專利名稱:一種歐亞種無核葡萄高效育種方法
技術領域：
本發(fā)明涉及式一種歐亞種無核葡萄高效育種方法，屬于植物育種技術領域：
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技術背景
1、公開號CN 101238791A、名稱“一種提高無核葡萄育種效率的方法”，它是將一種植物生長抑制劑類物質矮壯素，或細胞分裂素類物質6-BA溶解配制成的藥劑，在花前10 20天噴施到花穗上，在花后40 50天摘取葡萄果粒，取出胚珠進行胚挽救，使用本發(fā)明的胚發(fā)育率無核白由0 4. 4%提高至8. 3 11. 9% ；森田尼無核由0. 5 2. 5%提高到 1. 8 21. 9% ；火焰無核由7. 1 17. 提高到14. 1 25. 4%。
2、無核葡萄的合子胚在發(fā)育過程中敗育而不能發(fā)育成正常的種子，因而常規(guī)育種只能以無核品種作父本雜交選育無核葡萄品種，但后代中無核幾率低(0 15. 9% )，育種效率低下。在親本選擇方面，不同父本胚萌發(fā)及成苗率差異顯著。在胚珠接種時期方面，由于不同品種、不同年份、不同生態(tài)條件及部位，胚珠的敗育期存在較大差異，使胚培養(yǎng)的適宜接種時期也因品種而異。在幼胚的取材時間上，采取過早，幼胚太小，難以成活；采取時間過晚，幼胚已經(jīng)夭折，也不能達到培養(yǎng)目的。

發(fā)明內容
設計目的提供一種技術操作相對簡便、成本較低、并且無核葡萄育種效率較高的一種歐亞種無核葡萄高效育種技術。
設計方案本申請使用植物生長調節(jié)劑調控植物生殖器官的生長發(fā)育進程，利用胚挽救技術，成功地克服無核葡萄做為母本進行有性雜交得不到種子的困難。通過假單性結實類型的歐亞種無核品種，在其合子胚敗育之前進行人工離體培養(yǎng)，阻止幼胚的敗育，最終形成完整的植株，是一種高效的無核葡萄育種技術。
影響無核葡萄胚發(fā)育率的原因主要有兩方面一方面是基因型的影響，不同基因型形成合子胚的能力以及胚發(fā)育的大小、數(shù)目有很大差異；另一方面是胚珠離體培養(yǎng)下的條件，包括培養(yǎng)基的種類、激素種類及濃度、接種時期、培養(yǎng)方式等等。
滿足幼胚離體培養(yǎng)的營養(yǎng)極為重要，選擇適宜的培養(yǎng)基是胚培養(yǎng)的基礎。果樹組織培養(yǎng)中應用的基本培養(yǎng)基很多，大致可以分為三種類型高鹽型(如MS培養(yǎng)基)、中鹽型 (如Nitsch+Nitsch培養(yǎng)基)和低鹽型(如White培養(yǎng)基)。不同的器官及不同的分化時期要求用不同的培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基都包括礦質營養(yǎng)和有機營養(yǎng)，使用時常添加激素。人們根據(jù)自己不同的培養(yǎng)目的和需要，進行培養(yǎng)基的選擇并加以改進。
在種子的發(fā)育過程中經(jīng)常受到激素的調節(jié)。大量實驗表明，在未成熟種子中含有各種激素。并且在不同的發(fā)育階段，有的激素產生而有的激素消失，有的濃度或存在型態(tài)發(fā)生變化。各種激素的消長變化，其功能大致有以下四個方面(1)控制果實的生長與發(fā)育； (2)控制干物質在果實中的積累；C3)控制種子本身的發(fā)育；(4)控制種子萌發(fā)與幼苗生長。 不同的無核葡萄品種對激素的敏感程度有顯著的差異，并且這種敏感程度隨胚的發(fā)育程度不同而變化，胚的發(fā)育程度越高，對激素的要求越不嚴格。由于不同品種對激素的敏感性不同而附加不同的激素。這些激素同時還能抑制和打破種子休眠，削弱和清除種皮障礙，顯著縮短胚的萌發(fā)時間，提高胚的成苗率。進行胚培養(yǎng)時認為在培養(yǎng)基中附加0. 5mg · ml—1的 GA3、IAA以及6-BA對本發(fā)明的成功起了決定性的作用。
無核葡萄胚培養(yǎng)技術，無疑使無核葡萄有性雜交組合方式更為豐富，從而大大提高了無核葡萄品種的選育效果。然而，胚培養(yǎng)無論在技術和費用要求都很高，從胚珠培養(yǎng)到出苗，需時較長，而且在此期間嚴格要求無菌操作及培養(yǎng)，這就需要很高的專業(yè)技術水平的人進行這項工作，因而在普及上受到一定的限制。
方法方案
一種歐亞種無核葡萄高效育種的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括胚挽救的胚培養(yǎng)培養(yǎng)基、胚萌發(fā)培養(yǎng)基和成苗培養(yǎng)基，其中，所述胚挽救的胚培養(yǎng)培養(yǎng)基是大量元素為:KN031900mg · Λ NH4N031650mg · Λ KH2PO4170mg · Λ MgSO4 · 7Η20 370mg · Λ CaCl2 · 2Η20 440mg · Γ1 ；微量元素為KI 0. 83mg · Λ Η3Β036 · 2mg · Λ MnSO4 · 4Η20 22. 3mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 8. 6mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 0. 25mg · Λ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；鐵鹽為=Na2 · EDTA37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η2027· 8mg · Γ1 ；有機物為肌醇IOOmg · ΙΛ甘氨酸2mg · L—1，鹽酸硫胺素VB10. Img · L-1，鹽酸吡哆醇VB60. 5mg · L-1， 煙酸0. 5mg · L-1 ；附加植物生長調節(jié)劑=GA3O. 5mg · L—1，吲哚乙酸IAA 1. Omg · L-U-芐氨基腺嘌呤 6-ΒΑ 0. 5mg · L—1，蔗糖 30g · L-1，瓊脂 5g · L—1，pH = 5. 8 ；
