本申請(qǐng)屬于細(xì)胞工程組織培養(yǎng)，尤其涉及一種降低多倍化色素萬壽菊嵌合體的方法。

背景技術(shù)：

1、萬壽菊（tagetes?erecta?l.）通常呈頭狀花序，花色以橙色為主。其花朵較大，花瓣層次分明，形狀獨(dú)特，具有很高的觀賞和藥用價(jià)值。自上世紀(jì)60年代起，towner等人發(fā)現(xiàn)了色素萬壽菊的雄性不育株，從而三系育種策略在色素萬壽菊中得到廣泛應(yīng)用。由于不育系的參與，整個(gè)育種過程降低了自交污染的風(fēng)險(xiǎn)，簡(jiǎn)化了育種程序，并減少了人工去雄的工作量。

2、在色素萬壽菊的育種中，恢復(fù)系被用作父本，而不育系則用作母本，用于生產(chǎn)具有雜種優(yōu)勢(shì)的f1代雜交種。同時(shí)，使用雄性可育株作為父本、不育株作為母本進(jìn)行不育株與可育株的保存。這種策略有效地利用了不育系的特性，提高了繁殖效率和雜種優(yōu)勢(shì)的表現(xiàn)。

3、秋水仙素誘導(dǎo)多倍體育種是一種有效的育種方法，它可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得多倍體植株，并且多倍體植株通常具有抗逆性強(qiáng)、代謝物質(zhì)含量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特性。目前，萬壽菊育種主要集中在雜交育種方面，多倍體育種相關(guān)報(bào)道較少。在已有的萬壽菊染色體加倍主要是用秋水仙素處理幼苗莖尖，從而獲得四倍體植株。該技術(shù)具有周期短、效果好等優(yōu)點(diǎn)，以及能顯著提高植物的抗逆性和代謝物質(zhì)含量，從而增強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，通過染色體加倍，可以創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，有助于育種研究和品種改良。萬壽菊染色體加倍后，不僅株高和冠幅降低，而且地徑增粗，提高了植株的抗性；葉片增大且柵欄組織厚度增加，有利于提高光合效率和適應(yīng)環(huán)境的能力。然而，在利用秋水仙素加倍處理時(shí)往往也會(huì)伴隨著出現(xiàn)嵌合體問題，流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示，一些被確定為四倍體的植株實(shí)際上是嵌合體，即體內(nèi)存在二倍體和四倍體細(xì)胞的混合。這種情況可能會(huì)影響后續(xù)的表型表達(dá)和遺傳穩(wěn)定性。遺傳穩(wěn)定性問題，多倍體植物通常具有不穩(wěn)定的遺傳特性，其后代可能出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，即回復(fù)到正常的二倍體狀態(tài)，這可能會(huì)影響到品種改良的長(zhǎng)期目標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決或部分解決相關(guān)技術(shù)中存在的問題，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N降低多倍化色素萬壽菊嵌合體的方法，通過秋水仙素多倍化處理結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定，以及組織培養(yǎng)和再次細(xì)胞學(xué)鑒定，可獲得純化的多倍化色素萬壽菊再生植株，顯著降低了嵌合體植株比例，其對(duì)于優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)色素萬壽菊的育種研究以及大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。

2、本申請(qǐng)中的降低多倍化色素萬壽菊嵌合體的方法，包括以下步驟：

3、（1）種子預(yù)處理：將色素萬壽菊雄性不育兩用系種子依次經(jīng)過曬種、清洗、浸種、消毒、沖洗處理以后，備用；

4、（2）多倍化處理?：將備用的種子轉(zhuǎn)移到含有秋水仙素的ms培養(yǎng)基中進(jìn)行多倍化處理；所述含有秋水仙素的ms培養(yǎng)基配方為：ms粉末4.4g/l、6-ba?1mg/l、naa?0.1mg/l、瓊脂8g/l、糖30g/l，ph=5.8-6.0，秋水仙素濃度為0.10wt%；

5、（3）將多倍化處理后的種子依次進(jìn)行暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)；

6、（4）萬壽菊變異植株的鑒定：將光培養(yǎng)至植株長(zhǎng)至3-5cm時(shí)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定，篩選出具有多倍體特征的萬壽菊變異植株；

7、（5）變異植株篩選再生：選取篩選出的萬壽菊變異植株的葉片作為外植體接入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，然后進(jìn)行光培養(yǎng)誘導(dǎo)分化不定芽；

8、（6）萬壽菊變異植株的再次鑒定：對(duì)誘導(dǎo)出的不定芽再次進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，剔除不具有多倍體特征的萬壽菊變異植株不定芽，篩選出仍然具有多倍體特征的萬壽菊變異植株不定芽；

9、（7）變異植株擴(kuò)繁：將篩選出的仍然具有多倍體特征的萬壽菊變異植株不定芽，轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁繼代培養(yǎng)；

10、（8）生根培養(yǎng)：將擴(kuò)繁培養(yǎng)伸長(zhǎng)的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，即得純化的多倍化色素萬壽菊再生植株。

11、進(jìn)一步地，所述步驟（3）中的暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)培養(yǎng)溫度均為24±2℃，相對(duì)濕度均維持在65-70%，光培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度為2500-3000lx，光照時(shí)間為16h/d，光培養(yǎng)周期為9-15天，暗培養(yǎng)期為一周。

12、進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為：ms粉末4.4g/l、6-ba?5mg/l、iaa?3mg/l、硝酸銀2mg/l、瓊脂8g/l、糖30g/l，ph=6.0。

13、進(jìn)一步地，所述繼代培養(yǎng)基的配方為：ms粉末4.4g/l、瓊脂8g/l、糖30g/l，ph=6.0；繼代培養(yǎng)的時(shí)間為30-50d。

14、進(jìn)一步地，所述生根培養(yǎng)的配方為：ms粉末4.4g/l、naa?0.15mg/l、瓊脂8g/l、糖30g/l，ph=6.0；生根培養(yǎng)的時(shí)間為30d。

15、本申請(qǐng)的有益效果是：

16、1、本申請(qǐng)?jiān)诶煤星锼伤氐膍s培養(yǎng)基中對(duì)預(yù)處理過的色素萬壽菊雄性不育兩用系種子進(jìn)行多倍化處理，多倍化處理過程中可能會(huì)出現(xiàn)部分細(xì)胞加倍成功，而其他細(xì)胞未加倍的情況，從而導(dǎo)致嵌合體的產(chǎn)生；即使通過形態(tài)學(xué)鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定以后，仍然有嵌合體存在；本申請(qǐng)通過初步鑒定以后，選取變異株進(jìn)行快速組織培養(yǎng)誘導(dǎo)分化不定芽，對(duì)誘導(dǎo)分化出的不定芽再次進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定從而進(jìn)一步篩選出仍然具有多倍體特征的萬壽菊變異植株不定芽，并且經(jīng)過繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)以后，即可獲得純化的多倍化色素萬壽菊再生植株，顯著降低了嵌合體植株比例。

17、（2）本申請(qǐng)通過秋水仙素多倍化處理結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定，以及組織培養(yǎng)和再次細(xì)胞學(xué)鑒定，相比較傳統(tǒng)的育種方法，可以縮短育種時(shí)限。

技術(shù)特征：

1.一種降低多倍化色素萬壽菊嵌合體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種降低多倍化色素萬壽菊嵌合體的方法，其特征在于，所述步驟（3）中的暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)培養(yǎng)溫度均為24±2℃，相對(duì)濕度均維持在65-70%，光培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度為2500-3000lx，光照時(shí)間為16h/d，光培養(yǎng)周期為9-15天，暗培養(yǎng)期為一周。

3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種降低多倍化色素萬壽菊嵌合體的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為：ms粉末4.4g/l、6-ba?5mg/l、iaa?3mg/l、硝酸銀2mg/l、瓊脂8g/l、糖30g/l，ph=6.0。

4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種降低多倍化色素萬壽菊嵌合體的方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)基的配方為：ms粉末4.4g/l、瓊脂8g/l、糖30g/l，ph=6.0；繼代培養(yǎng)的時(shí)間為30-50d。

5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種降低多倍化色素萬壽菊嵌合體的方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)的配方為：ms粉末4.4g/l、naa?0.15mg/l、瓊脂8g/l、糖30g/l，ph=6.0；生根培養(yǎng)的時(shí)間為30d。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)是關(guān)于一種降低多倍化色素萬壽菊嵌合體的方法，屬于細(xì)胞工程組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。該方法，包括以下步驟：（1）種子預(yù)處理，備用；（2）多倍化處理：將備用的種子轉(zhuǎn)移到含有秋水仙素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行多倍化處理；（3）將多倍化處理后的種子依次進(jìn)行暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)；（4）萬壽菊變異植株的鑒定；（5）變異植株篩選再生；（6）萬壽菊變異植株的再次鑒定；（7）變異植株擴(kuò)繁；（8）生根培養(yǎng)。本申請(qǐng)通過秋水仙素多倍化處理結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定，以及組織培養(yǎng)和再次細(xì)胞學(xué)鑒定，可獲得純化的多倍化色素萬壽菊再生植株，顯著降低了嵌合體植株比例。

技術(shù)研發(fā)人員：黃望啟,王繼華,陳秀華,李紳崇,孟超,張藝萍,許鳳,牛善策,蔣亞蓮,馬璐琳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6