本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)，具體涉及一種用于誘導(dǎo)鐵筷子葉柄再生不定芽的誘導(dǎo)方法及誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

1、鐵筷子(helleborus?×hybridus)是毛茛科(ranunculaceae)鐵筷子屬(helleborus)多年生草本宿根植物，又稱“圣誕玫瑰”，全世界共約22種，大部分分布在歐洲，我國僅有1種。鐵筷子葉形奇特，萼片花瓣狀，花色豐富花型多樣，自然條件下冬末早春開花，具有極高的觀賞價值。

2、鐵筷子的繁殖可以采用播種繁殖和分株繁殖。種子播種繁殖后代存在變異分離，不能保持與母本相同的性狀；分株繁殖雖能保持母本性狀，但繁育速度慢，生產(chǎn)效率低。隨著鐵筷子雜交育種的深入開展，每年會選育出大量的特異且觀賞價值高的雜交后代，通過分株繁殖嚴(yán)重制約了其批量化生產(chǎn)和商業(yè)化流通。現(xiàn)有的鐵筷子組織培養(yǎng)技術(shù)是以植株根狀莖或地上莖的萌芽作為外植體材料，屬破壞性取材且材料少，對母本植株傷害性大，往往造成材料死亡，不適合數(shù)量極少或單株的母本材料。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)鐵筷子葉柄再生不定芽的誘導(dǎo)方法及誘導(dǎo)培養(yǎng)基，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中誘導(dǎo)鐵筷子根狀莖或地上莖的萌芽再生不定芽效率低的技術(shù)問題。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種鐵筷子葉柄再生不定芽的誘導(dǎo)方法，包括：

4、s1、清洗鐵筷子植株，剪去老葉柄和不良根，保留8-10cm健康根系，將鐵筷子根殺菌消毒后移栽至種植介質(zhì)中；

5、s2、移栽鐵筷子植株后，待鐵筷子的根莖芽萌發(fā)，對鐵筷子的葉柄進行軟化和殺菌消毒處理，得到再生不定芽的無菌鐵筷子葉柄外植體。

6、s3、將所述無菌鐵筷子葉柄外植體接種于再生不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并置于15-25℃、光照強度1500-2000lux、ph為5.6-5.8且光周期為8-10小時的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)30-40天，直至鐵筷子葉柄上再生不定芽；

7、所述再生不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括2-4質(zhì)量份的6-芐氨基嘌呤、2-4質(zhì)量份的氯吡脲、0.5-2質(zhì)量份的玉米素、0.5-1.5質(zhì)量份的6-糠基氨基嘌呤、0.1-0.3質(zhì)量份的吲哚丁酸、400-900質(zhì)量份多元維生素片、6000-7000質(zhì)量份凝固劑、18000-22000質(zhì)量份蔗糖和950-1100體積份營養(yǎng)培養(yǎng)基；

8、其中，1質(zhì)量份：1體積份＝1mg：1ml。

9、優(yōu)選的方案，在步驟s3中，所述再生不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括2.5質(zhì)量份的6-芐氨基嘌呤、3.8質(zhì)量份的氯吡脲、1.8質(zhì)量份的玉米素、1.2質(zhì)量份的6-糠基氨基嘌呤、0.3質(zhì)量份的吲哚丁酸和490質(zhì)量份多元維生素片、6500質(zhì)量份凝固劑、21000質(zhì)量份蔗糖和980體積份營養(yǎng)培養(yǎng)基；

10、其中，1質(zhì)量份：1體積份＝1mg：1ml。

11、優(yōu)選的方案，在步驟s3中，所述再生不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括3.0質(zhì)量份的6-芐氨基嘌呤、3.0質(zhì)量份的氯吡脲、1.5質(zhì)量份的玉米素、0.8質(zhì)量份的6-糠基氨基嘌呤、0.2質(zhì)量份的吲哚丁酸和560質(zhì)量份多元維生素片、6500質(zhì)量份凝固劑、20000質(zhì)量份蔗糖和1000體積份營養(yǎng)培養(yǎng)基；

12、其中，1質(zhì)量份：1體積份＝1mg：1ml。

13、基于上述方案，經(jīng)試驗證明，3.0mg/l的6-芐氨基嘌呤、3.0mg/l的氯吡脲、1.5mg/l的玉米素、0.8mg/l的6-糠基氨基嘌呤、0.2mg/l的吲哚丁酸和多元維生素片0.56g/l、凝固劑、蔗糖和營養(yǎng)培養(yǎng)基，這些植物生長調(diào)節(jié)劑的組合，誘導(dǎo)不定芽的形成效果更佳。

14、優(yōu)選的方案，在步驟s3中，所述再生不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括4.0質(zhì)量份的6-芐氨基嘌呤、2.5質(zhì)量份的氯吡脲、0.8質(zhì)量份的玉米素、0.6質(zhì)量份的6-糠基氨基嘌呤、0.12質(zhì)量份的吲哚丁酸和850質(zhì)量份多元維生素片、7000質(zhì)量份凝固劑、22000質(zhì)量份蔗糖和1100體積份營養(yǎng)培養(yǎng)基；

15、其中，1質(zhì)量份：1體積份＝1mg：1ml。

16、優(yōu)選的方案，在步驟s1中，清洗鐵筷子植株直至根系無附著物，剪除鐵筷子老葉片和葉柄，清理不良根，使用殺菌劑浸泡殺菌，并移栽至種植介質(zhì)中，且裸露根系1-2厘米。

17、基于上述方案，清洗鐵筷子植株可以去除根系上的泥土和其他附著物，減少病原體和害蟲的潛在威脅，為植株提供一個更衛(wèi)生的生長環(huán)境；剪除老葉片和葉柄以及清理死根、病根和冗余的毛細根有助于減少植株的負(fù)擔(dān)，防止?fàn)I養(yǎng)的無效消耗，并促進健康根系的發(fā)展；使用殺菌劑浸泡植株可以消滅可能存在的病原體，降低植株感染疾病的風(fēng)險，提高成活率；裸露根系1-2厘米有助于誘發(fā)新根的生長，因為新根通常在接近地表的地方更容易萌發(fā)，這有助于植株更好地吸收水分和養(yǎng)分。

18、優(yōu)選的方案，所述殺菌劑為500-800倍的多菌靈或1000-1500倍的高錳酸鉀溶液。

19、基于上述方案，多菌靈可以干擾病原菌的有絲分裂，影響細胞分裂，起到殺菌作用，能有效防治由真菌引起的多種作物病害。高錳酸鉀能有效殺滅各種細菌繁殖體、真菌、結(jié)核桿菌，具有很強的殺菌、消毒作用。這兩種殺菌劑的合理稀釋液均可以用于鐵筷子植株的殺菌消毒處理，減少病害發(fā)生，提高鐵筷子植株的生長質(zhì)量和健康度。

20、優(yōu)選的方案，在步驟s1中，所述種植介質(zhì)包括泥炭土、珍珠巖、河沙中的至少一種。

21、基于上述方案，泥炭土和珍珠巖的多孔結(jié)構(gòu)有利于鐵筷子植株根部的呼吸，同時預(yù)防根部積水和減少病害。泥炭土的保水性和保肥性使其能有效地保持水分和養(yǎng)分，滿足鐵筷子的生長需求。而珍珠巖能吸收自重2-3倍的水分，保持土壤濕潤，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不會與營養(yǎng)液反應(yīng)，無菌且不含有機質(zhì)，避免了霉菌的滋生，還能調(diào)節(jié)土壤溫度，保護根系。河沙因其疏松、透氣和透水的特性，適用于鐵筷子的育苗、扦插和種植，是一種經(jīng)濟實惠且來源廣泛的種植介質(zhì)，適合各種規(guī)模的種植使用，故以上三種種植介質(zhì)均是種植鐵筷子的良好選擇。

22、優(yōu)選的方案，在步驟s2中，當(dāng)鐵筷子的根莖芽萌發(fā)，且鐵筷子葉片長至8-12cm時，將鐵筷子葉柄使用黑膜覆蓋，再用不透光容器罩扣，放置于暗室進行軟化處理，使用70-75％的酒精搽拭軟化后的鐵筷子葉柄，再用1000倍氯化汞溶液浸泡5-7分鐘，無菌水清洗3-5次，無菌濾紙吸干水分，得到再生不定芽的無菌鐵筷子葉柄外植體。

23、基于上述方案，通過使用黑膜覆蓋和暗室處理來模擬自然界中遮陰條件下的生長環(huán)境，可以促進鐵筷子葉柄的軟化，使葉柄變的幼嫩，利于吸收激素，從而利于不定芽的形成，這種處理方式誘導(dǎo)了不定芽的產(chǎn)生。隨后，利用70-75％的酒精搽拭和1000倍氯化汞溶液浸泡的步驟，能夠有效殺滅鐵筷子葉柄表面可能存在的病原微生物，減少污染風(fēng)險，其中酒精和氯化汞作為常用的消毒劑，能有效殺滅細菌和真菌，從而提高鐵筷子的繁殖效率。

24、優(yōu)選的方案，在步驟s3中，所述再生不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包括所述營養(yǎng)培養(yǎng)基為wpm培養(yǎng)基，所述凝固劑為卡拉膠。

25、基于上述方案，wpm(woody?plant?medium)培養(yǎng)基是專為木本植物組織培養(yǎng)設(shè)計的培養(yǎng)基，它通過改良ms培養(yǎng)基，使用硫酸鉀替換了硝酸鉀，并降低了硝酸銨的含量，使得氮鹽主要以硝酸鈣的形式供應(yīng)。這種低鹽濃度的培養(yǎng)基適宜于鐵筷子等木本植物的不定芽誘導(dǎo)和生長，能夠提供植物生長所需的微量元素、大量元素和維生素，同時蔗糖提供能源，有助于植物細胞的生長和發(fā)育?？ɡz有助于鐵筷子外植體的固定和生長，同時提供了一個均勻且富有營養(yǎng)的環(huán)境，有利于鐵筷子葉柄不定芽的誘導(dǎo)和再生。

26、第二方面，本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)鐵筷子葉柄再生不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括2-4質(zhì)量份的6-芐氨基嘌呤、2-4質(zhì)量份的氯吡脲、0.5-2質(zhì)量份的玉米素、0.5-1.5質(zhì)量份的6-糠基氨基嘌呤、0.1-0.3質(zhì)量份的吲哚丁酸、400-900質(zhì)量份多元維生素片、6000-7000質(zhì)量份凝固劑、18000-22000質(zhì)量份蔗糖和950-1100體積份營養(yǎng)培養(yǎng)基；

27、其中，1質(zhì)量份：1體積份＝1mg：1ml。

28、本發(fā)明的有益效果為：

29、1、本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)鐵筷子葉柄再生不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)方法，首次采用鐵筷子的葉柄作為外植體進行繁殖，這種方法對母株的損傷極小，具有保護性。同時，由于材料的成活率較高，且來源廣泛，且能較好地保持母本的優(yōu)良性狀，有助于保持鐵筷子的遺傳穩(wěn)定性，并可實現(xiàn)全年無休的連續(xù)快繁。因此，對于鐵筷子的種苗繁育而言，本發(fā)明具有重要的實踐價值，因此特別適合鐵筷子的繁殖需求。

30、2、通過本發(fā)明提供的再生不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：3.0質(zhì)量份的6-芐氨基嘌呤、3.0質(zhì)量份的氯吡脲、1.5質(zhì)量份的玉米素、0.8質(zhì)量份的6-糠基氨基嘌呤、0.2質(zhì)量份的吲哚丁酸和560質(zhì)量份多元維生素片、6500質(zhì)量份凝固劑、20000質(zhì)量份蔗糖和1000體積份營養(yǎng)培養(yǎng)基；本發(fā)明向培養(yǎng)基中添加玉米素和6-糠基氨基嘌呤，促進細胞分裂，有利于誘導(dǎo)出不定芽。同時，還加入了多元維生素片，為葉柄在誘導(dǎo)過程中提供所需的多種維生素，顯著提高了誘導(dǎo)成功率。這些激素的組合是缺一不可的，它們與本發(fā)明提供的誘導(dǎo)方法相結(jié)合，不僅能夠高效誘導(dǎo)出不定芽，實現(xiàn)快速繁殖，還提高了繁殖效率并縮短了繁殖周期。