專(zhuān)利名稱(chēng):通過(guò)使用苔蘚得到的生物膜形成抑制與生物膜去除的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用苔蘚來(lái)抑制生物膜形成的方法以及使用苔蘚來(lái)去除生物膜的方法。優(yōu)選泥炭蘚(Sphagnum moss)。
背景技術(shù)：
人工水系統(tǒng)中生物膜的聚積產(chǎn)生了大量顯著的問(wèn)題。根據(jù)具體的系統(tǒng)，這些問(wèn)題包括健康和感染問(wèn)題，提高的維護(hù)費(fèi)用和明顯的操作低效。從這些系統(tǒng)中減少或去除生物膜非常困難并且一般需要使用刺激且有毒性的化學(xué)品。
先前的研究已顯示，泥炭蘚顯著抑制自由漂浮(浮游)細(xì)菌生長(zhǎng)。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利7，497，947和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0032124A1，兩者都通過(guò)引用納入本文?！澳嗵刻\”是一種通用表達(dá)，指共存于泥炭沼澤中的一系列植物種類(lèi)。應(yīng)該注意“泥煤蘚(peat moss)”通常是指分解的或堆肥的泥炭蘚。通常將泥炭蘚收獲用于各種產(chǎn)品。優(yōu)選可收獲苔蘚的瓣葉(petal)，而非莖干。一般去除植物物質(zhì)較大部分(根、枝等)。去除漿液中的水并干燥所述苔蘚?？梢栽诎b或運(yùn)輸前壓縮所述苔蘚。可使用各種添加劑來(lái)改變所述苔蘚的吸收特性或物理性質(zhì)。因?yàn)槟嗵刻\容易獲得并且相對(duì)低廉，它已用于各種產(chǎn)品，主要是用于流體吸收。
本領(lǐng)域存在抑制和去除生物膜的產(chǎn)品的技術(shù)需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種抑制生物膜在水系統(tǒng)表面生長(zhǎng)的方法，該方法包括用包含有效抑制生物膜生長(zhǎng)有效量的未分解(non-decomposed)苔蘚或未分解苔蘚提取物的溶液接觸易于生物膜生長(zhǎng)的表面。本發(fā)明提供一種從水系統(tǒng)表面上去除生物膜的方法，所述方法包括用包含一定量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的溶液接觸具有生物膜的表面來(lái)有效地從所述表面上去除一些或全部生物膜?？芍苽渌鋈芤翰⑵涮砑拥较到y(tǒng)或通過(guò)將所述苔蘚置于水系統(tǒng)中原位制備該溶液，其中尤其可通過(guò)將所述苔蘚置于載體中，隨后將所述載體置于水系統(tǒng)中。
應(yīng)理解，前面的一般性描述和以下的詳細(xì)描述都只是示例和說(shuō)明性的，旨在對(duì)要求保護(hù)的本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.顯示MBEC試驗(yàn)中水性苔蘚提取物(MX)抑制生物膜形成的能力。
圖2.顯示MBEC試驗(yàn)中水性苔蘚提取物(MX)抑制或去除生物膜的劑量響應(yīng)效果。
圖3.顯示MBEC試驗(yàn)中水性苔蘚提取物(MX)抑制或去除生物膜的時(shí)程研究。
圖4.顯示苔蘚提取物的尺寸過(guò)濾組分的MBEC試驗(yàn)。[0013]圖5.顯示從生長(zhǎng)于胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)稀釋液或各種濃度苔蘚提取物的PAOl培養(yǎng)物中提取的綠膿菌素的平均0D。
圖6.顯示從生長(zhǎng)于胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)稀釋液或各種濃度苔蘚提取物的PAOl培養(yǎng)物中提取的綠膿菌素的平均0D。
優(yōu)選實(shí)施方式的具體說(shuō)明
本發(fā)明中，可用苔蘚抑制生物膜生長(zhǎng)或去除生物膜。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述苔蘚裝入或封裝入網(wǎng)格材料中以防止所述苔蘚在水性環(huán)境中分解。優(yōu)選的網(wǎng)格材料包括那些包含聚合物(例如尼龍或聚丙烯)，網(wǎng)格大小范圍約在0.1至Imm的網(wǎng)格材料。
通常優(yōu)選聚合物因?yàn)樗鼈儍r(jià)格低廉并可耐降解。
本發(fā)明適用疣壁泥炭蘚(S.papillosum)，其可從美國(guó)明尼蘇達(dá)州北部的沼澤收獲，以及S.cristatum,其可從新西蘭,威斯特蘭,杜布森,薩頓苔蘚公司(Sutton’s Moss)以壓縮板市售獲得。這些苔蘚種類(lèi)可單獨(dú)使用或在本發(fā)明的裝置和系統(tǒng)中一起使用。通常并且優(yōu)選地，將清潔所述苔蘚以去除小顆粒(例如污垢)和較大碎片(例如根和葉)。可在制造商包裝前熏蒸市售苔蘚以破壞種子。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)機(jī)械方法將苔蘚切成需要的尺寸和形狀。然后優(yōu)選通過(guò)高壓滅菌、接觸環(huán)氧乙烷或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對(duì)苔蘚滅菌。滅菌破壞所述苔蘚中的活生物體，因此避免不合乎需要的任何問(wèn)題以及避免在使用本發(fā)明的裝置時(shí)將外來(lái)微生物引入環(huán)境。然后即可使用苔蘚。
本發(fā)明提供一種抑制生物膜在水系統(tǒng)表面生長(zhǎng)的方法，所述方法包括用包含有效抑制生物膜生長(zhǎng)量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的溶液接觸易于生物膜生長(zhǎng)的表面。所述苔蘚或苔蘚提取物可 選自下組:撫壁泥炭蘚、sphagnum cristatum以及其混合物。
所述苔蘚可以是葉或葉部分的形式并且可以是壓縮的葉或葉部分的形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的量能在48小時(shí)后有效抑制30%或更多生物膜生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的量能在48小時(shí)后有效抑制50%或更多生物膜生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的量能在48小時(shí)后有效抑制70%或更多生物膜生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)結(jié)晶紫染色法來(lái)測(cè)定抑制百分比。
本發(fā)明提供一種從水系統(tǒng)表面上去除生物膜的方法，所述方法包括用包含一定量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的溶液接觸具有生物膜的表面來(lái)有效從所述表面上去除一些或全部生物膜。所述苔蘚或苔蘚提取物可選自下組:疣壁泥炭蘚、sphagnumcristatum以及其混合物。
所述苔蘚可以是葉或葉部分的形式并且可以是壓縮的葉或葉部分的形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的量能在48小時(shí)后有效去除30 %或更多生物膜。在另一個(gè)實(shí)施方式中，未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的量能在48小時(shí)后有效去除50%或更多生物膜。在一個(gè)實(shí)施方式中，未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的量能在48小時(shí)后有效去除70%或更多生物膜。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)結(jié)晶紫染色法來(lái)測(cè)定百分比去除。
可制備所述溶液并將其添加到系統(tǒng)或通過(guò)將所述苔蘚置于水系統(tǒng)中原位制備，其中尤其可通過(guò)將所述苔蘚置于載體中，隨后將載體置于水系統(tǒng)中。所述載體可以是聚合物基質(zhì)、生物基質(zhì)、膜、凝膠或水凝膠。所述苔蘚可裝在網(wǎng)袋中。[0025]所述苔蘚可壓縮并可以是條帶形式?？赏ㄟ^(guò)高溫滅菌、用化學(xué)品處理或用環(huán)氧乙烷處理來(lái)對(duì)苔蘚滅菌?？捎盟嵝匀芤合礈焯μ\，尤其是乙酸溶液。可用酸性溶液洗滌苔蘚并然后用鹽溶液洗滌。所述水系統(tǒng)可以是包含水的任何系統(tǒng)。所述水可以在礦泉、游泳池、水族箱、濺水甲板、水塔、貯存罐、池塘、冷卻塔、水瓶或馬桶。
所述苔蘚可通過(guò)下述方法制備:(i)干燥未分解苔蘚；和(ii)對(duì)所述苔蘚滅菌。所述方法可還包括壓縮所述苔蘚、壓縮所述苔蘚并將所述苔蘚切成條帶、通過(guò)高溫滅菌、化學(xué)品處理或用環(huán)氧乙烷處理來(lái)滅菌。所述苔蘚可以是泥炭蘚。所述苔蘚可選自下組:疣壁泥炭蘚、sphagnum cristatum以及其混合物。
所述苔蘚可通過(guò)下述方法制備:(i)用酸性溶液接觸未分解苔蘚；并且(ii)將所述苔蘚滅菌。所述發(fā)明可包括在步驟(i)后用鹽溶液接觸未分解苔蘚。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述酸性水溶液是乙酸溶液。所述苔蘚可以是泥炭蘚。所述苔蘚可選自下組:疣壁泥炭蘚、sphagnum cristatum以及其混合物。
實(shí)施例
材料和方法
材料
從美國(guó)，弗吉尼亞州，馬賽薩斯，ATCC獲得兩株綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa):700888 和 BAA-47(PAOl)。
所有培養(yǎng)物在Bacto膜蛋白酶大 肉湯(TSB, BD公司(Becton, Dickinson andCompany),美國(guó)，新澤西州，弗蘭克林湖)中生長(zhǎng)和維持。從新西蘭,薩頓苔蘚公司(Sutton’sMoss)獲得 S.cristatum。
苔蘚提取物
通過(guò)將苔蘚(lg/20mls)置于25%TSB中浸泡2小時(shí)來(lái)制備水性苔蘚提取物(MX)。通過(guò)真空過(guò)濾從所述苔蘚中提取液體MX，將pH調(diào)至7.0,并過(guò)濾除菌。將未稀釋(1/1)或在25% TSB中稀釋至各濃度的MX用于下述測(cè)試。
MBEC 試驗(yàn)
使用來(lái)自加拿大，亞伯達(dá)，埃德蒙頓，Innovotech公司的96孔MBEC高通量(HTP)試驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)培養(yǎng)和分析生物膜。
為生物膜抑制實(shí)驗(yàn)，向96孔板的孔中與15 μ I接種物一起添加135 μ I TSB樣品，用樁釘蓋板覆蓋。在軌道振蕩器上放置24小時(shí)來(lái)培養(yǎng)生物膜，除非有其它說(shuō)明。為了生物膜去除實(shí)驗(yàn)，每孔添加150 μ I TSB接種物并使生物膜生長(zhǎng)24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移樁釘至樣品板并且再孵育24小時(shí)。孵育后清洗樁釘并用0.1%結(jié)晶紫染色，溶解于MeOH并用平板閱讀器在550nm下讀數(shù)。根據(jù)經(jīng)處理的孔對(duì)比對(duì)照孔的平均0.D.值，計(jì)算生物膜百分比抑制或生物膜百分比去除。
培養(yǎng)物中的綠膿菌素測(cè)定
用PAOl孵育MX稀釋物或?qū)φ张囵B(yǎng)基并在30°C下T25瓶中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。24小時(shí)后，將3ml氯仿與5ml培養(yǎng)基在試管中混合并渦旋振蕩30秒。所述試管離心5分鐘并用分光光度計(jì)在6 90nm下讀取底部氯仿層以用于綠膿菌素檢測(cè)。
實(shí)施例1[0040]用上述內(nèi)容將Sphagnum cri statum置于水性溶液中制備提取物。制備標(biāo)準(zhǔn)的綠膿假單胞菌(ATCC700888)接種物并用其來(lái)制備96-孔MBEC板的樁釘上的生物膜。MBEC高通量(HTP)試驗(yàn)由加拿大，阿爾伯達(dá)，埃德蒙頓，Innovotech公司生產(chǎn)，并且基本上根據(jù)使用說(shuō)明進(jìn)行所述試驗(yàn)，其通過(guò)引用納入本文。使用說(shuō)明副本可參見(jiàn)2010年8月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/378，232。制備各濃度的過(guò)濾除菌提取物并將其添加到MBEC試驗(yàn)。30°C下在振蕩器上孵育該板。孵育24小時(shí)和48小時(shí)后，然后通過(guò)甲醇抽提和在平板閱讀機(jī)上染色定量，用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜。結(jié)果證實(shí)在24小和48小時(shí)兩者時(shí)間點(diǎn)上生物膜形成顯著抑制。
表I表明泥炭蘚在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)對(duì)生物膜形成的效果，表2表明在48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)對(duì)生物膜形成的效果。表I和表2顯示處理(泥炭蘚mg/ml )、平均光密度(OD)、標(biāo)準(zhǔn)差(SDn)和百分比抑制。
表I
處理(mg/ml) 平均OD SDa %抑制
SM 500.07 0.02 61.32
SM 250.07 0.02 60.86
SM 10O LU 0.02 44.92
SM 50.11 0.02 38.86
對(duì)照O 18 0.06
表2
處理(mg/ml) 平均OD bUn %抑制
SM 500.06 0.02 84.26
SM 250.07 0.01 83.64
SM 100.22 0.07 46.40
SM 50.29 0.08 28.52
對(duì)照0.41 0.08
上述結(jié)果證實(shí)在24和48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上生物膜形成都顯著抑制。泥炭蘚提取物可分別在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)最 大程度地抑制高達(dá)61%和84%的生物膜形成。該抑制是劑量依賴(lài)的，抑制作用可維持超過(guò)48小時(shí)。
實(shí)施例2
如圖1所示的數(shù)據(jù)證實(shí)MX在MBEC試驗(yàn)中對(duì)生物膜形成的抑制能力。MBEC試驗(yàn)中在PA 700888生物膜形成初期添加1/1MX。24小時(shí)后分析生物膜含量。數(shù)據(jù)以相對(duì)對(duì)照的％抑制來(lái)表示。用PA 700888重復(fù)實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)用結(jié)晶紫(胞內(nèi)含量)染色時(shí)，MX相對(duì)對(duì)照平均抑制65%生物膜形成，當(dāng)用阿辛藍(lán)(基質(zhì)含量)染色時(shí)平均抑制86%。
實(shí)施例3
如圖2所示，在MBEC試驗(yàn)中生物膜形成初期或已形成的生物膜中添加各濃度的MX。添加MX24小時(shí)后通過(guò)結(jié)晶紫染色來(lái)分析生物膜含量。數(shù)據(jù)用相對(duì)對(duì)照％抑制或相對(duì)對(duì)照％去除來(lái)表示。圖2中顯示的劑量響應(yīng)研究結(jié)果表明MX對(duì)生物膜的形成和去除已形成的生物膜的劑量依賴(lài)效應(yīng)。
實(shí)施例4
如圖3所示，MBEC試驗(yàn)中，在生物膜形成初期或已形成的生物膜中添加1/1MX。在添加MX后的各時(shí)間點(diǎn)通過(guò)結(jié)晶紫染色來(lái)分析生物膜含量。數(shù)據(jù)用相對(duì)對(duì)照％抑制或相對(duì)對(duì)照％去除來(lái)表示。圖3顯示的時(shí)段研究證實(shí)MX對(duì)生物膜的抑制和去除在12小時(shí)內(nèi)都建立。抑制和去除在12小時(shí)到達(dá)峰值并保持該水平。
實(shí)施例5
圖4顯示苔蘚提取物的尺寸過(guò)濾組分的MBEC試驗(yàn)。制備尺寸為100、10、5、1、和
0.5kda的組分并如實(shí)施例1那樣在MBEC試驗(yàn)中測(cè)試。在圖4中，陰影柱表明超過(guò)其尺寸極限的組分結(jié)果，非陰影柱表明低于其尺寸極限的組分結(jié)果。
實(shí)施例6
圖5顯示了提取自胰`白酶大豆肉湯(TSB)稀釋液中生長(zhǎng)的PAOl培養(yǎng)物的綠膿菌素(綠膿假單胞菌產(chǎn)生的毒性因子)的平均0D。還顯示了綠膿菌素的減少百分?jǐn)?shù)。在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定結(jié)果。用于產(chǎn)生圖5的結(jié)果示于下述表3中。
表3
權(quán)利要求
1.一種抑制生物膜在水系統(tǒng)表面生長(zhǎng)的方法，所述方法包括用包含抑制生物膜生長(zhǎng)有效量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的溶液接觸易于生物膜生長(zhǎng)的表面。
2.如權(quán)利要求
1所述方法，其特征在于，所述溶液包含未分解苔蘚。
3.如權(quán)利要求
2所述方法，其特征在于，所述未分解苔蘚是葉或葉部分的形式。
4.如權(quán)利要求
3所述方法，其特征在于，所述未分解苔蘚是壓縮的葉或葉部分的形式。
5.如權(quán)利要求
2所述方法，其特征在于，所述未分解苔蘚置于載體中。
6.如權(quán)利要求
5所述方法，其特征在于，所述載體是網(wǎng)袋。
7.如權(quán)利要求
1所述方法，其特征在于，所述溶液包含未分解苔蘚提取物。
8.如權(quán)利要求
1所述方法，其特征在于，所述水系統(tǒng)是礦泉、游泳池、水族箱、濺水甲板、水塔、儲(chǔ)存罐、池塘、冷卻塔、水瓶或馬桶。
9.如權(quán)利要求
1所述方法，其特征在于，制備所述溶液然后接觸所述表面。
10.如權(quán)利要求
2所述方法，其特征在于，通過(guò)將未分解苔蘚置于水系統(tǒng)中原位制備所述溶液。
11.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物在48小時(shí)后有效抑制30%或更 多的生物膜生長(zhǎng)。
12.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物在48小時(shí)后有效抑制50%或更多的生物膜生長(zhǎng)。
13.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物在48小時(shí)后有效抑制70%或更多生物膜生長(zhǎng)。
14.如權(quán)利要求
12所述的方法，其特征在于，通過(guò)結(jié)晶紫染色法測(cè)定百分比抑制。
15.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述苔蘚或苔蘚提取物選自下組:疣壁泥炭蘚(Sphagnum papillosum)、Sphagnum cristatum 及其混合物。
16.一種從水系統(tǒng)表面去除生物膜的方法，所述方法包括用包含一定量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的溶液接觸具有生物膜的表面來(lái)有效地從所述表面上去除一些或全部生物膜。
17.如權(quán)利要求
16所述方法，其特征在于，所述溶液包含未分解苔蘚。
18.如權(quán)利要求
17所述方法，其特征在于，所述未分解苔蘚是葉或葉部分的形式。
19.如權(quán)利要求
18所述方法，其特征在于，所述未分解苔蘚是壓縮的葉或葉部分的形式。
20.如權(quán)利要求
17所述方法，其特征在于，所述未分解苔蘚置于載體中。
21.如權(quán)利要求
20所述方法，其特征在于，所述載體是網(wǎng)袋。
22.如權(quán)利要求
16所述方法，其特征在于，所述溶液包含未分解苔蘚提取物。
23.如權(quán)利要求
16所述方法，其特征在于，所述水系統(tǒng)是礦泉、游泳池、水族箱、濺水甲板、水塔、儲(chǔ)存罐、池塘、冷卻塔、水瓶或馬桶。
24.如權(quán)利要求
16所述方法，其特征在于，制備所述溶液然后接觸所述表面。
25.如權(quán)利要求
17所述方法，其特征在于，通過(guò)將未分解苔蘚置于水系統(tǒng)中原位制備所述溶液。
26.如權(quán)利要求
16所述方法，其特征在于，所述量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物在48小時(shí)后有效去除30%或更多生物膜。
27.如權(quán)利要求
16所述方法，其特征在于，所述量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物在48小時(shí)后有效去除50%或更多生物膜。
28.如權(quán)利要求
16所述方法，其特征在于，所述量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物在48小時(shí)后有效去除70%或更多生物膜。
29.如權(quán)利要求
26所述方法，其特征在于，通過(guò)結(jié)晶紫染色測(cè)定所述百分比去除。
30.如權(quán)利要求
16所述方法，其特征在于，所述苔蘚或苔蘚提取物選自下組:疣壁泥炭蘚(Sphagnum papill osum)、Sphagnum cristatum 及其混合物。
專(zhuān)利摘要
一種在抑制生物膜在水系統(tǒng)表面生長(zhǎng)的方法，所述方法包括用包含一定量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的溶液接觸易于生物膜生長(zhǎng)的表面來(lái)有效抑制生物膜生長(zhǎng)。一種從水系統(tǒng)表面上去除生物膜的方法，所述方法包括用包含一定量的未分解苔蘚或未分解苔蘚提取物的溶液接觸具有生物膜的表面來(lái)有效地將一些或全部生物膜從所述表面上去除。
文檔編號(hào)A01N65/00GKCN103209592SQ201180041703
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2011年8月30日
發(fā)明者V·費(fèi)格爾, D·奈頓 申請(qǐng)人:安伯洛股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan