專利名稱:miR155轉(zhuǎn)基因小鼠中前B細(xì)胞增殖和淋巴母細(xì)胞性白血病/高度淋巴瘤的制作方法
miR155轉(zhuǎn)基因小鼠中前B細(xì)胞增殖和淋巴母細(xì)胞性白血病/高度淋巴瘤
政府支持
本發(fā)明完全或者部分得到美國政府財(cái)政補(bǔ)貼的支持。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
發(fā)明背景
急性白血病是一種骨髓和血液的快速進(jìn)行性惡性疾病，其導(dǎo)致未成熟的，無功能的細(xì)胞，所謂的胚細(xì)胞，在髓和血液中的累積。胚細(xì)胞在髓中的累積可阻斷正常血細(xì)胞的發(fā)育。結(jié)果，沒有產(chǎn)生足夠數(shù)量的紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板。當(dāng)疾病是由于髓淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞而引起的時(shí)，它導(dǎo)致急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)，而當(dāng)疾病是由于髓細(xì)胞樣祖細(xì)胞引起的時(shí)，它導(dǎo)致急性髓性白血病(AML)。
ALL是一種快速進(jìn)行性癌癥，其開始于髓淋巴細(xì)胞的惡變。ALL是最常見的兒童期白血病類型，而且在所有的年齡組中每年有3，000例新病例。轉(zhuǎn)化的，目前惡性的，細(xì)胞增殖并在髓中累積為白血病淋巴母細(xì)胞。淋巴母細(xì)胞阻斷髓中正常血細(xì)胞的形成，其導(dǎo)致不足的紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板產(chǎn)生。
高度淋巴瘤，也稱為侵襲性淋巴瘤，包括淋巴瘤的幾個(gè)亞型，其如果不治療就會相對快速地進(jìn)展。這些亞型包括，例如，AIDS相關(guān)的淋巴瘤，退行性變化的大細(xì)胞淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤，彌散性大細(xì)胞淋巴瘤，免疫母細(xì)胞淋巴瘤，淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤和小的未裂解細(xì)胞淋巴瘤。相較于彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤，高度淋巴瘤表現(xiàn)更具侵襲性，需要更強(qiáng)烈的化療，而且更常發(fā)生 于兒童中。因?yàn)榭焖俜至训募?xì)胞對抗癌劑更敏感，而且由于年輕患者通常沒有其他的健康問題，所以這些淋巴瘤中的一些顯示對治療的顯著應(yīng)答。急性淋巴母細(xì)胞性白血病和高度淋巴瘤是兒童中最常見的白血病和淋巴瘤。這些疾病，絕大部分，是多克隆的，這表明僅僅少數(shù)遺傳變化就足以誘導(dǎo)惡性腫瘤。
微小RNA(miRNA)表示一類新的豐富的小RNA，其按照與靶的互補(bǔ)程度，通過結(jié)合靶向的mRNA，和阻斷它們的翻譯或者啟動它們的降解，在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。自從它們1993年在Caenorhabditis elegans中的發(fā)現(xiàn)(Lee, R.等，Cell75:843-854(1993)),許多報(bào)道表明，在大的蛋白陣列的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中這些微小的分子具有非常不同的作用，從細(xì)胞增殖和分化到脂類代謝(Nairz，K.，等，Dev.Biol.291:314-324(2006) ；Chen, J.F.，等，Nat.Genet.38:228-233(2006) ；Naguibneva, 1.，等，Nat.Cell Biol.8:278-284(2006) ；Esau, C.，等，Cell Metab.3:87-98(2006)；和 Gauthier,B.R.，等，Nat.Med.12:36-18 (2006))。
人和小鼠中造血系的miRNA分布圖顯示miRNA在造血發(fā)育過程中差異表達(dá)，這表明在造血分化中可能的作用(Chen，C.Z.，等，Science 303:83-86 (2004)；Chen, C.Z.,等，Semin.1mmunol.77: 155-165 (2005)；和 Ramkissoon, S.H.,等，Leuk.Res.30:643-647 (2006))。我們已經(jīng)證實(shí)了 miR_15a 和 miR-16-l 在 68 % 的慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)病例中缺失或下調(diào)(Calin，G.A.，等，Proc.Natl Acad Sc1.USA 99:15524-15529(2002)；和 Calin，G.A.，等，Proc.Natl Acad.Sc1.USA 101:1155-11760 (2004))，而且miRNA基因經(jīng)常位于與癌癥相關(guān)的脆性位點(diǎn)和基因組區(qū)域(Calin，G.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 101:2999-3004 (2004))。miR155 和 BIC (它的宿主基因)轉(zhuǎn)錄物已經(jīng)顯示在人B細(xì)胞淋巴瘤，特別是彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤(Eis，P.S.，等，Proc.Natl Acad.Sc1.USA102:3627-3632 (2005))，霍奇金淋巴瘤(Kluvier, J.，等，J.Pathol 207:243-249(2006)),和某些類型的伯基特淋巴瘤(潛伏類型III埃-巴二氏病毒陽性伯基特淋巴瘤)(Kluvier, J.,等,Genes Chromosomes Cancer 45: 147-153 (2006))中累積。
目前，急需產(chǎn)生動物模型，其可用于篩選和鑒定候選試劑，該候選試劑具有治療淋巴組織增生疾病，如B細(xì)胞惡性腫瘤(例如，B細(xì)胞白血病，B細(xì)胞淋巴瘤)的治療潛能。
發(fā)明概述
本發(fā)明是基于攜帶miR155轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其表達(dá)靶向B細(xì)胞(例如，使用Ig重鏈-E u增強(qiáng)子)，最初顯示白血病前期前B細(xì)胞增殖，在脾和骨髓中顯著，而且以后逐漸形成B細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)現(xiàn)。過表達(dá)miR155的轉(zhuǎn)基因小鼠逐漸形成與人淋巴組織增生疾病類似的淋巴組織增生疾病，從而這強(qiáng)烈暗示miR155涉及這些疾病的起始和/或進(jìn)展。Eu-mmu-miR155轉(zhuǎn)基因小鼠可用于設(shè)計(jì)新的治療方法來治療人中的不同形式的淋巴組織增生疾病,如B細(xì)胞惡性腫瘤(例如,急性淋巴母細(xì)胞性白血病,高度淋巴瘤)。
因此，在一個(gè)方面，這里提供了用于淋巴組織增生疾病的新的動物模型。具體地，根據(jù)一個(gè)方面，提供了用于B細(xì)胞惡性腫瘤(例如，白血病(如，急性淋巴母細(xì)胞性白血病)，淋巴瘤(例如，高度淋巴瘤)，和贅生物的動物模型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，這里提供了一種轉(zhuǎn)基因的非人動物(例如，小鼠)，其基因組包括含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的核酸構(gòu)建體，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列能指導(dǎo)在動物的B細(xì)胞中的表達(dá)，并與編碼miR155基因產(chǎn)物的核酸可操作連接。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括與SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括SEQ IDNO:2的核苷酸序列。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可以是能指導(dǎo)在動物的B細(xì)胞中表達(dá)的任何序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括Vh啟動子(例如,來源于小鼠的Vh啟動子)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子(例如，來源于小鼠的Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子)。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，該核酸構(gòu)建體包括￠-球蛋白基因(例如，來源于人或其他哺乳動物物種的￠-球蛋白基因)的3’UTR和聚腺苷酸序列。
這里還提供了轉(zhuǎn)基因的非人動物，其基因組包括含有Vh啟動子和Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子的核酸構(gòu)建體，該Vh啟動子和Ig重鏈-E u增強(qiáng)子與編碼含有SEQ ID NO:1和/或SEQID N0:2的miR155基因產(chǎn)物的核酸可操作連接。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物的基因組包括含有Vh啟動子和Ig重鏈-E u增強(qiáng)子的核酸構(gòu)建體，該Vh啟動子和Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子與編碼含有與SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的miR155基因產(chǎn)物的核酸可操作連接。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，相對于合適對照動物中的該群體，轉(zhuǎn)基因非人動物在脾，骨髓或脾和骨髓二者中具有擴(kuò)大的82201(^/0)19^/0)1(^7181710^70)43--淋巴樣細(xì)胞群體。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物顯示淋巴組織增生疾病。在某個(gè)實(shí)施方案中，淋巴組織增生疾病是B細(xì)胞惡性腫瘤(例如，B細(xì)胞白血病，比如，急性淋巴母細(xì)胞性白血??；B細(xì)胞淋巴瘤，B細(xì)胞贅生物)。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，B細(xì)胞惡性腫瘤顯示人急性淋巴母細(xì)胞性白血病，人淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤或其組合的特征。在又一個(gè)實(shí)施方案中，淋巴組織增生疾病是白血病前期狀況(例如，前B細(xì)胞增殖)。在另外的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物顯示增大的腹部，脾腫大，骨髓取代，淋巴細(xì)胞減少，或其組合。
這里還提供了測試試劑在治療或預(yù)防受試者中的淋巴組織增生疾病的治療功效的方法。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該方法包括施用試劑給轉(zhuǎn)基因的非人動物(例如，小鼠)，其基因組包括含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如，Vh啟動子，Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子，其組合)的核酸構(gòu)建體，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列能指導(dǎo)在動物的B細(xì)胞中的表達(dá),其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與編碼含有與SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的miR155基因產(chǎn)物的核酸可操作連接。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括SEQID NO:1的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
試劑已經(jīng)施用給轉(zhuǎn)基因動物以后，將轉(zhuǎn)基因動物中淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀和/或征象與沒有施用該試劑的相同基因型的對照動物進(jìn)行比較。如果相對于對照動物，該試劑抑制，阻止和/或減輕已經(jīng)施用該試劑的轉(zhuǎn)基因動物中淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀和/或征象，那么認(rèn)為該試劑在治療或預(yù)防淋巴組織增生疾病中具有治療功效。在某個(gè)實(shí)施方案中，所述的淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀和/或征象選自:擴(kuò)大的822(^70)19^/0)10^/^171^70)43-淋巴樣細(xì)胞群體，增大的腹部，脾腫大，骨髓取代，淋巴細(xì)胞減少和其組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，這里提供了一種確定試劑是否影響受試者中的淋巴組織增生疾病的方法(例如，影響一種或多種癥狀和/或征象的可檢測性和/或出現(xiàn)率的差異)。該方法包括施用試劑給這里描述的轉(zhuǎn)基因非人動物，并將轉(zhuǎn)基因動物中淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀和 /或征象與相同基因型的對照動物的進(jìn)行比較，其中對照動物沒有施用該試劑。相對于對照動物，檢測轉(zhuǎn)基因動物中淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀和/或征象的可檢測性和/或出現(xiàn)率的差異是該試劑影響淋巴組織增生疾病的指示。
在一個(gè)實(shí)施方案中，淋巴組織增生疾病是B細(xì)胞惡性腫瘤。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，B細(xì)胞惡性腫瘤選自急性淋巴母細(xì)胞性白血病，B細(xì)胞淋巴瘤(例如，高度淋巴瘤)，B細(xì)胞贅生物和其組合。B細(xì)胞惡性腫瘤可顯示人急性淋巴母細(xì)胞性白血病，人淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤或兩者的特性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，淋巴組織增生疾病是白血病前期狀況，如特征為前B細(xì)胞增殖的狀況。
本發(fā)明的這些以及其他的重要方面從下列詳細(xì)說明中將變得更顯而易見。
附圖簡述
本專利或申請文件包含至少一幅以顏色制作的附圖。帶有顏色附圖的本專利或?qū)＠暾埑霭嫖锏目截惤?jīng)請求并支付必要的費(fèi)用由專利局提供。

圖1的示意圖描述了注射到懷孕的C57/B6和FVB/N雌性小鼠的卵細(xì)胞的雄原核中的miR155轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。通過將mmu-miR155基因插入到Vh啟動子Eu增強(qiáng)子下游的EcoRV與SalI位點(diǎn)之間，來制備miR155轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。[0025]圖2A的Southern印跡描述了具有C57BL/6背景的7個(gè)miR155轉(zhuǎn)基因(1，3，5，6，7，10與14道)和8個(gè)野生型(2，4，8，9，11，12，13與15道)小鼠的基因型。
圖2B的Southern印跡描述了具有FVB/N背景的8個(gè)miR155轉(zhuǎn)基因(1，3，5，7，9，11，13與15道)和7個(gè)野生型(2，4，6，8，10，12與14道)小鼠的基因型。
圖3的對總RNA的Northern印跡描述了使用mmu-miR155成熟序列作為探針,胸腺依賴性細(xì)胞中成熟miR155的表達(dá)，該胸腺依賴性細(xì)胞分離自15個(gè)轉(zhuǎn)基因系中的6個(gè)系的3周齡小鼠的脾。脾細(xì)胞中成熟miR155最高表達(dá)水平的5個(gè)轉(zhuǎn)基因系(1，2，5，8和9)，選作進(jìn)一步培養(yǎng)和分析。一個(gè)轉(zhuǎn)基因系不表達(dá)轉(zhuǎn)基因(3道)。野生型對照缺乏轉(zhuǎn)基因表達(dá)(4，6 與 7 道)。
圖4A的圖片顯示了相對于野生型小鼠，在6月齡時(shí)，由于臨床上明顯的脾腫大，而具有顯著增大的腹部的轉(zhuǎn)基因小鼠(左邊)。
圖4B的圖片描述了圖4A中所示的小鼠的脾。轉(zhuǎn)基因小鼠的脾(左邊)，由于白血病/淋巴瘤細(xì)胞的膨脹而增大。
圖5A的顯微照片描述了以200X放大倍數(shù)，3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠脾的蘇木精/曙紅(H & E)染色切片(小鼠50 ;建立者10)。切片顯示非典型的淋巴增殖壓縮了白髓。
圖5B的顯微照片描述了以100X放大倍數(shù)，來自6月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾的H &E-染色切片。脾的總體結(jié)構(gòu)正在被非典型的淋巴樣增殖取代。只有少數(shù)胚的淋巴濾泡保留，其由于增殖而大小極大地縮小和壓縮。
圖5C的顯微照片描述了以200X放大倍數(shù)，來自6月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾的H &E-染色切片。由于成淋巴細(xì)胞的增殖，脾結(jié)構(gòu)已經(jīng)幾乎被完全磨滅。2個(gè)小的壓縮淋巴濾泡的殘余物是可見的。
圖的顯微照片描述了以400X放大倍數(shù)，來自6月齡轉(zhuǎn)基因小鼠(建立者8)的骨髓的H & E-染色切片，其顯示了骨髓中成淋巴細(xì)胞的增殖，其導(dǎo)致造血中心的取代。
圖5E的顯微照片描述了以200X放大倍數(shù)，正常脾的H & E-染色切片。
圖5F的顯微照片描述了以200X放大倍數(shù)，來自3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠(72號小鼠)的脾的切片。切片已經(jīng)用Ki67染色，并顯示脾中增加的淋巴樣增殖。
圖6的顯微照片以400X放大倍數(shù)，描述了 3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠(50號小鼠)的脾切片中非典型的淋巴樣增殖，其已經(jīng)用IgM進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。IgM存在于增殖的胸腺依賴性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(ClgM)中，作為轉(zhuǎn)基因小鼠中的褐色核周暈，而野生型胸腺依賴性細(xì)胞是強(qiáng)褐色，但是由于slgM與ClgM的存在，沒有明顯的細(xì)胞核。
圖7A的流式細(xì)胞術(shù)分析分布圖描述了來自兩個(gè)不同的建立者系(建立者8與10)的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾中，胸腺依賴性細(xì)胞的822(^70)19^/0)10^/^171^70)43-群體的膨脹。顯示了 3周齡(74號轉(zhuǎn)基因小鼠，建立者8 (74TG ;左上方)和68號野生型小鼠(68WT ；右上方))和7周齡(156號轉(zhuǎn)基因小鼠，建立者10(156TG ;左下方)和157號野生型小鼠(157WT;右下方))的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠與兩個(gè)野生型小鼠的門控脾細(xì)胞。比較左上四分之一的圖片，選通B220+IgM群體，顯示了相對于野生型，轉(zhuǎn)基因脾中前體B細(xì)胞數(shù)目的增加。
圖7B的流式細(xì)胞術(shù)分析分布圖描述了來自建立者8的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓中，胸腺依賴性細(xì)胞的822(^70)19^/0)10-/^171^70)43-群體的膨脹。顯示了 6月齡的一個(gè)轉(zhuǎn)基因和一個(gè)野生型小鼠(8號轉(zhuǎn)基因小鼠，(8TG ;左邊)和24號野生型小鼠(24WT ;右邊)的門控骨髓白細(xì)胞。比較兩個(gè)圖的右上四分之一，表明相對于野生型小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓的B200+IgM+門控成熟B細(xì)胞群體的減少。
圖8A的圖描述了 B220-PE表達(dá)，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析，對7周齡野生型小鼠n0.223(223WT)的B220+-門控脾細(xì)胞所評估的。
圖8B的圖描述了⑶10-FITC表達(dá)，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析，對7周齡野生型小鼠n0.223(223WT)的B220+-門控脾細(xì)胞所評估的。
圖8C的圖描述了 B220-PE表達(dá)，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析，對7周齡轉(zhuǎn)基因小鼠n0.222(222TG)的B220+-門控脾細(xì)胞所評估的，其表明相對于野生型小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠中B2201 群體的顯著增加(介于B220—與B220+的兩個(gè)峰值之間)。
圖8D的圖描述了⑶10-FITC表達(dá)，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析，對7周齡轉(zhuǎn)基因小鼠n0.222(222TG)的B220+-門控脾細(xì)胞所評估的，表明相對于野生型小鼠，僅僅在轉(zhuǎn)基因小鼠中的B220+-門控群體中⑶10+群體的百分比增加，這證明B2201 增生，至少部分地，是由于CDlO+群體的增加。
圖8E的圖描述了 B220-PE表達(dá)，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析，對7周齡轉(zhuǎn)基因小鼠n0.221 (221TG)的B220+-門控脾細(xì)胞所評估的，其表明相對于野生型小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠中B2201 群體的顯著增加(介于B220—與B220+的兩個(gè)峰值之間)。
圖8F的圖描述了⑶10-FITC表達(dá)，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析，對7周齡轉(zhuǎn)基因小鼠n0.221 (221TG)的B220+-門控脾細(xì)胞所評估的，表明相對于野生型小鼠，僅僅在轉(zhuǎn)基因小鼠中的B220+-門控群體中⑶10+群體的百分比增加，這證明B2201 增生，至少部分地，是由于CDlO+群體的增加。
圖9是分離自轉(zhuǎn)基因脾的淋巴樣細(xì)胞的染色體組型，分析其染色體的缺失，易位和倒位，以及中期的數(shù)目。箭頭表示9號染色體中的異常，其通過粗的額外條帶的存在而鑒定。
圖10是對從3到6周齡之間的5只轉(zhuǎn)基因(TG)與4只野生型(WT)小鼠的脾細(xì)胞提取的DNA進(jìn)行的Southern印跡。使用JH4探針和不同的消化酶進(jìn)行了 Southern印跡雜交，如在道頂部所標(biāo)明的(StuI，BglII，BamHI，與HindIII)。高分子量的粗條帶對應(yīng)于種系。相對于野生型，轉(zhuǎn)基因動物中沒有重排的條帶。
發(fā)明詳述[0048]下面是本發(fā)明的特定實(shí)施方案的描述。
如這里例示和描述的，過表達(dá)微小RNA，即miR155的轉(zhuǎn)基因小鼠，逐漸形成淋巴組織增生疾病，其類似于人類中急性淋巴母細(xì)胞性白血病和高度淋巴瘤。這里提供的結(jié)果強(qiáng)烈地表明miR155和/或其他基因(例如，在癌癥中激活的基因(例如，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因))的致癌表達(dá)涉及B細(xì)胞惡性腫瘤的起始和/或進(jìn)展。因此，這里提供了一種動物模型，其可用于研究B細(xì)胞惡性腫瘤和其他淋巴組織增生疾病的起始和進(jìn)展的機(jī)制。這種動物模型也可用于鑒定，開發(fā)和測試可用于治療或預(yù)防淋巴組織增生疾病的新的治療劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，這里提供了一種轉(zhuǎn)基因動物，其基因組包括含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的核酸構(gòu)建體或轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列能指導(dǎo)在B細(xì)胞中的表達(dá)，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與編碼miR155基因產(chǎn)物的核酸序列可操作連接。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指通過人為干預(yù)，如通過這里描述的方法，引入到非人動物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中的核酸序列。引入的遺傳信息可以是受體所屬的動物物種外源的，僅僅是特定的單獨(dú)受體外源的，或者是受體已經(jīng)具有的遺傳信息。在后面的情況中，相較于天然的內(nèi)源基因，引入的遺傳信息可以差異表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因非人動物具有包括核酸構(gòu)建體/轉(zhuǎn)基因的基因組，其能表達(dá)miR155基因產(chǎn)物。因?yàn)閙iR基因產(chǎn)物，(這里也稱為微小RNA，miR和miRNA)沒有翻譯成蛋白，所以術(shù)語“miR基因產(chǎn)物”不包括蛋白。未處理的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱為“miR前體”，而且一般包括長度大約為70-100個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物?？赏ㄟ^天然的處理途徑(例如，使用完整細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)，或通過合成處理途徑(例如，使用分離的處理酶，如分離的切酶，Argonaut或RNA酶III (如大腸桿菌RNA酶III))，將miR前體加工成活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。這種活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也稱為“加工的” miR基因轉(zhuǎn)錄物或“成熟” miRNA。當(dāng)這里通過名稱提及微小RNA時(shí)，該名稱相應(yīng)于前體和成熟形式，除非另有說明。
如這里使用的，“miR155基因產(chǎn)物”指來自miR155基因的未加工的(例如，前體)或加工的(例如，成熟)RNA轉(zhuǎn)錄物，如，但是不局限于，來自小鼠(小家鼠)的miR155基因。來自小鼠的前體miR155基因產(chǎn)物通過下面的核苷酸序列表示:5丨-CUGUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGUUUUGGCCUCUGACUGACUCCUACCUGUUAGCAUUMCAG-3 ; (SEQ IDNO:1)，而加工的，或成熟的，小鼠miR155基因產(chǎn)物通過下面的核苷酸序列表示:5 ’ -UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGG-3 ’(SEQ ID NO:2 ；GenBank 登錄號 AJ459767)。
在某些實(shí) 施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括與SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或100%的序列同一性的核苷酸序列。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有100%同一丨丨生的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括與SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有100%同一性的核苷酸序列。
可以通過公知的方法，例如，使用數(shù)學(xué)算法，來進(jìn)行兩個(gè)序列的實(shí)際比較。Karlin等中描述了這種數(shù)學(xué)算法的一個(gè)優(yōu)選的，非限制性的例子(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,90:5873-5877(1993))。這種算法被并入如 Schaffer 等(Nucleic Acids Res.,29:2994-3005 (2001))所述的 BLASTN 和 BLASTX 程序(2.2 版本)中。當(dāng)利用 BLAST 和 GappedBLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序的缺省參數(shù)(例如，BLASTN;可獲自NCBI的因特網(wǎng)站點(diǎn))。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢索的數(shù)據(jù)庫是非冗余(NR)數(shù)據(jù)庫，并且序列比較的參數(shù)可以設(shè)置為:無篩選程序；期望值為10 ;字長為3 ;矩陣是BL0SUM62 ;和缺口值具有11的存在(Existence)和 I 的延伸(Extension)。
用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性例子是Myers和Miller，CABIOS (1989)的算法。這種算法結(jié)合到ALIGN程序(2.0版本)中，其是GCG (Accelrys，SanDiego, California)序列比對軟件包的部分。當(dāng)利用ALIGN程序用于比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120權(quán)殘基表，缺口長度罰分12，和缺口罰分4。用于序列分析的另外的算法是本領(lǐng)域已知的，而且包括 Torellis 和 Robotti (Comput.Appl.Biosc1.，10:3_5，1994)中描述的 ADVANCE 和 ADAM ;和 Pearson 和 Lipman 中描述的 FASTA (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,85:2444-2448,1988)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用GCG軟件包中的GAP程序(Accelrys, San Diego,California)，使用Blossom 63矩陣或PAM250矩陣，和缺口權(quán)12，10，8，6或4，以及長度權(quán)2，3，或4，得到兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可使用GCG軟件包中的GAP程序(Accelrys, San Diego, California),使用缺口權(quán)50和長度權(quán)3,得到兩個(gè)核酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。
根據(jù)一個(gè)方面，轉(zhuǎn)基因非人動物具有包括一種核酸構(gòu)建體的基因組，該核酸構(gòu)建體中編碼miR155基因產(chǎn)物的核酸序列與能指導(dǎo)在動物的B細(xì)胞中表達(dá)的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作連接。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”根據(jù)它的本領(lǐng)域公認(rèn)的含義使用。它意圖指任何DNA序列，依靠它的序列，其能導(dǎo)致連接的基因在特定的細(xì)胞中被上調(diào)或者下調(diào)。在啟動子的情況中，啟動子一般鄰近編碼區(qū)。然而，在增強(qiáng)子的情況中，增強(qiáng)子可以在離編碼區(qū)一定距離處發(fā)揮功能，以便在增強(qiáng)子與編碼區(qū)之間存在干預(yù)DNA序列。為了指導(dǎo)遺傳信息的表達(dá)，其可包括編碼特定蛋白的DNA序列(或“編碼區(qū)”)，目標(biāo)編碼區(qū)可以功能性方式與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列連接。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可用于增強(qiáng)，降低，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，或指定基因表達(dá)于某些組織或某些發(fā)育階段。該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列不必是天然存在的序列。
因此，在這里描述的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼miR155的序列與指導(dǎo)在B細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作連接，以產(chǎn)生重組構(gòu)建體或轉(zhuǎn)基因。該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可以是能指導(dǎo)在B細(xì)胞中表達(dá)的任何序列。適合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的例子包括，但不限于，Vh啟動子，Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子及其組合。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是小鼠的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列或來源于小鼠的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。
如果核酸分子包括含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信息的核苷酸序列，而且這樣的序列與編碼微小RNA的核苷酸序列可操作連接，則該核酸分子被認(rèn)為是“能表達(dá)”微小RNA或“能指導(dǎo)微小RNA的表達(dá)”。可操作連接是這樣的連接，其中試圖表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序列與核酸序列以容許基因表達(dá)的方式連接。
一般來說，基因表達(dá)所需的調(diào)節(jié)區(qū)包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子區(qū)域，增強(qiáng)子區(qū)域)，以及當(dāng)轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)，有助于基因轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定的DNA序列。
術(shù)語“啟動子” 根據(jù)它本領(lǐng)域公認(rèn)的含義使用。它意圖指通?；蚧虿倏v子的編碼序列上游的DNA區(qū)域，其結(jié)合RNA聚合酶并指導(dǎo)該酶以正確轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。如果啟動子能影響DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子區(qū)域與DNA序列可操作連接。
術(shù)語“增強(qiáng)子”根據(jù)它本領(lǐng)域公認(rèn)的含義使用。它意圖指在真核生物和某些真核病毒中發(fā)現(xiàn)的序列，當(dāng)位于離研究的基因高達(dá)幾千個(gè)堿基處時(shí)(以任一方向)，其能增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)位于所討論的基因的5’側(cè)(上游)時(shí)，這些序列通常充當(dāng)增強(qiáng)子。然而，當(dāng)位于基因的3’側(cè)(下游)時(shí)，一些增強(qiáng)子是活性的。有時(shí)，沒有(已知的)啟動子時(shí)，增強(qiáng)子元件能激活從基因的轉(zhuǎn)錄。
所述的核酸構(gòu)建體還可包括促進(jìn)構(gòu)建體和/或從該構(gòu)建體表達(dá)的基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或穩(wěn)定性的序列。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該核酸構(gòu)建體包括￠-球蛋白基因(例如，小鼠P -球蛋白基因)的3’ UTR和聚腺苷酸序列。促進(jìn)構(gòu)建體和/或從該構(gòu)建體表達(dá)的基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或穩(wěn)定性的其他序列是本領(lǐng)域已知的，而且包含于這里。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因非人動物”這里用于包括所有的脊椎動物，除了人之外。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因的非人動物是哺乳動物類。這種轉(zhuǎn)基因的非人動物包括，例如，轉(zhuǎn)基因豬，轉(zhuǎn)基因老鼠，轉(zhuǎn)基因兔，轉(zhuǎn)基因牛，轉(zhuǎn)基因山羊，及其他轉(zhuǎn)基因動物種類，特別是哺乳動物。另夕卜，嚙齒類動物家族的其他成員，例如，老鼠，和豚鼠，以及非人類的靈長類動物，如黑猩猩，可用于實(shí)施這里描述的實(shí)施方案。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物是小鼠。這里描述的轉(zhuǎn)基因非人動物包括處于所有發(fā)育階段的受試者動物，包括胚胎和胎兒階段。
“轉(zhuǎn)基因動物”是包含一個(gè)或多個(gè)帶有遺傳信息的細(xì)胞的動物，該遺傳信息直接或間接地通過考慮的遺傳操作在亞細(xì)胞水平接受，如通過顯微注射或用重組病毒感染。引入的核酸分子可以摻入到染色體內(nèi)，或者它可以是染色體外復(fù)制DNA。這里描述的適合的轉(zhuǎn)基因動物包括，但不限于，其中引入遺傳信息到生殖系細(xì)胞中，從而賦予傳遞該信息給后代的能力的那些動物。如果這種后代實(shí)際上具有一些或者全部該信息，那么它們也是轉(zhuǎn)基因動物。
為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，本領(lǐng)域已知的用于引入重組構(gòu)建體或轉(zhuǎn)基因到胚胎中的任何方法，如，例如，顯微注射，使用細(xì)胞槍，轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體融合，電穿孔，等等，可以使用。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法是顯微注射，其包括注射DNA分子到受精卵的雄原核中(參見，例如，美國專利4，870，009 ；5, 550,316 ；4, 736,866 ;和4,873, 191) 0最初在小鼠中開發(fā)用于引入重組構(gòu)建體/轉(zhuǎn)基因到哺乳動物和它們的生殖細(xì)胞中方法。這種方法隨后用于較大的動物，包括家畜類(參見，例如，PCT公開號WO88/00239，W090/05188和WO 92/11757)。顯微注射DNA到接合子的細(xì)胞質(zhì)中也可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。
用于評估引入的轉(zhuǎn)基因以及它的表達(dá)存在的方法是很容易獲得的，而且是本領(lǐng)域公知的。這種方法包括，但不限于，DNA (Southern)雜交以檢測外源DNA,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和印跡以檢測DNA，RNA或蛋白。
本實(shí)施方案不局限于任何一種動物，而是提供用于任何合適的非人脊椎動物。例如，如這里描述和例 示的，可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。其他非限制性的例子包括，例如，這里描述的其他非人哺乳動物，如豚鼠，兔，豬，綿羊，等等。通過顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的成功率在小鼠中是最聞的，其中大約25%的受:精小鼠卵，該受:精小鼠卵中已經(jīng)注射DNA,而且其已經(jīng)被移植到雌性中，將發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠。用兔，豬，綿羊和牛獲得了較低的成功率。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，相對于合適對照動物中的該群體，這里描述的轉(zhuǎn)基因非人動物在脾，骨髓或脾和骨髓二者中顯示擴(kuò)大的BZZOkVCDlPVCDlOkVlgMVTCir/CD43—淋巴樣細(xì)胞群體。如這里使用的，術(shù)語“擴(kuò)大的
CD43-細(xì)胞群體”或“B220lOT/CD19lOT/CD10lOT/IgM7TCR7CD43-細(xì)胞的增加”，指相較于對照動物，相對于其他的淋巴樣細(xì)胞亞型，顯示822(^70)19^/0)1(^718171^70)43-細(xì)胞的數(shù)目和/或822(^70)19^/0)10-/^171^70)43-細(xì)胞的比例增加的淋巴樣細(xì)胞群體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，這里描述的轉(zhuǎn)基因非人動物顯示淋巴組織增生疾病?！傲馨徒M織增生”指其屬于，或特征在于，淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞的增生；該術(shù)語一般用于指一群惡性贅生物。“淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞”指淋巴樣和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞或組織?！傲馨徒M織增生不適”(或“淋巴組織增生疾病”或“淋巴組織增生障礙”)指由與共同的會分化成幾種細(xì)胞的任何一種的，原始淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞引起的一群惡性贅生物之一，該淋巴組織增生疾病包括，尤其是，淋巴細(xì)胞，組織細(xì)胞，和單核細(xì)胞性白血病，多發(fā)性骨髓瘤，漿細(xì)胞瘤，淋巴肉芽腫病，所有的淋巴細(xì)胞性淋巴瘤，和與單株丙種球蛋白病相關(guān)的免疫分泌疾病。如這里使用的，“淋巴組織增生疾病”，“淋巴組織增生障礙”或“淋巴組織增生不適”也可指一種生理狀態(tài)，其中相對于正常或?qū)φ談游?，淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的增生，倍增和/或累積改變，但是受影響的動物卻不必然地顯示如上所述的贅生物之一的癥狀。如這里使用的，“白血病前期”狀況指在白血病的明顯癥狀發(fā)展之前的這種淋巴組織增生疾病。
在某個(gè)實(shí)施方案中，淋巴組織增生疾病是B細(xì)胞惡性腫瘤(例如，B細(xì)胞白血病(比如，急性淋巴母細(xì)胞性白血病)；B細(xì)胞淋巴瘤(例如，高級的淋巴瘤)，B細(xì)胞贅生物)。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，B細(xì)胞惡性腫瘤顯示人急性淋巴母細(xì)胞性白血病，人淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤或其組合的特征。在又一個(gè)實(shí)施方案中，淋巴組織增生疾病是白血病前期狀況(例如，前B細(xì)胞增殖)。在另外的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物顯示增大的腹部，脾腫大，骨髓取代，淋巴細(xì)胞減少，或其組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在這里描述的一種方法，其將轉(zhuǎn)基因非人動物用作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停糜谘芯苛馨徒M織增生疾病(例如，B細(xì)胞惡性腫瘤(如，白血病(例如，急性淋巴母細(xì)胞性白血病)，淋巴瘤(如，高度淋巴瘤)，和贅生物))，和測試可能的致癌劑和治療劑。
在另一個(gè)方面，這里描述了一種測試試劑在治療或預(yù)防受試者中的淋巴組織增生疾病的治療功效的方法。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該方法包括施用該試劑給這里描述的轉(zhuǎn)基因非人動物(例如，小鼠)。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物具有包括一個(gè)核酸構(gòu)建體的基因組，該核酸構(gòu)建體含有能指導(dǎo)在動物的B細(xì)胞中表達(dá)的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如，Vh啟動子，Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子，其組合)，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與編碼miR155基因產(chǎn)物的核酸可操作連接。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與這樣的核苷酸序列可操作連接，該核苷酸序列與SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR155基因產(chǎn)物包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
試劑已經(jīng)施用給轉(zhuǎn)基因動物以后，將轉(zhuǎn)基因動物中淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀和/或征象與沒有施用該試劑的相同基因型的對照動物進(jìn)行比較。如果相對于對照動物，該試劑抑制，阻止和/或減輕已經(jīng)施用該試劑的轉(zhuǎn)基因動物中淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀和/或征象，那么認(rèn)為該試劑在治療或預(yù)防淋巴組織增生疾病中具有治療功效。在某個(gè)實(shí)施方案中， 淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀和/或征象選自:擴(kuò)大的8220^/0)19^/0)1(^718171^70)43-淋巴樣細(xì)胞群體，增大的腹部，脾腫大，骨髓取代，淋巴細(xì)胞減少和其組合。
適于測試試劑的治療功效的淋巴組織增生疾病包括，例如，這里描述的那些疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，淋巴組織增生疾病是B細(xì)胞惡性腫瘤。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，B細(xì)胞惡性腫瘤選自急性淋巴母細(xì)胞性白血病,B細(xì)胞淋巴瘤(例如，高度淋巴瘤)，B細(xì)胞贅生物和其組合。B細(xì)胞惡性腫瘤可顯示人急性淋巴母細(xì)胞性白血病，人淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤或兩者的特性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，淋巴組織增生疾病是白血病前期狀況，如特征為前B細(xì)胞增殖的狀況。
如這里描述的，這里提供了在B細(xì)胞中表達(dá)miR155的轉(zhuǎn)基因非人動物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種轉(zhuǎn)基因動物，其基因組包括含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的核酸構(gòu)建體或轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列能指導(dǎo)在B細(xì)胞中的表達(dá)，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與編碼miR155的核酸序列可操作連接。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包括編碼miR155的DNA序列，其已經(jīng)置于乂11啟動子和/或Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下。在這種動物中，mirl55的表達(dá)針對未成熟的和成熟的B細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動物是小鼠，其發(fā)展擴(kuò)大的 B220lo7CD19lo7CD10lo7lgM7TCR7CD43_ 淋巴樣細(xì)胞群體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，來自顯示淋巴組織增生的轉(zhuǎn)基因動物的白血球，可以轉(zhuǎn)移到第二種動物(其可以是非轉(zhuǎn)基因動物)，從而在第二種“受體”動物中誘導(dǎo)淋巴組織增生疾病的快速發(fā)病。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，可根據(jù)這里描述的一個(gè)或多個(gè)方面，通過測定動物中這種藥征的抗淋巴組織增生活性來測試用于預(yù)防和/或治療淋巴組織增生疾病的可能的治療藥征或試劑?？赏ㄟ^測定抑制，預(yù)防，和/或破壞根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物顯示的和/或根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案產(chǎn)生的“受體”動物中淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀或征象的可能的治療藥征能力來評估這種活性。
可以測試各種治療藥征或試劑，如蛋白(例如，抗體)，肽，肽模擬物，小的有機(jī)分子，核酸等等，預(yù)防和/或治療淋巴組織增生疾病。根據(jù)這里描述的方法，可以逐一地篩選試劑，或者同時(shí)測試一種或多種試劑。在測試化合物的混合物時(shí)，通過這里描述的處理選擇的化合物，可以使用適合的方法分離(視情況而定)和鑒定(例如，測序，色譜法)。也可以根據(jù)這些方法確定測試樣品中一種或多種化合物的存在。
可以例如，通過篩選分子文庫或集合，如，國家癌癥研究所的化學(xué)藥品貯藏處，在測定抑制和/或預(yù)防這里描述的轉(zhuǎn)基因動物顯示的淋巴組織增生疾病的一種或多種癥狀或征象的分析中，鑒定預(yù)防和/或治療淋巴組織增生疾病的試劑。可以測試文庫，如通過組合的化學(xué)合成或其他方法生產(chǎn)的化合物(例如，有機(jī)化合物，重組或合成肽，“類肽”，核酸)的組合文庫(參見，例如，Zuckerman, R.N.等，J.Med.Chem.,37:2678-2685(1994)和其中引用的參考文獻(xiàn)；也 參見，Ohlmeyer, M.H.J.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:10922-10926 (1993)和 De Witt, S.H.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6909-6913 (1993)，relating to tagged compounds ；Rutter, ff.J.等 U.S.Patent N0.5, 010, 175 ；Huebner,V.D.等，U.S.Patent N0.5，182，366 ;和 Geysen, H.M.，美國專利號 4，833，092)。其中通過層析法，從攜帶獨(dú)特標(biāo)簽的文庫篩選化合物，鑒定單個(gè)化合物是可能的。
可以根據(jù)已知的方法另外配制鑒定的治療藥征，以產(chǎn)生藥學(xué)上可接受的組合物。治療藥征或包含這種治療藥征的組合物可以各種標(biāo)準(zhǔn)方式施用給受試者(例如，轉(zhuǎn)基因動物)。例如，試劑可以使用各種途徑給藥，包括，例如，口服，飲食，局部，經(jīng)皮膚，直腸，腸胃外(例如，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，皮內(nèi)注射)，和吸入(例如,支氣管內(nèi)，鼻內(nèi)，口服吸入，鼻內(nèi)滴劑)。給藥可以是如表明的局部的或全身的。給藥的優(yōu)選模式可以根據(jù)待施用的抗體或抗原結(jié)合片段，和被治療的特定不適(例如，疾病)而改變，但是，口服或腸胃外給藥一般是優(yōu)選的。
試劑可以腸胃外給藥如，例如，通過靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，鞘內(nèi)或皮下注射。腸胃外給藥可以通過將試劑摻入到溶液或懸浮液中來實(shí)現(xiàn)。這種溶液或混懸液也可包括無菌稀釋劑，如注射用水，鹽溶液，抑菌鹽水(包含大約0.9% mg/ml苯甲醇的鹽水)，磷酸緩沖鹽溶液(這里稱為PBS) ,Hank^ s溶液,Ringei^ s_乳酸鹽，固定油類,聚乙二醇,甘油，丙二醇,及其他合成的溶劑。腸胃外制劑還可包括抗菌劑(例如，苯甲醇，對羥基苯甲酸甲酯)，抗氧化劑(例如，抗壞血酸，亞硫酸氫鈉)，和螯合劑(例如，EDTA)。緩沖液如醋酸鹽，檸檬酸鹽和磷酸鹽和用于調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉和葡萄糖，也可添加。腸胃外制劑可以封裝到安瓿，一次性注射器，或由玻璃或塑料制成的多次劑量小瓶中。[0083]實(shí)施例
實(shí)施例1:產(chǎn)生E U -mmu-miR155轉(zhuǎn)基因小鼠
材料和方法
轉(zhuǎn)基因小鼠:
通過PCR,從 129SvJ 小鼠(The Jackson Laboratory),擴(kuò)增包含 miR155 的前體序列的318-bp片段，并克隆到pBSVE6BK(pE U )質(zhì)粒的EcoRV和SalT位點(diǎn)，該質(zhì)粒包含用于Ig重鏈的Eu增強(qiáng)子，Vh啟動子，和人￠-球蛋白基因的3’ UTR和聚腺苷酸(圖1)，而且以前已經(jīng)用于在Eu-TCLl轉(zhuǎn)基因小鼠中逐漸形成慢性淋巴細(xì)胞性白血病(Bichi，R.，等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 99:6955-6960 (2002))。轉(zhuǎn)基因，其通過用 BssHII 和 PvuI 切割該構(gòu)建體分離，注射到懷孕的FVB/N和C57/B6小鼠的受精卵細(xì)胞的雄原核中。通過Southern印跡分析，其對用BamHI消化的尾部提取的DNA進(jìn)行，使用設(shè)計(jì)用于靶向E U增強(qiáng)子序列的探針(圖2A，2B)來篩選幼鼠中轉(zhuǎn)基因的存在。鑒定轉(zhuǎn)基因建立者，并飼養(yǎng)成年齡相當(dāng)?shù)囊吧托∈?。轉(zhuǎn)基因半合子小鼠出生，進(jìn)行研究，并與它們的野生型對應(yīng)物相比較。通過對尾部提取的DNA進(jìn)行的PCR，對小鼠進(jìn)行基因分型(數(shù)據(jù)未顯示)。
Northern 印跡分析:
脾離解在兩個(gè)磨砂顯微鏡載玻片之間，并在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌裂解物，通過用氯化銨(NH4Cl)低滲裂解使紅細(xì)胞耗竭，離心，并在PBS中重懸。用TRIzoI試劑(GIBC0, Invitrogen)提取總 RNA,在 SDS/PAGE 中點(diǎn)樣和變性，并在 Hybond N+ 膜(AmershamPharmacia)中印跡。該膜與包含成熟的mmu-miR155序列的反義物的Y-32P放射性探針雜交，孵育過夜，洗漆，并暴露于感光成像儀篩選(MolecularDynamics)。使用Typhoon圖像處理系統(tǒng)(Amersham Biosciences)對圖像進(jìn)行處理(圖3)。
結(jié)果
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，其中mmu-miR155(小鼠miR155)表達(dá)在VH啟動子-1g重鏈E y增強(qiáng)子調(diào)控下，其在B細(xì)胞發(fā)育的晚期前B細(xì)胞階段變得有活性。通過Southern印跡雜交鑒定了 15只轉(zhuǎn)基因建立者(圖2A，2B) ,C57BL/B6背景上7只(指定為F1-F7)，F(xiàn)VB/N背景上8只(指定為F8-F15)。將這些建立者飼養(yǎng)成相同品系的野生型小鼠，以產(chǎn)生15個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因系。
對從轉(zhuǎn)基因和野生型脾提取的總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR(數(shù)據(jù)未顯示)和Northern印跡分析(圖3)，顯示在5個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠的建立者系中高水平的miR155表達(dá)。I個(gè)轉(zhuǎn)基因系完全缺乏表達(dá)，而所有其他的建立者系都表達(dá)轉(zhuǎn)基因。如以前報(bào)道的，野生型小鼠在脾細(xì)胞中不表達(dá)成熟的 miR155 (Monticelli, S.，等，Genome Biol.6:R71 (2005))。
實(shí)施例2:E i1-mmu-miR 155轉(zhuǎn)基因小鼠的表型表征揭示了脾和骨髓中前B細(xì)胞的增生，其導(dǎo)致B細(xì)胞惡性腫瘤
材料和方法
體測定:
殺死以后 對小鼠稱重，解剖它們的脾，測量和稱重。
白細(xì)胞(WBC)和涂布標(biāo)本:
從小鼠的眼球后血管抽取血液，涂布到磨砂顯微鏡載玻片上并用Giemsa染色或者離心，在PBS中洗滌，并用氯化銨處理。細(xì)胞用細(xì)胞-脈沖室計(jì)數(shù)。[0099]流式細(xì)胞術(shù)分析:
通過低滲裂解(0.165M NH4Cl)除去脾細(xì)胞或骨髓細(xì)胞的單細(xì)胞混懸液的成熟紅細(xì)胞，并用下列配合抗體染色:抗-B220-PE，抗-1gM-FITC，抗-TCR-PE cy5，抗-CD5-PE，和抗-CD-43-FITC。所有的抗體都獲自 BD PharMingen0 在 Becton Dickinson FACSCa Iibur上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，使用Mac軟件的Becton Dickinson FACS CONVERT 1.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
組織學(xué)和免疫組織化學(xué):
從宰后檢驗(yàn)的小鼠分離脾，股骨和胸骨，并固定于10%緩沖的福爾馬林中，包埋于石蠟中，然后切成4微米的切片。切片用蘇木精/曙紅按照標(biāo)準(zhǔn)方案染色。對于脫蠟步驟，切片于55°C加熱I小時(shí)，通過分級乙醇系列和蒸餾水再水化，浸于PBS中，然后37°C用溶于Tris緩沖液中的0.1%胰蛋白酶溶液處理30分鐘。用10%正常血清阻斷內(nèi)源過氧化物酶。將CD43，B220，和VpreBl(CD179a)抗體(BD PharMingen)用作第一抗體。第二抗體和二氨基聯(lián)苯胺按照制造商的指導(dǎo)添加。
結(jié)果
相對于野生型小鼠的脾，轉(zhuǎn)基因小鼠的身體和脾都增大了(圖4A，4B)，而且轉(zhuǎn)基因小鼠的脾重量/體重比例比野生型小鼠的比例大3到4倍(表I)。有趣地，該比例沒有隨著年齡改變很多。
表1.轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠的脾和身體測量。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的方法，該方法包括將含有能指導(dǎo)在動物的B細(xì)胞中表達(dá)的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的核酸構(gòu)建體引入所述動物中，其中所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包含乂11啟動子，并且與編碼miR155基因產(chǎn)物的核酸可操作連接，該miR155基因產(chǎn)物是SEQ IDN0:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，并且其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列還包括Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子，其中所述動物是小鼠。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中所述Vh啟動子來源于小鼠。
3.權(quán)利要求
1的方法，其中所述Ig重鏈-Eu增強(qiáng)子來源于小鼠。
4.權(quán)利要求
1-3中任一項(xiàng)的方法，其中相對于適合的對照，該動物的脾、骨髓或兩者中具有擴(kuò)大的 B2201ow/CD191ow/CD101ow/IgM-/TCR-/CD43-淋巴樣細(xì)胞群體。
5.權(quán)利要求
1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述動物顯示淋巴組織增生疾病。
6.權(quán)利要求
5的方法，其中所述淋巴組織增生疾病是B細(xì)胞惡性腫瘤。
7.權(quán)利要求
6的方法，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是白血病，淋巴瘤或贅生物。
8.權(quán)利要求
5的方法，其中所述淋巴組織增生疾病是白血病前期狀況。
9.權(quán)利要求
1-3中任一項(xiàng)的方法，其中該動物顯示擴(kuò)大的B2201ow/CD191ow/CD101ow/IgM-/TCR-/CD43-淋巴樣細(xì)胞群體、增大的腹部、脾腫大、骨髓取代、淋巴細(xì)胞減少和其組合。
10.權(quán)利要求
1的方法，其中所述核酸構(gòu)建體包括P球蛋白基因的3’UTR和聚腺苷酸序列。
11.權(quán)利要求
6的方法，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤顯示人急性淋巴母細(xì)胞性白血病，人淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤或其組合的特征。
專利摘要
一種轉(zhuǎn)基因非人動物，如小鼠，具有包括一個(gè)核酸構(gòu)建體的基因組，該核酸構(gòu)建體具有能指導(dǎo)在動物的B細(xì)胞中表達(dá)的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與編碼miR155基因產(chǎn)物的核酸可操作連接。一種測試試劑在治療或預(yù)防淋巴組織增生疾病中的治療功效的方法包括評估該試劑對轉(zhuǎn)基因非人動物的影響。
文檔編號C12N15/63GKCN101472470 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200780023093
公開日2013年7月24日 申請日期2007年4月24日
發(fā)明者C·M·克勞斯 申請人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (2),