有紅色或淡粉色條紋，果肉淡黃，肉質(zhì)細(xì)嫩，口感清脆酸甜，貯藏一段時(shí)間后風(fēng)味更佳?！畤?guó)光’蘋(píng)果具有豐產(chǎn)、晚熟、抗逆性強(qiáng)、極耐貯運(yùn)、無(wú)采前落果、更新易、壽命長(zhǎng)以及兼具鮮食和宜加工等優(yōu)點(diǎn)。‘國(guó)光’雖然品種古老，但其獨(dú)特的風(fēng)味和耐貯性，仍然受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。

2、‘國(guó)光’蘋(píng)果不僅是部分地區(qū)的主栽品種，還是蘋(píng)果雜交育種的骨干親本。具有抗旱抗寒、抗抽條、抗倒伏能力以及早果性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，sh系列矮化砧就是以‘國(guó)光’為親本雜交而來(lái)，sh系列蘋(píng)果矮化砧的育成，是蘋(píng)果矮化砧木的突破。除了在矮化砧木上的應(yīng)用，近30年來(lái)，‘國(guó)光’作為親本在育種過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。以‘國(guó)光’為母本或父本雜交培育出了‘富士’、‘新蘋(píng)1號(hào)’、‘甜國(guó)光’、‘燕山紅’和‘碣石紅’等多個(gè)優(yōu)質(zhì)耐儲(chǔ)存的晚熟新品種。為加強(qiáng)‘國(guó)光’蘋(píng)果的種質(zhì)創(chuàng)新與保存利用，亟需建立‘國(guó)光’再生體系，不僅有利于促進(jìn)‘國(guó)光’蘋(píng)果育種的進(jìn)程，同時(shí)能夠提高常規(guī)育種的效率，在生產(chǎn)上有很大的應(yīng)用價(jià)值，促進(jìn)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)健康快速發(fā)展。

3、‘國(guó)光’蘋(píng)果歷史悠久，具有抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、極耐貯運(yùn)、無(wú)采前落果、壽命長(zhǎng)以及遺傳傳遞力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在新品種和矮化砧木育種方面有著廣泛的應(yīng)用。金冠蘋(píng)果全基因組序列的發(fā)表促進(jìn)了蘋(píng)果分子育種的發(fā)展，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)育種的不足，但蘋(píng)果分子育種中遺傳轉(zhuǎn)化效率低，極大地限制其發(fā)展。

4、離體再生是體細(xì)胞誘變、遺傳轉(zhuǎn)化以及無(wú)性系變異的基礎(chǔ)，在創(chuàng)制新種質(zhì)、培育突破性新品種中發(fā)揮重要作用。目前常見(jiàn)蘋(píng)果品種的遺傳轉(zhuǎn)化效率低的問(wèn)題尚未解決，尤其是主栽品種。要提高蘋(píng)果遺傳轉(zhuǎn)化效率，首先要提高蘋(píng)果離體再生效率。目前研究尚不能明確蘋(píng)果葉片再生的分子機(jī)理，而蘋(píng)果葉片再生與基因型密切相關(guān)，雖然嘎啦蘋(píng)果葉片離體再生優(yōu)于其他品種，但因?yàn)檫z傳背景差異大，無(wú)法直接在嘎啦蘋(píng)果上做基因編輯等生物育種。

5、為了能高效地融合現(xiàn)代生物技術(shù)，圍繞如何更有效地利用‘國(guó)光’這一珍貴的種質(zhì)資源開(kāi)展研究，建立‘國(guó)光’無(wú)菌苗和離體再生的技術(shù)體系，以期通過(guò)組織培養(yǎng)、現(xiàn)代分子生物學(xué)等育種技術(shù)，為‘國(guó)光’蘋(píng)果的創(chuàng)新利用提供新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種國(guó)光蘋(píng)果離體再生的培養(yǎng)方法，通過(guò)對(duì)外植體培養(yǎng)時(shí)間、再生培養(yǎng)基等篩選，建立‘國(guó)光’蘋(píng)果葉片離體再生體系，為‘國(guó)光’蘋(píng)果乃至其他品種的生物技術(shù)育種提供再生和遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種國(guó)光蘋(píng)果離體再生的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

4、(1)將國(guó)光蘋(píng)果葉片接種到誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基上；

5、(2)接種后進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；

6、(3)黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行周期性光照培養(yǎng)，得到國(guó)光蘋(píng)果再生幼苗。

7、作為優(yōu)選，步驟(1)中所述國(guó)光蘋(píng)果葉片為繼代36～48d的國(guó)光蘋(píng)果組培苗葉片，所述葉片選取時(shí)選用國(guó)光蘋(píng)果組培苗頂端的第2片或者第3片完全展開(kāi)的葉片。

8、作為優(yōu)選，步驟(1)中所述葉片使用前切去葉尖和葉基，保留帶中脈的0.4～0.6cm2大小的葉塊；所述接種時(shí)葉片的葉背朝上，平放在誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基上。

9、作為優(yōu)選，所述國(guó)光蘋(píng)果組培苗在培養(yǎng)時(shí)，所用的培養(yǎng)基以ms為基礎(chǔ)，還含有0.7～0.9mg/l?6-ba和0.08～0.12mg/l?iba。

10、作為優(yōu)選，步驟(1)中所述誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基以ms為基礎(chǔ)，還含有0.4～0.6mg/lnaa和1.8～2.2mg/ltdz。

11、作為優(yōu)選，步驟(2)中所述黑暗培養(yǎng)的溫度為23～27℃，所述黑暗培養(yǎng)的時(shí)間為12～16d。

12、作為優(yōu)選，步驟(3)中所述周期性光照培養(yǎng)以24h為一個(gè)周期，其中光照時(shí)間為15～17h，黑暗時(shí)間為7～9h，所述光照培養(yǎng)時(shí)光照的強(qiáng)度為1800～2200勒克斯，所述周期性光照培養(yǎng)的溫度為23～27℃。

13、本發(fā)明提供了一種國(guó)光蘋(píng)果離體再生的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：(1)將國(guó)光蘋(píng)果葉片接種到誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基上；(2)接種后進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；(3)黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行周期性光照培養(yǎng)，得到國(guó)光蘋(píng)果再生幼苗。本發(fā)明通過(guò)對(duì)不同部位、不同苗齡、培養(yǎng)基種類(lèi)和激素種類(lèi)等條件進(jìn)行試驗(yàn)，建立了一種國(guó)光蘋(píng)果葉片離體再生體系。在本發(fā)明的體系下，再生頻率最高達(dá)36.67％，平均再生芽為2.2。

技術(shù)特征：

1.一種國(guó)光蘋(píng)果離體再生的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述國(guó)光蘋(píng)果葉片為繼代36～48d的國(guó)光蘋(píng)果組培苗葉片，所述葉片選取時(shí)選用國(guó)光蘋(píng)果組培苗頂端的第2片或者第3片完全展開(kāi)的葉片。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述葉片使用前切去葉尖和葉基，保留帶中脈的0.4～0.6cm2大小的葉塊；所述接種時(shí)葉片的葉背朝上，平放在誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基上。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述國(guó)光蘋(píng)果組培苗在培養(yǎng)時(shí)，所用的培養(yǎng)基以ms為基礎(chǔ)，還含有0.7～0.9mg/l?6-ba和0.08～0.12mg/l?iba。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基以ms為基礎(chǔ)，還含有0.4～0.6mg/lnaa和1.8～2.2mg/ltdz。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中所述黑暗培養(yǎng)的溫度為23～27℃，所述黑暗培養(yǎng)的時(shí)間為12～16d。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中所述周期性光照培養(yǎng)以24h為一個(gè)周期，其中光照時(shí)間為15～17h，黑暗時(shí)間為7～9h，所述光照培養(yǎng)時(shí)光照的強(qiáng)度為1800～2200勒克斯，所述周期性光照培養(yǎng)的溫度為23～27℃。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及國(guó)光蘋(píng)果再生技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種國(guó)光蘋(píng)果離體再生的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：(1)將國(guó)光蘋(píng)果葉片接種到誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基上；(2)接種后進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；(3)黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行周期性光照培養(yǎng)，得到國(guó)光蘋(píng)果再生幼苗。本發(fā)明通過(guò)對(duì)不同部位、不同苗齡、培養(yǎng)基種類(lèi)和激素種類(lèi)等條件進(jìn)行試驗(yàn)，建立了一種國(guó)光蘋(píng)果葉片離體再生體系。在本發(fā)明的體系下，再生頻率最高達(dá)36.67％，平均再生芽為2.2。

技術(shù)研發(fā)人員：朱東姿,張憲省,馬學(xué)芹,王甲威,桑亞林,劉慶忠,洪坡,喬謙,孫山
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東省果樹(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9