所述胚萌發(fā)培養(yǎng)基是大量元素為KN039 50mg · L—1，NH4N03825mg · L—1， KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7H20 185mg · Λ CaCl2 · 2H20 220mg · L—1 ；微量元素為: KI 0. 83mg ·廠1，H3B036. 2mg ·廠1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg ·廠1，ZnSO4 · 7H20 8. 6mg ·廠1， Na2MoO4 · 2H200. 25mg · Λ CuSO4 · 5H20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6H20 0. 025mg · L-1 ；鐵鹽為=Na2 · EDTA37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有機物為肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸 2mg · L—1，鹽酸硫胺素VB10. Img · L—1，鹽酸吡哆醇VB60. 5mg · L-1，煙酸0. 5mg · L-1，附加植物生長調節(jié)劑α -萘乙酸NAA 0. 4mg · L-1，吲哚乙酸IAA 0. 4mg · L-1，6-芐氨基腺嘌呤6-BA 0. 6mg · ΙΛ 蔗糖 30g · ΙΛ 瓊脂 5g · L-1，pH = 5. 8 ；
所述成苗培養(yǎng)基是大量元素為KN039 50mg · Γ1, NH4N03825mg · Γ1, KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7Η20 185mg · Λ CaCl2 · 2Η20 220mg · L—1 ；微量元素為: ΚΙΟ. 83mg · I/1，Η3ΒΟ36. 2mg · I/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg · I/1，ZnSO4 · 7H20 8. 6mg · I/1， Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg · Λ CuSO4 · H2O 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6H20 0. 025mg · L-1 ；鐵鹽為=Na2 · EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有機物為肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸 2mg · L—1，鹽酸硫胺素VB10. Img · L-1，鹽酸吡哆醇VB60. 5mg · L—1，煙酸0. 5mg · L-1，附加植物生長調節(jié)劑吲哚丁酸 IBA 0. 2mg · ΙΛ 蔗糖 30g · L-1，瓊脂 5g · L—1，pH = 5. 8。
一種歐亞種無核葡萄高效育種方法，(1)花期常規(guī)授粉受精，花后30 50天摘取幼果，自來水下流水沖洗lhr，超凈工作臺上，將幼果用70%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3 次；再用0. 09 0. 11%升汞浸泡8 12min，然后無菌水漂洗4 5次；(2)在無菌條件下切開果粒從漿果中取出胚珠，接種在含有不同水平植物生長調節(jié)劑赤霉素酸(GA!3)、吲哚乙酸(IAA)、6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)的胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行胚挽救；(3)胚挽救的條件將接種好的三角瓶，置于5 8°C培養(yǎng)箱中低溫處理60d，再轉入培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d，經(jīng)胚挽救發(fā)育的胚體積增大至2 5倍；(4)無菌條件下將胚珠橫切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的發(fā)育胚，并轉接入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，兩周內即可萌發(fā)，萌發(fā)后的幼苗立即轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，就得到完整的無核葡萄胚挽救試管苗，將其試管苗用成苗培養(yǎng)基分別進行繼代擴繁至一定數(shù)量，得到不同株系的雜交苗，每月更換一次新鮮培養(yǎng)基；( 試管苗長出4 5 片葉，將至三角瓶瓶口時，即可煉苗移栽，成活后定植到大田。
本發(fā)明與背景技術相比，一是操作簡單，成本降低，顯著提高了無核葡萄胚挽救的幼胚發(fā)育率、萌發(fā)率以及成苗率，能得到更多的雜交后代；二是以無核葡萄品種做母本，后代無核性狀出現(xiàn)的比率大幅度增高，大大增加了無核葡萄雜交育種的親本選擇范圍，增加親本選配的成功率，加速無核葡萄新品種的選育進程，是一種高效無核葡萄育種技術；三是對6個歐亞種無核葡萄品種進行胚培養(yǎng)時試驗了不同培養(yǎng)基和激素的配方，在胚培養(yǎng)、胚萌發(fā)以及成苗培養(yǎng)基都使用MS培養(yǎng)基，效果最好，而且母液配制與儲存方便，節(jié)約藥品與材料；三是不需要花前10 20d用50 500mg · ml—1的矮壯素或者10 IOOmg · ml—1的 6-BA溶液處理，既節(jié)約了價格昂貴的外源激素類藥品的使用，減少用工成本，同時避免了外源激素對葡萄植株以及果品質量的影響，減小污染，尤其避免對人類健康的潛在或者不明影響。
具體實施方式
實施例1 一種歐亞種無核葡萄高效育種技術，具體包括下列步驟(1)花期常規(guī)授粉受精，花后30 50天摘取幼果，自來水下流水沖洗Ihr，超凈工作臺上，將幼果用70% 酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后無菌水漂洗4 5次， (2)在無菌條件下切開果粒從漿果中取出胚珠，接種在含有不同水平植物生長調節(jié)劑赤霉素酸(GA3)、噴哚乙酸(IAA)、6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)的胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行胚挽救。⑶ 胚挽救的條件將接種好的三角瓶，置于5 8°C培養(yǎng)箱中低溫處理60d，再轉入培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d。經(jīng)胚挽救發(fā)育的胚體積增大至2 5倍。(4)無菌條件下將胚珠橫切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的發(fā)育胚，并轉接入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，兩周內即可萌發(fā)。萌發(fā)后的幼苗立即轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，就得到完整的無核葡萄胚挽救試管苗。將其試管苗用成苗培養(yǎng)基分別進行繼代擴繁至一定數(shù)量，得到不同株系的雜交苗。每月更換一次新鮮培養(yǎng)基。 (5)試管苗長出4 5片葉，將至三角瓶瓶口時，即可煉苗移栽，成活后定植到大田。
所述胚挽救培養(yǎng)基是大量元素為KN031900mg · Λ NH4N031650mg · Λ KH2PO4170mg · Λ MgSO4 · 7Η20 370mg · Λ CaCl2 · 2Η20 440mg · Γ1 ；微量元素為KI 0. 83mg · ΛΗ3Β036 · 2mg ·L-1 ,MnSO4 ·4Η20 22. 3mg ·L^ZnSO4 ·7Η20 8. 6mg Γ1,Na2MoO4 ·2Η20 0. 25mg · ΙΛ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；鐵鹽為=Na2 · EDTA 37. 3mg · Γ1，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有機物為肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸 2mg · Λ 鹽酸硫胺素(Vbi)O. Img · L-1，鹽酸吡哆醇(VB6)0. 5mg · L—1，煙酸(VB5 或 VPP)0. 5mg · L-1。附加植物生長調節(jié)劑赤霉素酸(GA3)O. 5mg · ΙΛ吲哚乙酸(IAA) 1. Omg · L-U-芐氨基腺嘌呤 (6-BA) 0. 5mg · L-1，蔗糖 30g · Λ 瓊脂 5g · Λ pH = 5· 8。
所述胚萌發(fā)培養(yǎng)基是大量元素為KN039 50mg · L—1，NH4N03825mg · L—1， KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7H20 185mmg · Λ CaCl2 · 2H20 220mg · L—1 ；微量元素為: KIO. 83mg · I/1，H3BO36. 2mg · I/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg · I/1，ZnSO4 · 7H20 8. 6mg · I/1，Na2MoO4 · 2Η20 0. 25mg · Λ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；鐵鹽為=Na2 · EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有機物為:肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸ang · ΙΛ鹽酸硫胺素(Vbi) 0. Img · ΙΛ鹽酸吡哆醇(Vb6) 0. 5mg · Λ煙酸(VB5 或VPP)0. 5mg · L—1。附加植物生長調節(jié)劑α -萘乙酸(NAA)O. 4mg · L—1，吲哚乙酸 (IAA)O. 4mg ·ΙΛ6-芐氨基腺嘌呤(6_ΒΑ)0· 6mg · Λ 蔗糖 30g · Λ 瓊脂 5g · ΛρΗ = 5· 8。
所述成苗培養(yǎng)基是大量元素為KN039 50mg · Γ1, NH4N03825mg · Γ1, KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7Η20 185mg · Λ CaCl2 · 2Η20 220mg · L—1 ；微量元素為: ΚΙΟ. 83mg · I/1，Η3ΒΟ36. 2mg · I/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg · I/1，ZnSO4 · 7H20 8. 6mg · I/1， Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg · Λ CuSO4 · 5H20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6H20 0. 025mg · L-1 ；鐵鹽為=Na2 · EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有機物為:肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸ang · L-1，鹽酸硫胺素(Vm)O. Img · L-1，鹽酸吡哆醇(VB6)0. 5mg · Λ煙酸(VB5或 VPP)0. 5mg · L-1。附加植物生長調節(jié)劑吲哚丁酸(IBA)O. 2mg · L-1，蔗糖30g · L-1，瓊脂 5g · Λ ρΗ = 5. 8。
所述的歐亞種無核葡萄品種是無核白葡萄、優(yōu)無核葡萄(超級無核、黃提)、奇妙無核葡萄(黑美人)、紅寶石無核(魯貝)葡萄、克瑞森無核(緋紅無核、淑女紅)葡萄、皇家秋天(無核皇后)葡萄。
所述的6-ΒΑ溶液時按照下列技術配制先配制0.5mg .11111-84母液。稱取 50mg6-BA，用2ml稀鹽酸或95%乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀， 定容至100ml，即為0. 5mg · HiF1B-BA母液，4°C冷藏保存。配制IL胚挽救培養(yǎng)基時，用移液管或移液槍量取Iml母液即可；配制IL胚萌發(fā)培養(yǎng)基時，用移液管或移液槍量取1. 2ml母液即可.
所述的GA3溶液時按照下列技術配制先配制0. 5mg -Hir1GA3母液。稱取50mgGA3， 用2ml稀鹽酸或95 %乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀，定容至 100ml,即為0. Smg-Hir1GA3母液，4°C冷藏保存。配制IL胚挽救培養(yǎng)基時，用移液管或移液槍量取Iml母液即可。
所述的IAA溶液時按照下列技術配制先配制0. 5mg ^r1IAA母液。稱取50mgIAA， 用2ml稀鹽酸或95 %乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀，定容至 100ml,即為0. 5mg -ml^IAA母液，4°C冷藏保存。配制IL胚挽救培養(yǎng)基時，用移液管或移液槍量取2ml母液即可；配制IL胚萌發(fā)培養(yǎng)基時，用移液管或移液槍量取800 μ 1母液即可。
所述的NAA溶液時按照下列技術配制先配制0. 5mg ^r1NAA母液。稱取50mgNAA， 用2ml稀鹽酸或95 %乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀，定容至 100ml,即為0. 5mg -ml^NAA母液，4°C冷藏保存。配制IL胚萌發(fā)培養(yǎng)基時，用移液管或移液槍量取800 μ 1 NAA母液即可。
所述的IBA溶液時按照下列技術配制先配制0. 5mg .mPlBA母液。稱取50mgIBA， 用2ml稀鹽酸或95 %乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀，定容至 100ml,即為0. 5mg · ml^IBA母液，4°C冷藏保存。配制IL成苗培養(yǎng)基時，用移液槍量取 400 μ 1 IBA母液即可。
所述的胚珠在MS培養(yǎng)基中低溫處理的條件為溫度5 8°C，時間為60d，空氣濕度為60%左右，暗培養(yǎng)。[0027]所述的發(fā)育胚在萌發(fā)培養(yǎng)基中以及幼苗在成苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度 25士 1°C，濕度50% 60%，光強2000 3000Lx，光照/黑暗為16h/8h。
根據(jù)無核葡萄胚發(fā)育特點以及無核葡萄離體培養(yǎng)下的有關激素、培養(yǎng)方式、接種時期、成苗途徑等多方面內容，采用MS固體或液體培養(yǎng)基附加不同激素配比，于花后30 50d接種，使無核葡萄品種胚發(fā)育率平均達到84 %，胚萌發(fā)率占發(fā)育胚的60 % 92 %，成苗率占萌發(fā)胚的50 % 98 %，從而使無核葡萄胚培養(yǎng)技術更接近于實用化。
例1 無核白葡萄進入始花期前三天去雄套袋。選擇氣溫在20 30°C，無風的晴朗早晨(6:00 7:00開始)。去雄時用尖頭小鑷子將花冠及雄蕊一起除去。既要將雄蕊除凈，又要避免碰傷柱頭。為防止去雄時花粉落到柱頭上造成自交，每次去雄后都用清水沖洗柱頭，干后立即套袋。每穗100粒以上。每個品種去雄100穗。每個品種至少要選20株生長健壯的植株做母本。雜交后用常規(guī)技術管理。
花后30 50天摘取幼果，自來水下流水沖洗lhr，超凈工作臺上無菌條件下，將幼果用70%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后無菌水漂洗 4 5次。
在無菌條件下切開果粒從漿果中取出胚珠，接種胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行胚挽救。
將接種好的三角瓶，置于5 8°C培養(yǎng)箱中低溫處理60d，空氣濕度為60%左右，暗培養(yǎng)。
再轉入培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d，溫度25 士 1°C，濕度50% 60%，光強2000 3000Lx， 光照/黑暗為16h/ !。。經(jīng)胚挽救發(fā)育的胚體積增大至2 5倍。
無菌條件下將胚珠橫切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的發(fā)育胚，并轉接入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，兩周內即可萌發(fā)。萌發(fā)后的幼苗立即轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，就得到完整的無核葡萄胚挽救試管苗。將其試管苗用成苗培養(yǎng)基分別進行繼代擴繁至一定數(shù)量，得到不同株系的雜交苗。每月更換一次新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，濕度50% 60%，光照強度2000 3000Lx，光照/黑暗為16h/8h。
試管苗長出4 5片葉，將至三角瓶瓶口時，即可煉苗移栽，成活后定植到大田。
例2 優(yōu)無核葡萄(超級無核、黃提)進入始花期前三天去雄套袋。選擇氣溫在 20 30°C，無風的晴朗早晨(6:00 7:00開始)。去雄時用尖頭小鑷子將花冠及雄蕊一起除去。既要將雄蕊除凈，又要避免碰傷柱頭。為防止去雄時花粉落到柱頭上造成自交，每次去雄后都用清水沖洗柱頭，干后立即套袋。每穗100粒以上。每個品種去雄100穗。每個品種至少要選20株生長健壯的植株做母本。雜交后用常規(guī)技術管理。
花后30 50天摘取幼果，自來水下流水沖洗lhr，超凈工作臺上無菌條件下，將幼果用70%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后無菌水漂洗 4 5次，
在無菌條件下切開果粒從漿果中取出胚珠，接種胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行胚挽救。
將接種好的三角瓶，置于5 8°C培養(yǎng)箱中低溫處理60d，空氣濕度為60%左右，暗培養(yǎng)。
再轉入培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d，溫度25 士 1°C，濕度50% 60%，光強2000 3000Lx， 光照/黑暗為16h/ !。。經(jīng)胚挽救發(fā)育的胚體積增大至2 5倍。
無菌條件下將胚珠橫切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的發(fā)育胚，并轉接入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，兩周內即可萌發(fā)。萌發(fā)后的幼苗立即轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，就得到完整的無核葡萄胚挽救試管苗。將其試管苗用成苗培養(yǎng)基分別進行繼代擴繁至一定數(shù)量，得到不同株系的雜交苗。每月更換一次新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，濕度50% 60%，光強2000 3000Lx，光照/黑暗為16h/8h。
試管苗長出4 5片葉，將至三角瓶瓶口時，即可煉苗移栽，成活后定植到大田
例3 奇妙無核葡萄(黑美人)進入始花期前三天去雄套袋。選擇氣溫在20 30°C，無風的晴朗早晨(6:00 7:00開始)。去雄時用尖頭小鑷子將花冠及雄蕊一起除去。 既要將雄蕊除凈，又要避免碰傷柱頭。為防止去雄時花粉落到柱頭上造成自交，每次去雄后都用清水沖洗柱頭，干后立即套袋。每穗100粒以上。每個品種去雄100穗。每個品種至少要選20株生長健壯的植株做母本。雜交后用常規(guī)技術管理。
花后30 50天摘取幼果，自來水下流水沖洗lhr，超凈工作臺上無菌條件下，將幼果用70%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后無菌水漂洗 4 5次。
在無菌條件下切開果粒從漿果中取出胚珠，接種胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行胚挽救。
將接種好的三角瓶，置于5 8°C培養(yǎng)箱中低溫處理60d，空氣濕度為60%左右，暗培養(yǎng)。
再轉入培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d，溫度25 士 1°C，濕度50% 60%，光強2000 3000Lx， 光照/黑暗為16h/ !。。經(jīng)胚挽救發(fā)育的胚體積增大至2 5倍。
無菌條件下將胚珠橫切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的發(fā)育胚，并轉接入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，兩周內即可萌發(fā)。萌發(fā)后的幼苗立即轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，就得到完整的無核葡萄胚挽救試管苗。將其試管苗用成苗培養(yǎng)基分別進行繼代擴繁至一定數(shù)量，得到不同株系的雜交苗。每月更換一次新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，濕度50% 60%，光照強度2000 3000Lx，光照/黑暗為16h/8h。
試管苗長出4 5片葉，將至三角瓶瓶口時，即可煉苗移栽，成活后定植到大田
例4 克瑞森無核(緋紅無核、淑女紅)葡萄進入始花期前三天去雄套袋。選擇氣溫在20 30°C，無風的晴朗早晨(6:00 7:00開始)。去雄時用尖頭小鑷子將花冠及雄蕊一起除去。既要將雄蕊除凈，又要避免碰傷柱頭。為防止去雄時花粉落到柱頭上造成自交，每次去雄后都用清水沖洗柱頭，干后立即套袋。每穗100粒以上。每個品種去雄100穗。 每個品種至少要選20株生長健壯的植株做母本。雜交后用常規(guī)技術管理。
花后30 50天摘取幼果，自來水下流水沖洗lhr，超凈工作臺上無菌條件下，將幼果用70%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后無菌水漂洗 4 5次。
在無菌條件下切開果粒從漿果中取出胚珠，接種胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行胚挽救。
將接種好的三角瓶，置于5 8°C培養(yǎng)箱中低溫處理60d，空氣濕度為60%左右，暗培養(yǎng)。
再轉入培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d，溫度25 士 1°C，濕度50% 60%，光強2000 3000Lx， 光照/黑暗為16h/ !。。經(jīng)胚挽救發(fā)育的胚體積增大至2 5倍。
無菌條件下將胚珠橫切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的發(fā)育胚，并轉接入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，兩周內即可萌發(fā)。萌發(fā)后的幼苗立即轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，就得到完整的無核葡萄胚挽救試管苗。將其試管苗用成苗培養(yǎng)基分別進行繼代擴繁至一定數(shù)量，得到不同株系的雜交苗。每月更換一次新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，濕度50% 60%，光照強度2000 3000Lx，光照/黑暗為16h/8h。
試 管苗長出4 5片葉，將至三角瓶瓶口時，即可煉苗移栽，成活后定植到大田
例5 紅寶石無核(魯貝)葡萄進入始花期前三天去雄套袋。選擇氣溫在20 30°C，無風的晴朗早晨(6:00 7:00開始)。去雄時用尖頭小鑷子將花冠及雄蕊一起除去。 既要將雄蕊除凈，又要避免碰傷柱頭。為防止去雄時花粉落到柱頭上造成自交，每次去雄后都用清水沖洗柱頭，干后立即套袋。每穗100粒以上。每個品種去雄100穗。每個品種至少要選20株生長健壯的植株做母本。雜交后用常規(guī)技術管理。
花后30 50天摘取幼果，自來水下流水沖洗lhr，超凈工作臺上無菌條件下，將幼果用70%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后無菌水漂洗 4 5次，
在無菌條件下切開果粒從漿果中取出胚珠，接種胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行胚挽救。將接種好的三角瓶，置于5 8°C培養(yǎng)箱中低溫處理60d，空氣濕度為60%左右，暗培養(yǎng)。
再轉入培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d，溫度25 士 1°C，濕度50% 60%，光強2000 3000Lx， 光照/黑暗為16h/8h。。經(jīng)胚挽救發(fā)育的胚體積增大至2 5倍。
無菌條件下將胚珠橫切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的發(fā)育胚，并轉接入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，兩周內即可萌發(fā)。萌發(fā)后的幼苗立即轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，就得到完整的無核葡萄胚挽救試管苗。將其試管苗用成苗培養(yǎng)基分別進行繼代擴繁至一定數(shù)量，得到不同株系的雜交苗。每月更換一次新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，濕度50% 60%，光照強度2000 3000Lx，光照/黑暗為16h/8h。
試管苗長出4 5片葉，將至三角瓶瓶口時，即可煉苗移栽，成活后定植到大田
例6 皇家秋天(無核皇后)葡萄進入始花期前三天去雄套袋。選擇氣溫在20 30°C，無風的晴朗早晨(6:00 7:00開始)。去雄時用尖頭小鑷子將花冠及雄蕊一起除去。 既要將雄蕊除凈，又要避免碰傷柱頭。為防止去雄時花粉落到柱頭上造成自交，每次去雄后都用清水沖洗柱頭，干后立即套袋。每穗100粒以上。每個品種去雄100穗。每個品種至少要選20株生長健壯的植株做母本。雜交后用常規(guī)技術管理。
花后30 50天摘取幼果，自來水下流水沖洗lhr，超凈工作臺上無菌條件下，將幼果用70%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后無菌水漂洗 4 5次。
在無菌條件下切開果粒從漿果中取出胚珠，接種胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行胚挽救。
將接種好的三角瓶，置于5 8°C培養(yǎng)箱中低溫處理60d，空氣濕度為60%左右，暗培養(yǎng)。
再轉入培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d，溫度25 士 1°C，濕度50% 60%，光強2000 3000Lx， 光照/黑暗為16h/8h。。經(jīng)胚挽救發(fā)育的胚體積增大至2 5倍。
無菌條件下將胚珠橫切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的發(fā)育胚，并轉接入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，兩周內即可萌發(fā)。萌發(fā)后的幼苗立即轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，就得到完整的無核葡萄胚挽救試管苗。將其試管苗用成苗培養(yǎng)基分別進行繼代擴繁至一定數(shù)量，得到不同株系的雜交苗。每月更換一次新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，濕度50% 60%，光照強度2000 3000Lx，光照/黑暗為16h/8h。
試管苗長出4 5片葉，將至三角瓶瓶口時，即可煉苗移栽，成活后定植到大田以下是采用本發(fā)明的方法取得的結果，以進一步說明本發(fā)明在無核葡萄育種上的高效性。
權利要求
1.一種歐亞種無核葡萄高效育種的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括胚挽救的胚培養(yǎng)培養(yǎng)基、胚萌發(fā)培養(yǎng)基和成苗培養(yǎng)基，其中，所述胚挽救的胚培養(yǎng)培養(yǎng)基是大量元素為:KN031900mg .I71，NH4N031650mg · Γ1，KH2PO4170mg 'T1jMgSO4 ‘ 7H20370mg 'U1jCaCl2 ·2Η20 440mg · L—1 ；微量元素為:KI0. 83mg · Λ Η3Β036· 2mg · Λ MnSO4 · 4Η20 22. 3mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 8. 6mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 0. 25mg · Λ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；鐵鹽為=Na2 · EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η2027· 8mg · Γ1 ；有機物為肌醇 IOOmg · ΙΛ甘氨酸2mg · L-1，鹽酸硫胺素VB10. Img · L-1，鹽酸吡哆醇VB60. 5mg · Λ煙酸 0. 5mg · L-1 ；附加植物生長調節(jié)劑=GA3O. 5mg · Λ吲哚乙酸IAA 1. Omg · L-U-芐氨基腺嘌呤 6-ΒΑ 0. 5mg · L-1，蔗糖 30g · Λ 瓊脂 5g · Λ pH = 5· 8 ；所述胚萌發(fā)培養(yǎng)基是大量元素為KN039 50mg · Λ NH4N038 2 5mg · Λ KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7Η20 185mg · Λ CaCl2 · 2Η20 220mg · Γ1 ；微量元素為KI 0. 83mg · Λ Η3Β036· 2mg · L-1 ,MnSO4 ·4Η20 22. 3mg · L^ZnSO4 ·7Η20 8. 6mg 'T1jNa2MoO4 ·2Η200· 25mg · Λ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；鐵鹽為=Na2 · EDTA37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · L—1 ；有機物為肌醇IOOmg · L—1，甘氨酸2mg · L—1，鹽酸硫胺素 VB10. Img · ΙΛ鹽酸吡哆醇VB60. 5mg · Λ煙酸0. 5mg · L-1，附加植物生長調節(jié)劑α -萘乙酸 NAA 0. 4mg · Γ1，吲哚乙酸 ΙΑ40. 4mg · Γ1，6-芐氨基腺嘌呤 6-BA 0. 6mg · Γ1，蔗糖 30g · Γ1, 瓊脂 5g · L—1，pH = 5. 8 ；所述成苗培養(yǎng)基是大量元素為KN039 50mg · Λ NH4N038 2 5mg · Λ KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7Η20 185mg · Λ CaCl2 · 2Η20 220mg · Γ1 ；微量元素為KI 0. 83mg · Λ H3B036. 2mg · I/1，MnSO4 · 4Η20 22. 3mg · I/1，ZnSO4 · 7Η20 8. 6mg · I/1，Na2MoO4 · 2Η20 0. 25mg · ΙΛ CuSO4 · H2O 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；鐵鹽為=Na2 · EDTA 37. 3mg · Γ1，F(xiàn)eSO4 · 7H20 27. 8mg · Γ1 ；有機物為肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸 2mg · Λ 鹽酸硫胺素VB10. Img · ΙΛ鹽酸吡哆醇VB60. 5mg · Λ煙酸0. 5mg · L-1，附加植物生長調節(jié)劑口引哚丁酸 IBA 0. 2mg · ΙΛ 蔗糖 30g · L-1，瓊脂 5g · L—1，pH = 5. 8。
2.一種使用權利要求
1的培養(yǎng)基進行歐亞種無核葡萄高效育種的方法，其特征是(1)花期常規(guī)授粉受精，花后30 50天摘取幼果，自來水下流水沖洗lhr，超凈工作臺上，將幼果用70%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次；再用0. 09 0. 11%升汞浸泡8 12min,然后無菌水漂洗4 5次；(2)在無菌條件下切開果粒從漿果中取出胚珠，接種在胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行胚挽救；(3)胚挽救的條件將接種好的三角瓶，置于5 8°C培養(yǎng)箱中低溫處理60d，再轉入培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d，經(jīng)胚挽救發(fā)育的胚體積增大至2 5倍；(4)無菌條件下將胚珠橫切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的發(fā)育胚，并轉接入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，兩周內萌發(fā)，萌發(fā)后的幼苗立即轉入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，就得到完整的無核葡萄胚挽救試管苗，將試管苗用成苗培養(yǎng)基分別進行繼代擴繁，得到不同株系的雜交苗，每月更換一次新鮮培養(yǎng)基；(5)試管苗長出4 5片葉，將至三角瓶瓶口時，煉苗移栽，成活后定植到大田。
3.根據(jù)權利要求
2所述的歐亞種無核葡萄高效育種方法，其特征是所述的6-BA溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg · πιΓ^-ΒΑ母液，稱取50mg 6-BA,用2ml稀鹽酸或95 %乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀，定容至100ml，即為(0. 5mg · mH-BA母液，4°C冷藏保存。
4.根據(jù)權利要求
2所述的歐亞種無核葡萄高效育種方法，其特征是所述的GA3溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg · Hir1GA3母液，稱取50mg GA3，用2ml稀鹽酸或95%乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀，定容至100ml，即為0. 5mg ^r1GA3母液，4°C冷藏保存。
5.根據(jù)權利要求
2所述的歐亞種無核葡萄高效育種方法，其特征是所述的IAA溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg -Iiir1IAA母液，稱取50mg IAA，用2ml稀鹽酸或95%乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀，定容至100ml，即為0. 5mg -ml^IAA 母液，4°C冷藏保存。
6.根據(jù)權利要求
2所述的歐亞種無核葡萄高效育種方法，其特征是所述的NAA溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg -Iiir1NAA母液，稱取50mg NAA,用2ml稀鹽酸或95%乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀，定容至100ml，即為0. 5mg -ml^NAA 母液，4°C冷藏保存。
7.根據(jù)權利要求
2所述的歐亞種無核葡萄高效育種方法，其特征是所述的IBA溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg -Iiir1IBA母液，稱取50mg IBA，用2ml稀鹽酸或95%乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以免產生沉淀，定容至100ml，即為0. 5mg -ml^IBA 母液，4°C冷藏保存。
8.根據(jù)權利要求
2所述的歐亞種無核葡萄高效育種方法，其特征是所述的胚珠在培養(yǎng)基中低溫處理的條件為溫度5 8°C，時間為60d，空氣濕度為55 65%，暗培養(yǎng)；所述的發(fā)育胚在萌發(fā)培養(yǎng)基中以及幼苗在成苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，濕度 50% 60%，光強2000 3000Lx，光照/黑暗為16h/8h。
專利摘要
本發(fā)明涉及式一種歐亞種無核葡萄高效育種方法，它是在無核葡萄在開花后30～50d，摘取葡萄幼果，在無菌條件下取出胚珠，胚接種在含有不同水平植物生長調節(jié)劑赤霉素酸(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)的MS培養(yǎng)基上進行胚挽救。使用本發(fā)明的平均胚發(fā)育率由背景方法公布的專利的8.3～11.9％提高到84％，萌發(fā)率達到75.33％，成苗率達到74.17％，并且本申請得到的無核葡萄的胚挽救方法通過提高無核葡萄的胚發(fā)育率與萌發(fā)率，增加后代的成苗率，能夠較容易得到更多的雜交后代，增大無核葡萄雜交育種的親本選擇范圍，加速無核葡萄新品種育種進程，提高無核葡萄育種效率。
文檔編號C12N5/04GKCN101564011 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200910136797
公開日2011年12月14日 申請日期2009年5月18日
發(fā)明者劉海琳 申請人:杭州藍天園林建設集團有限公司余杭分公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan