專利名稱:優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織的培養(yǎng)方法和所用得的培養(yǎng)基，具體地說，本發(fā)明涉及一種紅景天的組織培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
紅景天屬植物因其獨(dú)特的藥效，被譽(yù)為“東方神草”、“高原人參”。紅景天在我國(guó)已有很長(zhǎng)的應(yīng)用歷史，《神農(nóng)本草》和《四部藥典》都有記載，列為上品之藥(劉志偉，吳謀成，李慧良。菱葉紅景天活性成份提取及其保健茶的研制。食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28(5)47-49)，可用于滋補(bǔ)強(qiáng)壯、消除疲勞、抵御寒冷。康熙皇帝曾用紅景天消除軍旅疲勞，乾隆時(shí)皇室將紅景天作為貢品索取。1976年蘇聯(lián)將紅景天用為“適應(yīng)原”樣藥物，用于宇航員、飛行員、潛水員、運(yùn)動(dòng)員等消除疲勞、增加活力。近年國(guó)內(nèi)將其作為強(qiáng)壯藥物，開發(fā)了多種制劑、保健食品及飲料，用于延緩衰老、老年性心衰、鎮(zhèn)靜、糖尿病等(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局、中國(guó)藥品生物制品檢定所編著，現(xiàn)代實(shí)用本草(上冊(cè))。北京人民衛(wèi)生出版社，1997393-397)。
紅景天甙(salidroside)被認(rèn)為是紅景天屬植物中最重要的具有治療活性的成分，目前利用紅景天甙開發(fā)的藥物主要是依靠從天然的紅景天屬植物的根和根莖中提取(平均含量為0.5％)，需要消耗大量天然植物資源(周榮漢，中藥資源學(xué)。北京中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1993278-286)。
近年來有人提出以人工栽培作為補(bǔ)救途徑。然而，由于紅景天生境狹窄，適宜的地區(qū)很少，人工栽培條件下紅景天甙產(chǎn)量低(低于0.2％)，因此，人工栽培紅景天技術(shù)也不是一個(gè)理想的解決措施。
通過細(xì)胞和組織的培養(yǎng)定向生產(chǎn)紅景天甙不受生境影響且可提高紅景天甙產(chǎn)量，是一種有效的替代途徑。
目前，僅有人對(duì)高山紅景天(Rhodiola sachalinenisis)(Xu J F，Zhao Y，Han Aiming，et al.Induction and culture of calli from Rhodiola sachalinenisis.A.Bor.Chin.J.Appl.Environ.Biol.1995，1(1)19-25.Xu J F，Xie J，Han A M，et al.Kineticand technical studies on large-scale culture of Rhodiola sachalinenisis compactcallus aggregates with air-lift reactors.Journal of Chemical Technology andBiotechnology，1998，72(3)227-234.植物愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天甙，中國(guó)專利，公開號(hào)CN1417343A，
公開日2003年5月14日)和玫瑰紅景天(Rhodiola rosea)(Miroslawa Furmanowa，Malgorzata Hartwich，August W.Alfermann，Wiktor Kozminski，Marian Olejnik.Rosacin as a product of glycosylation by Rhodiola rosea(roseroot)cell cultures.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1999，56105-110)進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)和組織培養(yǎng)的初步研究，其他紅景天屬植物的類似研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供優(yōu)美紅景天(R.coccinea)和四裂紅景(R.quadrifida)愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法。為此本發(fā)明提供了一種優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的誘導(dǎo)方法，包括以下步驟取莖、葉或芽，沖洗、消毒后，將莖剪成0.5～1cm的節(jié)段、葉剪出切口、芽直接接種到固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，23～24℃下暗培養(yǎng)。按照上述方法，誘導(dǎo)出了優(yōu)美紅景天和四裂紅景天的愈傷組織，并且愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。
植物激素是植物細(xì)胞、組織、器官離體培養(yǎng)中必不可少的物質(zhì)，不同種類、不同濃度的植物激素組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率的影響非常明顯。發(fā)明人通過正交實(shí)驗(yàn)，確定了優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織誘導(dǎo)方法的優(yōu)選的方案，特征在于所用的培養(yǎng)基包含以下濃度組合的激素6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～3mg/L和/或激動(dòng)素(KT) 0.1～1.0mg/L中至少一種，以及萘乙酸(NAA) 0.3～2mg/L和/或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.5～1.0mg/L中至少一種。
將其添加到基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中，可以誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織，出愈率高，30天的出愈率可達(dá)到60％～100％。
本發(fā)明還提供了一種優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的繼代培養(yǎng)方法，包括以下步驟優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織在固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)25～35天后，挑選生長(zhǎng)快、顏色鮮嫩的愈傷組織，接種在固體繼代培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)。傳代3～5次后，將固體培養(yǎng)基上的愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)。按照上述方法，優(yōu)美紅景天和四裂紅景天的愈傷組織生長(zhǎng)良好。
不同種類、不同濃度的植物激素對(duì)愈傷組織的培養(yǎng)也有著非常顯著的影響，經(jīng)過探索，發(fā)明人確定了優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法的優(yōu)選的方案，其特征是所用的培養(yǎng)基中添加包含以下濃度組合的激素6-芐基氨基嘌呤 3～8mg/L 萘乙酸(NAA) 0.5～1.0mg/L(6-BA)脫落酸(ABA) 0.01～0.1mg/L 赤霉素(GA3) 0.5～2.0mg/L將其添加到基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基中，優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織增長(zhǎng)較快，20～25天收獲時(shí)干重可達(dá)18～25g/L；并且愈傷組織紅景天甙的產(chǎn)量較高，可達(dá)到50～60mg/L。
其更優(yōu)選的方案是所用的培養(yǎng)基包含以下濃度組合的誘導(dǎo)子水楊酸 0.2～2mg/L茉莉酸甲酯 0.5～5mg/L
酵母提取物 0.1～1g/L誘導(dǎo)子起到脅迫植物合成和積累次級(jí)代謝產(chǎn)物的作用，該組合可以提高優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織中紅景天甙的產(chǎn)量，與不加誘導(dǎo)子的培養(yǎng)基相比，紅景天甙含量可以提高3～5倍。
培養(yǎng)基的組成優(yōu)化是提高次級(jí)代謝產(chǎn)物——紅景天甙的重要方法之一。本發(fā)明還提供了優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法更優(yōu)選的方案，其特征是所用的培養(yǎng)基是改良的MS培養(yǎng)基，其組分和濃度如下蔗糖 30000～60000mg/L 硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸銨 1650mg/L 氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸鉀 1900mg/L 甘氨酸 4～6mg/L磷酸二氫鉀 170mg/L 鹽酸硫胺素 0.8～2.0mg/L硫酸鎂 370mg/L 鹽酸吡哆素 1.0～2.0mg/L氯化鈣 440mg/L 煙酸 1.0～2.0mg/L硫酸錳 22.3mg/L 肌醇 200～300mg/L硫酸鋅 8.6mg/L 硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 55～85mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二鈉 74.6～111.9mg/L碘化鉀 0.83mg/L 瓊脂 0～2000mg/L鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.25mg/L溶劑為水。
這種改良的MS培養(yǎng)基與MS基本培養(yǎng)基相比，可以使優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織紅景天甙的產(chǎn)量提高3～5倍。
優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法最優(yōu)選的方案是所用的改良的MS培養(yǎng)基，組成和含量如下蔗糖 30000mg/L 硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸銨 1650mg/L 氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸鉀 1900mg/L 甘氨酸 4mg/L磷酸二氫鉀 170mg/L 鹽酸硫胺素 0.8mg/L硫酸鎂 370mg/L 鹽酸吡哆素 1.0mg/L氯化鈣 440mg/L 煙酸 1.0mg/L硫酸錳 22.3mg/L 肌醇 200mg/L硫酸鋅 8.6mg/L 硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 55.6mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二鈉 74.6mg/L碘化鉀 0.83mg/L 瓊脂 0～2000mg/L鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.25mg/L其余為水。
以上培養(yǎng)基按普通的培養(yǎng)基配制方法配制。



附圖1為優(yōu)美紅景天愈傷組織懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)(鮮重)附圖2為優(yōu)美紅景天愈傷組織懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)(干重)具體實(shí)施方式
下面用實(shí)施例具體說明本發(fā)明實(shí)施例1優(yōu)美紅景天芽愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的芽用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍后，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.6mg/L KT，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，芽周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為32/50。
實(shí)施例2優(yōu)美紅景天芽愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的芽用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍后，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.2mg/L KT，2.0mg/L NAA，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，芽周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為30/50。
實(shí)施例3優(yōu)美紅景天芽愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的芽用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍后，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.8mg/L KT，0.5mg/L NAA，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，芽周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為33/50。
實(shí)施例4優(yōu)美紅景天芽愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的芽用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍后，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+1.0mg/L 6-BA，0.5mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，芽周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為49/50。
實(shí)施例5優(yōu)美紅景天芽愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的芽用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍后，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+3.0mg/L 6-BA，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，芽周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為47/50。
實(shí)施例6優(yōu)美紅景天葉愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的葉用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。將葉片剪切，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，23～24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，某些葉片周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織，30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為42/50。
實(shí)施例7優(yōu)美紅景天葉愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的葉用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。將葉片剪切，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+3.0mg/L 6-BA，0.3mg/L NAA，23～24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，某些葉片周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織，30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為39/50。
實(shí)施例8優(yōu)美紅景天葉愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的葉用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。將葉片剪切，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，0.7mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，某些葉片周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織，30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為39/50。
實(shí)施例9優(yōu)美紅景天葉愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的葉用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。將葉片剪切，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L 6-BA，2.0mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，某些葉片周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織，30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為39/50。
實(shí)施例10優(yōu)美紅景天葉愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)美紅景天的葉用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。將葉片剪切，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+3.0mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，0.5mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，某些葉片周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織，30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為39/50。
實(shí)施例11優(yōu)美紅景天莖愈傷組織的誘導(dǎo)從優(yōu)美紅景天莖的基部剪取枝條，自來水沖洗5小時(shí)，無菌水沖洗3遍，75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。去除葉片，將莖剪成0.5～1cm的節(jié)段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA，0.5mg/L KT，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)7天后，某些莖段周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為41/50。
實(shí)施例12優(yōu)美紅景天莖愈傷組織的誘導(dǎo)從優(yōu)美紅景天莖的基部剪取枝條，自來水沖洗5小時(shí)，無菌水沖洗3遍，75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。去除葉片，將莖剪成0.5～1cm的節(jié)段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+3.0mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)7天后，某些莖段周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為43/50。
實(shí)施例13優(yōu)美紅景天莖愈傷組織的誘導(dǎo)從優(yōu)美紅景天莖的基部剪取枝條，自來水沖洗5小時(shí)，無菌水沖洗3遍，75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。去除葉片，將莖剪成0.5～1cm的節(jié)段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA，0.6mg/L KT，2.0mg/L NAA，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)7天后，某些莖段周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為30/50。
實(shí)施例14優(yōu)美紅景天莖愈傷組織的誘導(dǎo)從優(yōu)美紅景天莖的基部剪取枝條，自來水沖洗5小時(shí)，無菌水沖洗3遍，75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。去除葉片，將莖剪成0.5～1cm的節(jié)段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，2.0mg/L NAA，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)7天后，某些莖段周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為31/50。
實(shí)施例15四裂紅景天莖愈傷組織的誘導(dǎo)從四裂紅景天莖的基部剪取枝條，自來水沖洗5小時(shí)，無菌水沖洗3遍，75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。去除葉片，將莖剪成0.5～1cm的節(jié)段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA，0.1mg/L KT，0.3mg/L NAA，0.7mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)7天后，某些莖段周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為40/50。
實(shí)施例16四裂紅景天莖愈傷組織的誘導(dǎo)從四裂紅景天莖的基部剪取枝條，自來水沖洗5小時(shí)，無菌水沖洗3遍，75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。去除葉片，將莖剪成0.5～1cm的節(jié)段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA，0.1mg/L KT，2.0mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)7天后，某些莖段周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為41/50。
實(shí)施例17四裂紅景天莖愈傷組織的誘導(dǎo)從四裂紅景天莖的基部剪取枝條，自來水沖洗5小時(shí)，無菌水沖洗3遍，75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。去除葉片，將莖剪成0.5～1cm的節(jié)段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，1.0mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)7天后，某些莖段周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為38/50。
實(shí)施例18四裂紅景天葉愈傷組織的誘導(dǎo)四裂紅景天的葉用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。將葉片剪切，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L 6-BA，0.1mg/L KT，0.3mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，某些葉片周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織，30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為36/50。
實(shí)施例19四裂紅景天葉愈傷組織的誘導(dǎo)四裂紅景天的葉用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍。將葉片剪切，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，2.0mg/L NAA，0.7mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，某些葉片周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織，30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為33/50。
實(shí)施例20四裂紅景天芽愈傷組織的誘導(dǎo)四裂紅景天的芽用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍后，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+3.0mg/L 6-BA，0.1mg/L KT，0.3mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，芽周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為43/50。
實(shí)施例21四裂紅景天芽愈傷組織的誘導(dǎo)四裂紅景天的芽用自來水沖洗4小時(shí)，無菌水沖洗3遍，70％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗3遍后，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基固體MS基本培養(yǎng)基+3.0mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，2.0mg/L NAA，0.7mg/L 2，4-D，24℃下暗培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5天后，芽周圍有突起并逐漸長(zhǎng)出愈傷組織。30天后統(tǒng)計(jì)出愈率為40/50。
實(shí)施例22優(yōu)美紅景天愈傷組織懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)優(yōu)美紅景天愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)25天后，挑選生長(zhǎng)快、顏色鮮嫩優(yōu)美紅景天莖誘導(dǎo)愈傷組織，按照0.3g鮮重/瓶接種于20ml固體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS固體培養(yǎng)基+3mg/L 6-BA，0.5mg/L NAA，0.1mg/L ABA和1.0mg/L GA3，50ml的錐形瓶中，24℃培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1000Lx，8h/天。將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+3mg/L 6-BA，0.5mg/L NAA，0.1mg/L ABA和1.0mg/L GA3中，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好。愈傷組織每四天收獲一次，測(cè)鮮重、干重。結(jié)果見附圖1和附圖2。紅景天愈傷組織懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。從附圖1和附圖2中可以看出，愈傷組織從第四天開始就進(jìn)入快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，16天時(shí)進(jìn)入平穩(wěn)期，20天時(shí)鮮重達(dá)到最高。
實(shí)施例23優(yōu)美紅景天愈傷組織中紅景天甙的提取取0.2g烘干的優(yōu)美紅景天愈傷組織于研缽中研成粉末，加入10ml甲醇，超聲(150W)處理20min，12,000rpm離心10min，取上清。將沉淀中再加入10ml甲醇重復(fù)處理，合并上清得紅景天甙粗提液，用φ0.22μm的濾膜過濾。
實(shí)施例24愈傷組織紅景天甙的HPLC測(cè)定采用Agilent 1100 series高效液相色譜儀，在Hypersil C18 R-ODS柱(250mm×4.6mm，5μl)進(jìn)行恒速洗脫，流動(dòng)相為20％的甲醇。進(jìn)樣10μl、流速1ml/分鐘、溫度30℃、檢測(cè)波長(zhǎng)276nm。
實(shí)施例25優(yōu)美紅景天愈傷組織的液體繼代培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+3mg/L 6-BA，0.5mg/L NAA，0.01mg/L ABA和0.5mg/L GA3，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好，20天時(shí)收獲，干重為18.0g/L，紅景天甙含量為50mg/mL。
實(shí)施例26優(yōu)美紅景天愈傷組織的液體繼代培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+3mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和1.8mg/L GA3，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好，20天時(shí)收獲，干重為19.5g/L，紅景天甙含量為52mg/mL。
實(shí)施例27優(yōu)美紅景天愈傷組織的液體繼代培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+3mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和1.8mg/L GA3，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好，20天時(shí)收獲，干重為22.2g/L，紅景天甙含量為56mg/mL。
實(shí)施例28優(yōu)美紅景天愈傷組織的液體繼代培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+3mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和1.8mg/L GA3，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好，20天時(shí)收獲，干重為22.4g/L，紅景天甙含量為52mg/mL。
實(shí)施例29優(yōu)美紅景天愈傷組織的液體繼代培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+3mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，0.1mg/L ABA和1.0mg/L GA3，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好，20天時(shí)收獲，干重為23.5g/L，紅景天甙含量為54mg/mL。
實(shí)施例30優(yōu)美紅景天愈傷組織的液體繼代培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和0.5mg/L GA3，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好，20天時(shí)收獲，干重為19.0g/L，紅景天甙含量為53mg/mL。
實(shí)施例31優(yōu)美紅景天愈傷組織的液體繼代培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好，20天時(shí)收獲，干重為25.0g/L，紅景天甙含量為60mg/mL。
實(shí)施例32優(yōu)美紅景天愈傷組織的液體繼代培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+8mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和1.0mg/L GA3，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好，20天時(shí)收獲，干重為19.6g/L，紅景天甙含量為54mg/mL。
實(shí)施例33優(yōu)美紅景天愈傷組織的液體繼代培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基基礎(chǔ)MS液體培養(yǎng)基+8mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.08mg/L ABA和2.0mg/L GA3，24℃室內(nèi)散射光下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90rpm。愈傷組織生長(zhǎng)良好，20天時(shí)收獲，干重為20.2g/L，紅景天甙含量為53mg/mL。
實(shí)施例34誘導(dǎo)子對(duì)優(yōu)美紅景天愈傷組織紅景天甙產(chǎn)量的影響將優(yōu)美紅景天莖愈傷組織按1.5g鮮重/瓶分別接種在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，250ml的錐形瓶中含有50ml培養(yǎng)基，在第19天分別加入誘導(dǎo)子SA 0.2mg/L，MJ 0.5mg/L，YE 0.1g/L，24℃下室內(nèi)自然光下培養(yǎng)20天收獲，測(cè)干重為22.5g/L，提取紅景天甙后HPLC測(cè)定含量為150mg/L。
實(shí)施例35誘導(dǎo)子對(duì)優(yōu)美紅景天愈傷組織紅景天甙產(chǎn)量的影響將優(yōu)美紅景天莖愈傷組織按1.5g鮮重/瓶分別接種在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，250ml的錐形瓶中含有50ml培養(yǎng)基，在第19天分別加入誘導(dǎo)子SA 0.2mg/L，MJ 0.5mg/L，YE 1.0g/L，24℃下室內(nèi)自然光下培養(yǎng)20天收獲，測(cè)干重為23.6g/L，提取紅景天甙后HPLC測(cè)定含量為230mg/L。
實(shí)施例36誘導(dǎo)子對(duì)優(yōu)美紅景天愈傷組織紅景天甙產(chǎn)量的影響將優(yōu)美紅景天莖愈傷組織按1.5g鮮重/瓶分別接種在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，250ml的錐形瓶中含有50ml培養(yǎng)基，在第19天分別加入誘導(dǎo)子SA 0.2mg/L，MJ 3mg/L，YE 0.5g/L，24℃下室內(nèi)自然光下培養(yǎng)20天收獲，測(cè)干重為24.7g/L，提取紅景天甙后HPLC測(cè)定含量為180mg/L。
實(shí)施例37誘導(dǎo)子對(duì)優(yōu)美紅景天愈傷組織紅景天甙產(chǎn)量的影響將優(yōu)美紅景天莖愈傷組織按1.5g鮮重/瓶分別接種在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，250ml的錐形瓶中含有50ml培養(yǎng)基，在第19天分別加入誘導(dǎo)子SA 1.8mg/L，MJ 0.5mg/L，YE 0.1g/L，24℃下室內(nèi)自然光下培養(yǎng)20天收獲，測(cè)干重為24.0g/L，提取紅景天甙后HPLC測(cè)定含量為170mg/L。
實(shí)施例38誘導(dǎo)子對(duì)優(yōu)美紅景天愈傷組織紅景天甙產(chǎn)量的影響將優(yōu)美紅景天莖愈傷組織按1.5g鮮重/瓶分別接種在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，250ml的錐形瓶中含有50ml培養(yǎng)基，在第19天分別加入誘導(dǎo)子SA 2.0mg/L，MJ 0.5mg/L，YE 1.0g/L，24℃下室內(nèi)自然光下培養(yǎng)20天收獲，測(cè)干重為25.0g/L，提取紅景天甙后HPLC測(cè)定含量為240mg/L。
實(shí)施例39誘導(dǎo)子對(duì)優(yōu)美紅景天愈傷組織紅景天甙產(chǎn)量的影響將優(yōu)美紅景天莖愈傷組織按1.5g鮮重/瓶分別接種在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，250ml的錐形瓶中含有50ml培養(yǎng)基，在第19天分別加入誘導(dǎo)子SA 2.0mg/L，MJ 5.0mg/L，YE 1.0g/L，24℃下室內(nèi)自然光下培養(yǎng)20天收獲，測(cè)干重為23.8g/L，提取紅景天甙后HPLC測(cè)定含量為210mg/L。
實(shí)施例40提高優(yōu)美紅景天莖愈傷組織中紅景天甙產(chǎn)量的培養(yǎng)基以下為改良的MS液體培養(yǎng)基蔗糖 30000mg/L 硫酸銅 0.025mg/L(CuSO4·5H2O)硝酸銨 1650mg/L 氯化鈷 0.025mg/L(CoCl2·6H2O)硝酸鉀 1900mg/L 甘氨酸 4mg/L磷酸二氫鉀 170mg/L 鹽酸硫胺素 0.8mg/L硫酸鎂 370mg/L 鹽酸吡哆素 1.0mg/L氯化鈣 440mg/L 煙酸 1.0mg/L硫酸錳 22.3mg/L 肌-肌酸 200mg/L硫酸鋅 8.6mg/L 硫酸亞鐵 55.6mg/L(FeSO4·7H2O)硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二鈉 74.6mg/L碘化鉀 0.83mg/L鉬酸鈉 0.25mg/L(Na2MoO4·2H2O)
將優(yōu)美紅景天莖愈傷組織按1.5g鮮重/瓶分別接種在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，250ml的錐形瓶中含有50ml培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)有三瓶重復(fù)，24℃下暗培養(yǎng)。20天收獲，測(cè)干重為19.9，提取紅景天甙后HPLC測(cè)定含量，計(jì)算產(chǎn)量為180mg/L。
實(shí)施例41提高優(yōu)美紅景天莖愈傷組織中紅景天甙產(chǎn)量的培養(yǎng)基以下為改良的MS液體培養(yǎng)基蔗糖 55000mg/L 硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸銨 1650mg/L 氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸鉀 1900mg/L 甘氨酸 5mg/L磷酸二氫鉀 170mg/L 鹽酸硫胺素 1.5mg/L硫酸鎂 370mg/L 鹽酸吡哆素 2.0mg/L氯化鈣 440mg/L 煙酸 1.5mg/L硫酸錳 22.3mg/L 肌醇 300mg/L硫酸鋅 8.6mg/L 硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 80mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二鈉 100mg/L碘化鉀 0.83mg/L鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.25mg/L溶劑為水。
將優(yōu)美紅景天莖愈傷組織按1.5g鮮重/瓶分別接種在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的改良的MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，250ml的錐形瓶中含有50ml培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)有三瓶重復(fù)，24℃下暗培養(yǎng)。20天收獲，測(cè)干重為20.1，提取紅景天甙后HPLC測(cè)定含量，計(jì)算產(chǎn)量為150mg/L。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的誘導(dǎo)方法，包括以下步驟取莖、葉或芽，沖洗、消毒后，將莖剪成0.5～1cm的節(jié)段、葉剪出切口、芽直接接種到固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，23～24℃下暗培養(yǎng)。
2.權(quán)利要求
1所述的優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于所用的培養(yǎng)基是在固體MS基本培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～3mg/L和/或激動(dòng)素(KT) 0.1～1.0mg/L中至少一種，以及萘乙酸(NAA) 0.3～2mg/L和/或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.5～1.0mg/L中至少一種。
3.一種優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的繼代培養(yǎng)方法，包括以下步驟愈傷組織在固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)25～35天后，挑選生長(zhǎng)快、顏色鮮嫩的愈傷組織，接種在固體繼代培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)。傳代3～5次后，將固體培養(yǎng)基上的紅景天愈傷組織顆粒接種于液體繼代培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)。
4.權(quán)利要求
3所述的優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于所用的培養(yǎng)基中含有6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 3～8mg/L 萘乙酸(NAA) 0.5～1.0mg/L脫落酸(ABA) 0.01～0.1mg/L 赤霉素(GA3) 0.5～2.0mg/L
5.權(quán)利要求
4所述的優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于所用的培養(yǎng)基中還含有；水楊酸 0.2～2mg/L茉莉酸甲酯 0.5～5mg/L酵母提取物 0.1～1g/L
6.權(quán)利要求
4或5所述的優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于所用的培養(yǎng)基是改良的MS培養(yǎng)基，其組成和含量如下蔗糖 30000～60000mg/L 硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸銨 1650mg/L 氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸鉀 1900mg/L 甘氨酸 4～6mg/L磷酸二氫鉀 170mg/L 鹽酸硫胺素 0.8～2.0mg/L硫酸鎂 370mg/L 鹽酸吡哆素 1.0～2.0mg/L氯化鈣 440mg/L 煙酸 1.0～2.0mg/L硫酸錳 22.3mg/L 肌醇 200～300mg/L硫酸鋅 8.6mg/L 硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 55～85mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二鈉 74.6～111.9mg/L碘化鉀 0.83mg/L 瓊脂 0～2000mg/L鉬酸鈉 0.25mg/L(Na2MoO4·2H2O)溶劑為水。
7.權(quán)利要求
6所述的優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于所用的培養(yǎng)基是改良的MS培養(yǎng)基，其組成和含量如下蔗糖 30000mg/L 硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸銨 1650mg/L 氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸鉀 1900mg/L 甘氨酸 4mg/L磷酸二氫鉀 170mg/L 鹽酸硫胺素 0.8mg/L硫酸鎂 370mg/L 鹽酸吡哆素 1.0mg/L氯化鈣 440mg/L 煙酸 1.0mg/L硫酸錳 22.3mg/L 肌醇 200mg/L硫酸鋅 8.6mg/L 硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 55.6mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二鈉 74.6mg/L碘化鉀 0.83mg/L 瓊脂 0～2000mg/L鉬酸鈉 0.25mg/L(Na2MoO4·2H2O)溶劑為水。
專利摘要
本發(fā)明涉及植物組織的培養(yǎng)方法和的培養(yǎng)基，具體地說，本發(fā)明涉及紅景天的組織培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基。本發(fā)明提供了優(yōu)美紅景天(R.coccinea)和四裂紅景天(R.quadrifida)愈傷組織的培養(yǎng)方法，以及可以提高優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織誘導(dǎo)率的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基中添加一定濃度的植物激素組合物；還提供了一種優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織的繼代培養(yǎng)方法和適合其愈傷組織快速生長(zhǎng)并促進(jìn)紅景天甙生產(chǎn)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基系在MS基本培養(yǎng)基中添加植物激素和/或誘導(dǎo)子；以及可以提高優(yōu)美紅景天和四裂紅景天愈傷組織中紅景天甙產(chǎn)量的改良的MS培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)A01H4/00GKCN1650696SQ200410018654
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2004年2月4日
發(fā)明者盛長(zhǎng)忠, 姜燕, 元英進(jìn) 申請(qǐng)人:天津天士力制藥股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan