專(zhuān)利名稱(chēng):三尖杉屬植物殺線蟲(chóng)生物堿的提取方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥的制備，尤其從三尖杉屬植物提取殺線蟲(chóng)生物堿的方法。
背景技術(shù)：
植物線蟲(chóng)是一類(lèi)重要的植物病原物，全世界廣泛分布，寄主范圍廣，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)估計(jì)，植物線蟲(chóng)造成世界主要農(nóng)作物的年損失率為12.3％(Sasser，1992)。由于農(nóng)業(yè)逐漸向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，在蔬菜基地、花卉基地長(zhǎng)期種植單一作物，使土壤中線蟲(chóng)數(shù)量累積，植物線蟲(chóng)病害問(wèn)題日益突出?；瘜W(xué)殺線劑長(zhǎng)期以來(lái)是防治植物線蟲(chóng)病害的有效措施，但目前應(yīng)用的殺線劑均具有高毒、殘留時(shí)間長(zhǎng)、污染環(huán)境及地下水源的缺點(diǎn)。因此，研究開(kāi)發(fā)高效低毒的殺線劑非常必要和緊迫。從農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和環(huán)境保護(hù)的角度來(lái)說(shuō)，開(kāi)發(fā)和研究高效、低毒的蔬菜、花卉、中草藥殺線劑更是迫在眉睫。
二十世紀(jì)70年代以來(lái)，從植物中尋找天然殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)的研究逐漸受到重視。印度在這方面的研究較多，近幾年來(lái)，日本、意大利、美國(guó)、英國(guó)等西方國(guó)家也開(kāi)始有這方面的研究報(bào)道，但至今大多是在初步資源篩選階段，對(duì)殺線蟲(chóng)活性成分及殺線蟲(chóng)機(jī)理研究很少。我國(guó)在植物性殺線劑方面的研究工作才剛開(kāi)始。公開(kāi)號(hào)為CN1105512的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了一種從苦豆草中抽提出的主要成份為苦豆堿的溶液進(jìn)行殺滅松材線蟲(chóng)的方法，但該方法只提供殺滅一種線蟲(chóng)的方法。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)三尖杉枝葉提取物對(duì)松材線蟲(chóng)、根結(jié)線蟲(chóng)及水稻潛根線蟲(chóng)均有強(qiáng)殺線蟲(chóng)活性。經(jīng)進(jìn)一步研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)三尖杉?xì)缇€蟲(chóng)的有效成份是橋氧粗榧?jí)A(drupacine，C18H21NO5)(尚未公開(kāi))。因此，利用三尖杉的有效成份將可能獲得一種殺滅多種植物線蟲(chóng)的有效方法。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明提供一種殺線蟲(chóng)有效物質(zhì)橋氧粗榧?jí)A(drupacine，C18H21NO5)。這種生物堿對(duì)植物寄生線蟲(chóng)有強(qiáng)毒殺活性，0.1％濃度處理松材線蟲(chóng)5天的殺線率為98.16％，處理南方根結(jié)線蟲(chóng)54小時(shí)的殺線率為100％，處理水稻潛根線蟲(chóng)72小時(shí)的殺線率為89.5％。本發(fā)明還提供了從三尖杉屬植物中提取、分離這種生物堿的方法。
利用三尖杉屬植物的根、莖、葉、種籽為原料，原料經(jīng)晾干后粉碎，過(guò)40目篩，收集粉末，用95％工業(yè)乙醇浸提48小時(shí)以上，原料與95％工業(yè)乙醇的重量體積比為1∶2-2.5。浸提液濃縮至漿狀后加2％稀鹽酸溶解，過(guò)濾除渣，除去葉綠素、黃酮類(lèi)及少量油脂等雜質(zhì)。濾液用碳酸鈉粉末堿化至pH9，堿水液用與水不互溶的有機(jī)溶劑萃取，溶劑為氯仿、或苯、或甲苯、或二甲苯、或乙酸乙酯。萃取液水洗，回收有機(jī)溶劑，得到總生物堿。將總生物堿分成pH6-7及pH8-9兩部分，兩部分分別過(guò)硅膠柱，硅膠細(xì)度為200目，按濃縮抽干后的樣品與硅膠之比為1∶30稱(chēng)取硅膠，濕法上柱。氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，90∶10。以150ml為一個(gè)餾分收集，并測(cè)定各餾分的殺線蟲(chóng)活性，將具有殺線蟲(chóng)活性的餾分再進(jìn)行硅膠柱層析，即可得到純化的生物堿單體，測(cè)定已純化生物堿單體的殺線蟲(chóng)活性，從而得到具殺線蟲(chóng)活性的生物堿單體。
本發(fā)明的橋氧粗榧?jí)A(drupacine，C18H21NO5)作為殺線蟲(chóng)的有效成分，添加到農(nóng)藥用載體或組合物中，應(yīng)用于防治植物線蟲(chóng)?；蛴萌馍紝僦参锏奶崛∥?、分離部位或總生物堿添加到農(nóng)藥用載體或組合物中，應(yīng)用于防治植物線蟲(chóng)。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)或效果與現(xiàn)有的化學(xué)殺線劑相比，三尖杉屬植物生物堿具有高效低毒，低殘留及對(duì)作物的藥害更輕的特點(diǎn)。特別適合應(yīng)用于蔬菜、中草藥、花卉及園林植物的線蟲(chóng)病害防治。
具體實(shí)例實(shí)例1三尖杉小枝條4.5kg，晾干粉碎(過(guò)40目篩)得到粉末，用6600ml95％工業(yè)乙醇浸沒(méi)粉末，浸提一星期，濾出浸提液，濾渣再用4400ml95％工業(yè)乙醇浸提2天，濾出浸提液，濾渣再用4000ml95％工業(yè)乙醇浸提3天，濾出浸提液，濾渣再用2000ml95％工業(yè)乙醇洗，合并濾液。將濾液濃縮至漿狀，加2％稀鹽酸750ml并充分?jǐn)嚢?，過(guò)濾除渣，除去葉綠素、黃酮類(lèi)及少量油脂等雜質(zhì)。濾液加石油醚萃取，1000ml濾液加450ml石油醚，過(guò)濾，濾液用碳酸鈉堿化至pH9，再用氯仿萃取4次，氯仿液經(jīng)水洗后加無(wú)水硫酸鈉除去氯仿液中的水，800ml氯仿液加水200ml，回收氯仿，得到總生物堿20.7g。
在總生物堿中加2％稀鹽酸700ml，濾紙過(guò)濾，濾液用飽和碳酸鈉堿化，先調(diào)至pH6，然后在濾液中加等體積的氯仿萃取。在萃取后剩余的濾液中再加飽和碳酸鈉調(diào)至pH7，然后在濾液中加等體積的氯仿萃取。將pH6及pH7萃取的氯仿液合并，濃縮去除氯仿，在低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)一步抽干，得到pH6-7部位棕色粉末10.4g。同樣，在萃取后剩余的濾液中再加飽和碳酸鈉調(diào)至pH8，加等體積的氯仿萃??；在萃取后剩余的濾液中再加飽和碳酸鈉調(diào)至pH9，加等體積的氯仿萃取，將pH8及pH9萃取的氯仿液合并，濃縮去除氯仿，在低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)一步抽干，得到pH8-9部位棕色粉末8.8g。
將分成的pH6-7及pH8-9兩部分，分別過(guò)硅膠柱，硅膠細(xì)度為200目，按樣品與硅膠之比為1∶30稱(chēng)取硅膠，開(kāi)始以氯仿洗柱，以后逐漸加大極性，氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，90∶10。以150ml作為一個(gè)樣收集，蒸干溶劑，得到一個(gè)餾分。將各餾分做薄板層析，合并成分相同的餾分，將得到的各個(gè)餾分做殺線蟲(chóng)活性生測(cè)，從而得到具有殺線蟲(chóng)活性的生物堿餾分。將生測(cè)有活性的餾分進(jìn)一步過(guò)小柱，收集餾分，同時(shí)將各餾分做薄層層析，層析顯色為單斑的餾分蒸干溶劑，即可得到純化的生物堿單體，測(cè)定已純化生物堿單體的殺線蟲(chóng)活性，從而得到具殺線蟲(chóng)活性的生物堿單體。測(cè)定該生物堿單體的氫譜、碳譜及核磁共振譜，將測(cè)得的數(shù)據(jù)與已知三尖杉生物堿作比較，從而確定該生物堿單體為橋氧粗榧?jí)Adrupacine，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C18H21NO5。
實(shí)例2將上述具殺線蟲(chóng)活性的生物堿，用少量丙酮助溶，加蒸餾水配成供試濃度(如0.1克總堿加蒸餾水至100毫升，濃度即為0.1％)，對(duì)松材線蟲(chóng)，采用直徑為6cm的培養(yǎng)皿，用PDA培養(yǎng)基接種培養(yǎng)盤(pán)多毛孢菌，在25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，菌絲長(zhǎng)滿平皿。在長(zhǎng)滿菌絲的培養(yǎng)皿中間放置一小塊長(zhǎng)1cm，厚約0.5cm的小正方形脫脂棉塊。用微量注射器吸取0.5毫升配成供試濃度的生物堿溶液，注入棉塊中，再吸取0.1毫升線蟲(chóng)液加入棉塊中央，每處理設(shè)4次重復(fù)，以2％丙酮溶液作對(duì)照。在25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)線蟲(chóng)6天。將平皿內(nèi)的培養(yǎng)基全部倒出，用改良貝曼漏斗法分離收集線蟲(chóng)并計(jì)數(shù)，對(duì)線蟲(chóng)的校正死亡率計(jì)算方法如下校正死亡率(％)＝(處理組線蟲(chóng)死亡率-對(duì)照組線蟲(chóng)死亡率/1-對(duì)照組線蟲(chóng)死亡率)×100對(duì)松材線蟲(chóng)的毒殺活性見(jiàn)表1。將配成的藥液浸泡線蟲(chóng)后，對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)及水稻潛根線蟲(chóng)的毒殺活性見(jiàn)表1，表2。
表1.橋氧粗榧?jí)A(drupacine)及殺線劑益舒寶對(duì)線蟲(chóng)的毒力回歸方程處理 毒力回歸方程 LC50(％) LC5095％置信限 LC95(％) 相關(guān)系數(shù)1 Y＝9.3445+1.6927x 0.00271 0.00266～0.00276 0.02541 0.99862 Y＝11.3746+2.4201x 0.002323 0.00229～0.00235 0.01111 0.93343 Y＝10.8411+2.7583x 0.00763 0.00627～0.00928 0.03011 0.9527注1 橋氧粗榧?jí)A(drupacine)對(duì)松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)的毒力回歸方程(5天)2 殺線劑10％益舒寶顆粒劑對(duì)松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)的毒力回歸方程(5天)3 橋氧粗榧?jí)A(drupacine)對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne incognita)J2的毒力回歸方程(54h)表2.橋氧粗榧?jí)A(drupacine)對(duì)水稻潛根線蟲(chóng)(Hirschmanniella oryzae)的毒力測(cè)定(72h)


實(shí)例3將含有殺線蟲(chóng)活性成分的三尖杉小枝條干燥后粉碎成粉末，過(guò)40目篩，收集粉末，以2公斤土拌粉末10-15克，然后裝盆，再種植非洲菊或其它花卉，可以有效防治土壤中根結(jié)線蟲(chóng)的危害，促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)。在大田應(yīng)用時(shí)，每畝溝施粉末10公斤，對(duì)花生根結(jié)線蟲(chóng)病的防治效果可達(dá)80％-90％，明顯優(yōu)于目前常用化學(xué)殺線劑10％益舒寶顆粒劑的防效(77％)，且對(duì)花生的藥害更輕。
權(quán)利要求
1.從三尖杉屬植物中提取分離得到具有殺線蟲(chóng)活性的生物堿單體為橋氧粗榧?jí)Adrupacine，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C18H21NO5。
2.三尖杉屬植物殺線蟲(chóng)生物堿的提取方法，其特征在于利用三尖杉屬植物的根、莖、葉、種籽為原料，原料經(jīng)晾干后粉碎，過(guò)40目篩，收集粉末，用95％工業(yè)乙醇浸提48小時(shí)以上，原料與95％工業(yè)乙醇的重量體積比為1∶2-2.5，浸提液濃縮后加2％稀鹽酸溶解，過(guò)濾除渣，濾液用碳酸鈉粉末堿化至pH9，堿水液用與水不互溶的有機(jī)溶劑氯仿，或苯，或甲苯，或二甲苯，或乙酸乙酯萃取，萃取液水洗，得到總生物堿，將總生物堿分成pH6-7及pH8-9兩部分，兩部分分別過(guò)硅膠柱，硅膠細(xì)度為200目，按濃縮抽干后的樣品與硅膠之比為1∶30稱(chēng)取硅膠，濕法上柱，氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，90∶10，以150ml為一個(gè)餾分收集，并測(cè)定各餾分的殺線蟲(chóng)活性，將具有殺線蟲(chóng)活性的餾分再進(jìn)行硅膠柱層析，即可得到純化的生物堿單體，測(cè)定已純化生物堿單體的殺線蟲(chóng)活性，從而得到具有殺線蟲(chóng)活性的生物堿單體。
3.三尖杉屬植物殺線蟲(chóng)生物堿的應(yīng)用，其特征在于(1)將生物堿單體橋氧粗榧?jí)A(drupacine，C18H21NO5)作為殺線蟲(chóng)的有效成分，添加到農(nóng)藥用載體或組合物中，應(yīng)用于防治植物線蟲(chóng)，或?qū)⑸飰A單體橋氧粗榧?jí)A配成不同濃度的藥液噴施或澆灌或浸泡處理，以防治植物線蟲(chóng)。(2)將三尖杉植株的小枝條或莖、或根、或種籽干燥后粉碎成粉末，盆栽應(yīng)用時(shí)，以2公斤土拌粉末10-15克，可有效防治土壤中根結(jié)線蟲(chóng)的危害，促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)，在大田應(yīng)用時(shí)，每畝溝施粉末10公斤，對(duì)植物根結(jié)線蟲(chóng)病的防治效果可達(dá)80％-90％，明顯優(yōu)于目前常用化學(xué)殺線劑10％益舒寶顆粒劑的防效(77％)，且對(duì)植物的藥害更輕。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥，尤其是殺線蟲(chóng)生物農(nóng)藥的制備方法。本發(fā)明提供一種天然殺線蟲(chóng)有效物質(zhì)橋氧粗榧?jí)A(drupacine，C
文檔編號(hào)A01N33/00GKCN1545888SQ200310112424
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月3日
發(fā)明者文艷華, 張鳳仙, 王小菁, 劉梅芳, 葉萬(wàn)輝, 馮志新 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan