本發(fā)明涉及細(xì)胞凍存，尤其涉及一種細(xì)胞凍存液、制備方法、應(yīng)用與凍存細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1、nk，是人體免疫系統(tǒng)中的一種重要細(xì)胞類型。它們具有無(wú)需預(yù)先激活即可識(shí)別并殺死癌細(xì)胞和感染細(xì)胞的能力，因此被視為抗癌的第一道防線。car-nk是通過基因工程技術(shù)將人工合成的car結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄到nk細(xì)胞上而得到的。這種技術(shù)相當(dāng)于給nk細(xì)胞裝上“gps”裝置，使其在保留nk細(xì)胞原有功能的前提下，又能將目標(biāo)精準(zhǔn)鎖定在特定的抗原蛋白，從而更有效地殺死癌細(xì)胞。nk和car-nk細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，在腫瘤免疫治療中扮演著關(guān)鍵角色。然而，目前nk，car-nk細(xì)胞的凍存仍然面臨一些技術(shù)挑戰(zhàn)。

2、首先，nk、cr-nk細(xì)胞的凍存過程中，如何盡量減少，或者完全避免使用dmso等毒性物質(zhì)是一個(gè)重要問題。研究人員正在探索無(wú)dmso的凍存方法，如使用蔗糖、甘油等替代品，以提高nk、cr-nk細(xì)胞在解凍后的活性和功能。這些替代凍存劑可以有效降低細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率。

3、其次，凍存后的nk、cr-nk細(xì)胞如何保持其活性和殺傷能力也是一個(gè)關(guān)鍵問題。研究發(fā)現(xiàn)，合理的凍存條件和解凍方法可以最大程度地保護(hù)nk細(xì)胞的功能。例如，采用緩慢冷凍和快速解凍的方法，可以有效減少細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活性。此外，添加一些保護(hù)劑如牛血清白蛋白、乳糖等也可以提高nk、car-nk細(xì)胞在凍存和解凍過程中的存活率。

4、目前，nk、car-nk細(xì)胞凍存后活率和殺傷能力下降是一個(gè)亟待解決的技術(shù)難點(diǎn)。通過開發(fā)新型凍存介質(zhì)、優(yōu)化制備和凍存流程、針對(duì)不同來(lái)源細(xì)胞進(jìn)行個(gè)性化處理等措施，可以有效提高car-nk細(xì)胞凍存后的性能,為car-nk細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。因此，亟需一種凍存效果好的凍存液。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞凍存液、制備方法、應(yīng)用與凍存細(xì)胞的方法，本發(fā)明的細(xì)胞凍存液可有效減少細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活性，并保持細(xì)胞的殺傷效果，解決了現(xiàn)有細(xì)胞凍存液定存復(fù)蘇細(xì)胞后細(xì)胞存活率或殺傷效果顯著下降的問題，為細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種細(xì)胞凍存液，由如下體積百分比的原料組成：細(xì)胞冷凍保護(hù)液cs10?50-75%、右旋糖苷40葡萄糖注射液10-20%、復(fù)方電解質(zhì)注射液10-50%、人血白蛋白注射液5-30%，各原料含量的總和為100%。

4、本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞凍存液的制備方法，包括如下步驟：將細(xì)胞冷凍保護(hù)液cs10、右旋糖苷40葡萄糖注射液、復(fù)方電解質(zhì)注射液、人血白蛋白注射液按比例混合均勻，得到細(xì)胞凍存液。

5、本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞凍存液或細(xì)胞凍存液的制備方法制備的細(xì)胞凍存液在細(xì)胞凍存上的應(yīng)用。

6、優(yōu)選的，所述細(xì)胞包括nk細(xì)胞、car-nk細(xì)胞。

7、本發(fā)明還提供了一種利用細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

8、使用細(xì)胞凍存液將細(xì)胞重懸，得到細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液裝入凍存袋中，通過程序降溫儀凍存。

9、優(yōu)選的，所述程序降溫儀的凍存程序如下：

10、step1：wait?at?4.0℃；step2：1.0℃/ms?to?-10℃；step3：25.0℃/m?c?to?-50℃；step4：2℃/m?c?to?-40℃；step5：1.0℃/m?c?to?-45℃；step6：10.0℃/m?c?to?-90℃；step7：end。

11、優(yōu)選的，所述細(xì)胞懸液的濃度為1×107個(gè)/ml~1×108個(gè)/ml。

12、本發(fā)明還提供了一種利用細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

13、使用細(xì)胞凍存液將細(xì)胞重懸，得到細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液裝入凍存管中，蓋好蓋子，將裝有細(xì)胞懸液的凍存管放入程序降溫盒的孔洞中，確保管子完全插入，將程序降溫盒放置-80℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

14、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果為：

15、（1）本發(fā)明將cs10與右旋糖苷40葡萄糖注射液、復(fù)方電解質(zhì)注射液、人血白蛋白注射液混合制備得到本發(fā)明的細(xì)胞凍存液。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液可有效減少細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活性，并保持細(xì)胞的殺傷效果，解決了現(xiàn)有細(xì)胞凍存液定存復(fù)蘇細(xì)胞后細(xì)胞存活率或殺傷效果顯著下降的問題，為細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液與cs10以及目前常用細(xì)胞冷凍保護(hù)液相比相比，具有更好的保護(hù)效果，細(xì)胞復(fù)蘇后3天內(nèi)細(xì)胞的活率可恢復(fù)到與細(xì)胞凍存前相仿的狀態(tài)，并且，使用本發(fā)明的細(xì)胞凍存液冷凍復(fù)蘇后的car-nk細(xì)胞依舊具有良好的殺活性。

技術(shù)特征：

1.一種細(xì)胞凍存液，其特征在于，由如下體積百分比的原料組成：細(xì)胞冷凍保護(hù)液cs1050-75%、右旋糖苷40葡萄糖注射液10-20%、復(fù)方電解質(zhì)注射液10-50%、人血白蛋白注射液5-30%，各原料含量的總和為100%。

2.一種權(quán)利要求1所述細(xì)胞凍存液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將細(xì)胞冷凍保護(hù)液cs10、右旋糖苷40葡萄糖注射液、復(fù)方電解質(zhì)注射液、人血白蛋白注射液按比例混合均勻，得到細(xì)胞凍存液。

3.一種權(quán)利要求1所述細(xì)胞凍存液或權(quán)利要求2所述細(xì)胞凍存液的制備方法制備的細(xì)胞凍存液在細(xì)胞凍存上的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述細(xì)胞凍存液在細(xì)胞凍存上的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞包括nk細(xì)胞、car-nk細(xì)胞。

5.一種利用權(quán)利要求1所述細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞的方法，其特征在于，所述程序降溫儀的凍存程序如下：

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞的方法，其特征在于，所述細(xì)胞懸液的濃度為1×107個(gè)/ml~1×108個(gè)/ml。

8.一種利用權(quán)利要求1所述細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞凍存液、制備方法、應(yīng)用與凍存細(xì)胞的方法，屬于細(xì)胞凍存技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將CS10與右旋糖苷40葡萄糖注射液、復(fù)方電解質(zhì)注射液、人血白蛋白注射液混合制備得到本申請(qǐng)的細(xì)胞凍存液。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液可有效減少細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活性，并保持細(xì)胞的殺傷效果，解決了現(xiàn)有細(xì)胞凍存液定存復(fù)蘇細(xì)胞后細(xì)胞存活率或殺傷效果顯著下降的問題，與CS10以及目前常用細(xì)胞冷凍保護(hù)液相比相比，具有更好的保護(hù)效果，細(xì)胞復(fù)蘇后3天內(nèi)細(xì)胞的活率可恢復(fù)到與細(xì)胞凍存前相仿的狀態(tài)，并且，使用本發(fā)明的細(xì)胞凍存液冷凍復(fù)蘇后的CAR?NK細(xì)胞依舊具有良好的殺活性。

技術(shù)研發(fā)人員：蘆志華,劉永峰,齊明,胡迪超,沈玉環(huán),陸金成,田梅,陳妍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京奇邁永華生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30