本發(fā)明屬于植物細胞工程，具體涉及一種直接誘導(dǎo)黃花補血草整株再生的方法。

背景技術(shù)：

1、黃花補血草，別名金匙葉草、黃花磯松、金色補血草，為白花丹科補血草屬植物，是多年生草本植物。黃花補血草為耐鹽堿耐干旱植物，常生長于戈壁、灘涂、流動沙丘等干旱環(huán)境，多分布于我國新疆、甘肅、陜西、青海、內(nèi)蒙古等地。黃花補血草的藥用價值極高，具有消炎止血、調(diào)經(jīng)益脾、補血抗癌以及治療疼痛等功效。其根部可用于緩解體弱和食欲不振的癥狀，葉片則有助于治療胃潰瘍和胃癌，而花和枝條則可用于治療功能性子宮出血、宮頸癌以及其他類型的出血。

2、黃花補血草具有較高的觀賞價值，其花期較長、花色鮮艷、植株矮小的特點很適合作為行政觀賞花。膜質(zhì)且堅韌的花瓣使其可以保持長久鮮艷的色澤，是制作切花配材、干花的良好材料。野生黃花補血草連年萌生，常綠不枯，對荒漠干旱環(huán)境適應(yīng)性強，且集中生長，是西北干旱草場的優(yōu)良飼料來源。

3、目前，黃花補血草的主要繁殖方式為種子繁殖，但黃花補血草的種子細小，且成熟期不穩(wěn)定，年產(chǎn)量低，種子繁殖困難；而傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)技術(shù)需要歷經(jīng)無菌苗培育、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、生根培養(yǎng)等數(shù)個環(huán)節(jié)，工序繁多、培養(yǎng)周期長達120-150天，且容易污染，嚴重阻礙黃花補血草組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有的黃花補血草組織培養(yǎng)技術(shù)耗時過久，繼代培養(yǎng)步驟過多、容易污染等問題，而提供一種快速、直接誘導(dǎo)黃花補血草外植體獲得再生完整植株的方法。

2、本發(fā)明為了促進黃花補血草外植體的不定芽高效分化與生根而采用的高濃度激素溶液(40mg/l?naa、30mg/l?6-ba、10mg/l?iba溶液)浸泡黃花補血草的葉柄外植體，然后將外植體接種至無激素添加的ms培養(yǎng)基內(nèi)進行培養(yǎng)48天，可獲得株高5-11cm、根長在6cm以上的完整植株。

3、本發(fā)明的目的是提供一種直接誘導(dǎo)黃花補血草植株再生的方法，包括以下步驟：

4、s1.取黃花補血草無菌苗的葉柄，截成小段作為外植體；

5、s2.將外植體浸泡于激素溶液中20-30min后，取出并吸干外植體表面殘留溶液；

6、s3.將經(jīng)過步驟s2處理后的外植體接種于ms培養(yǎng)基中進行整株再生誘導(dǎo)培養(yǎng)；

7、所述的激素溶液為40mg/l?naa溶液、30mg/l?6-ba溶液或10mg/l?iba溶液。

8、優(yōu)選，所述的黃花補血草無菌苗是經(jīng)過以下方法獲得的：選取黃花補血草種子，使用蒸餾水清洗，消毒，使用100μg/l?ga3溶液進行浸泡2h后，接種至ms培養(yǎng)基進行無菌苗萌發(fā)育苗培養(yǎng)。

9、優(yōu)選，所述的小段為1.0-2.0cm長的小段。

10、優(yōu)選，所述的將外植體浸泡于激素溶液中20-30min為將外植體浸泡于40mg/l?naa溶液中20min、將外植體浸泡于30mg/l?6-ba溶液中30min或?qū)⑼庵搀w浸泡于10mg/l?iba溶液中30min。

11、優(yōu)選，所述的ms培養(yǎng)基組成如下：16.5g/l硝酸銨、19g/l硝酸鉀、1.7g/l磷酸二氫鉀、3.7g/l七水硫酸鎂、4.4g/l二水氯化鈣、16.9mg/l一水硫酸錳、8.6mg/l七水硫酸鋅、6.2mg/l硼酸、0.83mg/l碘化鉀、0.25mg/l二水硫酸鉬二鈉、0.025mg/l五水硫酸銅、0.025mg/l六水氯化鈷、37.3mg/l二水乙二胺四乙酸鈉、27.8mg/l七水硫酸亞鐵、2mg/l甘氨酸、0.1mg/l鹽酸硫胺素、0.5mg/l鹽酸吡哆醇、0.5mg/l煙酸、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖和6g/l瓊脂，余量為水，ph調(diào)節(jié)為5.8-6.0。

12、優(yōu)選，所述的培養(yǎng)的條件為光照強度2000lx、光照時間12小時/天、溫度25±1℃。

13、優(yōu)選，所述的黃花補血草種子為兩年內(nèi)收獲的健康、飽滿、圓潤的黃花補血草種子。

14、優(yōu)選，所述的使用蒸餾水清洗為：使用流動的蒸餾水沖洗種子表面雜質(zhì)3min，再轉(zhuǎn)移至無菌條件下使用無菌蒸餾水沖洗1min。

15、優(yōu)選，所述的消毒為：黃花補血草種子使用體積分數(shù)75％乙醇水溶液浸泡30s后，使用質(zhì)量分數(shù)2％的naclo水溶液浸泡15min，用無菌蒸餾水沖洗2-3次，每次持續(xù)30s-60s；浸泡期間需要不停分散黃花補血草種子確保消毒徹底。

16、優(yōu)選，所述的無菌苗萌發(fā)育苗培養(yǎng)的時間為30d。

17、本發(fā)明的有益效果：

18、本發(fā)明主要是改變了傳統(tǒng)黃花補血草組織培養(yǎng)的方法，化簡了組織培養(yǎng)步驟，即利用高濃度的植物激素溶液(40mg/l?naa、30mg/l?6-ba、10mg/l?iba溶液)浸泡黃花補血草葉柄，從而刺激葉柄迅速吸收植物激素，誘導(dǎo)組織細胞更高效迅速地脫分化產(chǎn)生不定芽和根系，進而發(fā)育成完整的再生植株。

19、利用本發(fā)明，從黃花補血草種子接種至無菌苗培育、無菌外植體的獲取、接種至分化發(fā)育成完整的補血草植株，共用時78天左右，其中外植體分化僅需用時48天左右即可形成再生完整植株，比傳統(tǒng)往培養(yǎng)基中添加激素的愈傷組織誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)方法可節(jié)省42-72天的時間。且由于本方法操作步驟簡單、方便快捷，成本低廉、可為黃花補血草組織培養(yǎng)技術(shù)的機械化生產(chǎn)、自動化生產(chǎn)提供發(fā)展的可能。

技術(shù)特征：

1.一種直接誘導(dǎo)黃花補血草植株再生的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黃花補血草無菌苗是經(jīng)過以下方法獲得的：選取黃花補血草種子，使用蒸餾水清洗，消毒，使用100μg/l?ga3溶液進行浸泡2h后，接種至ms培養(yǎng)基進行無菌苗萌發(fā)育苗培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小段為1.0-2.0cm長的小段。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的將外植體浸泡于激素溶液中20-30min為將外植體浸泡于40mg/l?naa溶液中20min、將外植體浸泡于30mg/l?6-ba溶液中30min或?qū)⑼庵搀w浸泡于10mg/l?iba溶液中30min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的ms培養(yǎng)基組成如下：16.5g/l硝酸銨、19g/l硝酸鉀、1.7g/l磷酸二氫鉀、3.7g/l七水硫酸鎂、4.4g/l二水氯化鈣、16.9mg/l一水硫酸錳、8.6mg/l七水硫酸鋅、6.2mg/l硼酸、0.83mg/l碘化鉀、0.25mg/l二水硫酸鉬二鈉、0.025mg/l五水硫酸銅、0.025mg/l六水氯化鈷、37.3mg/l二水乙二胺四乙酸鈉、27.8mg/l七水硫酸亞鐵、2mg/l甘氨酸、0.1mg/l鹽酸硫胺素、0.5mg/l鹽酸吡哆醇、0.5mg/l煙酸、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖和6g/l瓊脂，余量為水，ph調(diào)節(jié)為5.8-6.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)的條件為光照強度2000lx、光照時間12小時/天、溫度25±1℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的黃花補血草種子為兩年內(nèi)收獲的健康、飽滿、圓潤的黃花補血草種子。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的使用蒸餾水清洗為：使用流動的蒸餾水沖洗種子表面雜質(zhì)3min，再轉(zhuǎn)移至無菌條件下使用無菌蒸餾水沖洗1min。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的消毒為：黃花補血草種子使用體積分數(shù)75％乙醇水溶液浸泡30s后，使用質(zhì)量分數(shù)2％的naclo水溶液浸泡15min，用無菌蒸餾水沖洗2-3次，每次持續(xù)30s-60s；浸泡期間需要不停分散黃花補血草種子確保消毒徹底。

10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的無菌苗萌發(fā)育苗培養(yǎng)的時間為30d。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種直接誘導(dǎo)黃花補血草整株再生的方法。本發(fā)明將培育30天的無菌黃花補血草幼苗葉柄進行分段后，分別使用高濃度NAA、6?BA、IBA溶液進行浸泡20?30min后轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基內(nèi)進行48天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，即可獲得由葉柄分化而來的再生完整植株。本發(fā)明不需要額外的愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽伸長培養(yǎng)，不定芽生根培養(yǎng)等步驟，直接可以從外植體誘導(dǎo)獲得具有根的再生完整植株，為黃花補血草的快速擴繁問題提供一套高效的解決方案，解決了組織培養(yǎng)獲取無菌苗困難、組織培養(yǎng)周期漫長、繼代和換代培養(yǎng)工序繁瑣、材料易污染等問題。

技術(shù)研發(fā)人員：劉穎,黃慧平,邱玲,黃瑜嘉,王昕霖,何俊賢,楊少瑕,薛迎斌
受保護的技術(shù)使用者：廣東海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30